HLA分型法 【技术领域】
本发明涉及用于医疗诊断的HLA分型技术。
背景技术
HLA(human leukocyte antigen；人白血球抗原)是人的MHC(majorhistocompatibility complex；主要组织相容性复合体)，存在于整个细胞表面。HLA分子，个体间类型不同，能够与其结合的抗原肽的差异表现为免疫应答的个体差异。因此，确定存在于编码HLA分子的HLA区域的基因的类型(HLA分型技术)可用于判定器官移植时供体和受体者的相容性以及个体对某种疾病的的素质等，是非常重要的技术。
HLA分型中存在着血清学分型和DNA分型。以往，作为HLA分型一直进行血清学分型。在血清学HLA分型中，通过HLA单克隆抗体与淋巴细胞的抗原抗体反应对HLA进行鉴定。然而这种方法存在着解析精度低，以及可判定的HLA类型有限的缺点。
而DNA分型是对编码HLA的第6号染色体上地基因直接进行分型(RFLP法等)的技术。例如如果根据特表2002-503497号公报报道，为了进行DNA分型，事先从生物体材料分离、纯化DNA，以该DNA为模板，使用基因位点特异的引物，进行聚合酶链反应(PCR)等，做成测序反应模板。
在以往的方法中存在着生物体样品保管时的保存性问题以及生物体样品运输时简便性问题。尤其是当生物体样品是血液材料时，由于存在着病原微生物等感染的可能性，存在着对在检查等对血液样品进行处理时的人的危险，安全性上也有问题。另外，血液样品等液体样品存在着样品间交叉感染等、样品自身污染可能性的问题。另外，从生物体样品分离、纯化DNA时，也存在着花费人力和经费的问题。近年来，DNA的分离、纯化由于利用各种各样的试剂盒而被简化，即使那样也需要多阶段的操作。因此，在进行多个检体解析时，不仅存在着样品的安全性低下，而且也存在着解析时花费增加的问题。
【发明内容】
本发明的目的在于提供样品的保存以及运输简便而且安全性高、解析花费少、解析精度以及处理效率高的HLA分型技术。
本发明人等进行了努力研究，结果发现通过从生物样品直接进行DNA扩增反应，确定扩增的DNA的碱基序列，利用确定的碱基序列的信息进行HLA分型，可以达到上述目的，直至完成本发明。
本发明包括以下内容。
(1)一种HLA分型法，从生物样品直接进行DNA扩增反应，确定上述血液样品中含有的DNA的碱基序列，利用确定的所述碱基序列确定HLA分型。
(2)根据(1)所述的HLA分型法，上述DNA扩增反应是聚合酶链反应。
(3)根据(1)或(2)所述的HLA分型法，上述生物体样品是血液样品或口腔粘膜样品。
(4)根据(3)所述的HLA分型法，上述血液样品是全血。
(5)根据(3)或(4)所述的HLA分型法，上述血液样品是干燥血液。
(6)根据(3)～(5)中任一项所述的HLA分型法，上述血液样品是使滤纸含有血液后干燥的滤纸血。
根据本发明可提供样品的保存以及运输简便而且安全性高、解析花费少、解析精度以及处理效率高的HLA分型技术。另外，根据本发明通过在直接PCR中选择适当的缓冲液，可以进行全基因位点的HLA分型。
【附图说明】
图1是表示从滤纸血直接进行PCR的结果的电泳图。
图2是表示从口腔粘膜直接进行PCR的结果的电泳图。
【具体实施方式】
本发明是以从生物体样品直接进行DNA扩增反应为特征的HLA分型法。在本发明中所谓直接指的是在进行DNA扩增之前不需要对样品中含有的DNA进行分离、纯化的过程。在本发明的HLA分型法中从生物样品直接进行DNA扩增反应，由扩增的DNA碱基序列确定上述血液样品中含有的DNA的碱基序列，利用确定的碱基序列决定HLA的类型。而HLA分型通常进行有关A、B、DR的各个基因位点的确定。
本发明中，作为用于进行HLA分型的生物体样品没有特别限定。例如血液样品或口腔粘膜样品等，由于样品採集简便，所以是优选的。
作为血液样品，可以使用全血。也可以使用进行了DNA纯化的样品或用EDTA等处理的样品。作为样品的形态，只要有DNA残存，无论是新鲜血、还是保存血以及干燥血都可以。作为保存血液无论冷藏保存、还是冷冻保存都可以。在本发明中，即使是频繁反复冻融的冷冻血液也可以稳定地得到核酸扩增产物。作为干燥血液，可以使用使滤纸含有血液后干燥的滤纸血。在本发明中使用滤纸血从样品的保存性和运输时的简便性以及安全性的观点看，是优选的。通过使滤纸含有血液样品，由于样品不是液体状态，因此使样品洒掉、或飞散的危险性减小。因此，样品的安全性高，污染的可能性减小。
在本发明中对存在于上述血液样品中的DNA不进行分离和纯化而直接进行DNA扩增反应。在本发明中，通过在扩增反应中的反应溶液中使用下面叙述的溶液，不进行样品的前处理可以直接进行DNA扩增反应。这样一来可以节省前处理的人力和花费。例如，当使用滤纸血时，使滤纸含有少量的血液后，进行干燥，可以取出粘着血液部分的一部分直接用于扩增反应。
在DNA扩增中，可以利用PCR。PCR中使用PCR反应溶液含有缓冲液、引物试剂盒、各种dNTP(脱氧核苷三磷酸)、以及DNA聚合酶。
在不进行分离、纯化等前处理的样品中含有阻碍DNA扩增反应的物质。所谓阻碍DNA扩增反应的物质是存在于生物体液中的正电荷物质(某种蛋白质等)或负电荷物质(某种糖、色素等)等。蛋白质等正电荷物质通过吸附于DNA而阻碍扩增反应。另外，糖、色素等负电荷物质通过吸附于DNA聚合酶而阻碍扩增反应。在本发明中，使用具有抑制阻碍DNA扩增反应物质的作用的溶液作为缓冲液。
作为这样的缓冲液，如可以举出AmpdirectR-A、AmpdirectR-G/C(都是(株)岛津制作所制造)。另外根据需要，为了提高扩增效率，也可以将在AmpdirectR-A或AmpdirectR-G/C中加入了Amp Addition-1或AmpAddition-4(都是(株)岛津制作所制造)的溶液用作缓冲液。在本发明中优选使用AmpdirectR-G/C。另外，更有优选在AmpdirectR-G/C中加入了Amp Addition-4后使用。AmpdirectR-A或AmpdirectR-G/C由于对存在于上述DNA扩增反应溶液中的上述阻碍物质具有中和的作用，所以即使是未纯化的样品也可以进行PCR。这样一来，就可以从生物体样品直接进行核酸扩增。此外，作为具有上述作用的缓冲液，如可以举出AmpdirectR-B、AmpdirectR-D，作为根据需要使缓冲液中含有的AmpAddition，如可以举出Amp Addition-2、Amp Addition-3。
在本发明中，并不限定于上述缓冲液，可以根据分型的基因位点适当选择具有合适组成的缓冲液。
作为引物，使用对HLA区域特异的扩增引物试剂盒。作为DNA聚合酶优选TaqDNA，更优选TaKaRaZ-TaqTM、ExTaq(都是宝酒造(株)制造)。
本发明的PCR反应溶液的上述成分可以使用例如下面那样的配比量(以PCR反应溶液的总体积为基准)。即，缓冲液10～40体积％，例如20体积％，各个引物为0.1～2μM，例如0.5μM，各个dNTP为100～300μM，例如200μM，DNA聚合酶为0.5～1.25U/μl，例如1.25U/μl。另外，使用在AmpdirectR-A和AmpdirectR-G/C等中加入了Amp Addition后的溶液作为缓冲液时，Amp Addition的量的上限没有特别限定，例如相对于AmpdirectR-A和AmpdirectR-G/C等的量可以加到150体积％程度，例如可以使用100体积％。例如作为样品的血液可以用0.5μl～2μl，对于1μl血液样品可以使用10～200μl的上述PCR反应溶液，优选使用20～100μl。这些条件本技术领域的普通技术人员可适当选择。另外有关PCR反应的条件本技术领域的普通技术人员也可适当确定。
被扩增的DNA优选进行纯化。在纯化中可以使用例如核酸外切酶和碱性磷酸酶。这些酶由于具有使未反应的引物核苷酸失活的作用，因此扩增的DNA可被纯化。
纯化的DNA可确定其碱基序列。就是说，本发明作为DNA分型法可以通过确定HLA区域的碱基序列进行与以往的血清学相比更高精度的分型。
碱基序列的确定可以使用Sanger法、Maxam-Gilbert法等方法。例如在Sanger法中，通过按照通常的操作进行反应，可以得到链长不同的部分复制DNA的混合物。得到的部分复制DNA的序列可以通过使用电泳法的毛细管型或平板(平板凝胶)型DNA测序仪进行解析。在本发明中优选使用毛细管型DNA测序仪(RISA-384)((株)岛津制作所制造)、ABI-3730×1(Applyed Biosystems公司制造)。测序数据可以通过计算机程序进行解析，对来自异接合体的二重峰进行自动检测，确定共有序列。已确定的碱基序列通过从HLA型数据库进行检索，自动进行HLA型的判定。
就象以上叙述的那样，利用本发明由于不仅可以保持DNA分型的高解析精度，而且与以往相比可以大幅度削减DNA解析的人力和花费，所以可以更有效地处理更多的样品。
实施例
以下通过实施例对本发明进行更详细地说明，但本发明并不限定于这些实施例。
[实施例1]
通过将针刺入指尖从40个被检验者分别採集少量血液(大约1μl)，然后使採集的血液吸附于滤纸上。用打孔器冲下滤纸中吸附血液部分的一部分(直径2mm)，插入到96孔PCR板中。将下述所示的PCR反应溶液20μl加入到板中各个血液滤纸上，将防止蒸发的片材贴在板上。
(PCR反应溶液(20μl中))
引物
TTCTCCCCAGACGCCGAGGATGGCC(序列表中的序列号1) 0.5μM
TGTTGGTCCCAATTGTCTCCCCTC(序列表中的序列号2) 0.5μM
AmpdirectR-G/C((株)岛津制作所制造) 4μl
dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各200μM
ExTaq(宝酒造(株)制造) 0.5U
PCR反应使用thermal cycler(Applied Biosystems公司制造)，在进行96℃下的3分钟预热后，于96℃-30秒钟、63℃-1分钟、72℃-3分钟的条件下进行40循环。最后进行72℃-5分钟的聚合。
回收各个反应溶液10μl，通过添加核酸外切酶和碱性磷酸酶的混合物(Amersham公司生产，ExoSAP-IT)1μl，进行纯化。
使用下述所示的测序反应液5μl，用下述的4种引物分别对上述纯化得到的PCR产物进行测序。
(测序反应液(5μl中))
上述纯化得到的PCR产物 0.25μl
引物 1μM
BigDye Terminator Ver3.1(Applied Biosystems公司制造) 1μl
(引物)
1.CACTCCATGAGGTATTTC(序列表中的序列号3)
2.TCTGGTTGTAGTAGC(序列表中的序列号4)
3.GGCCAGGGTCTCACA(序列表中的序列号5)
4.CAATTGTCTCCCCTC(序列表中的序列号6)
对上述测序反应中得到的部分复制DNA用乙醇沉淀法进行纯化，使溶解于水，通过毛细管DNA测序仪(RISA-384)((株)岛津制作所制造)对部分复制DNA的序列数据进行解析。对来自异接合体的二重峰进行检测，确定共有序列，已确定的共有序列数据从http：//square.umin.ac.jp/JSHI/mhc.html公开的HLA型数据中进行检索，列举出进行了定位的类型。
对利用上述分型方法得到的HLA类型与通过血清学分型方法得到的HLA类型进行比较，40个样品都一致。
另外由滤纸血能否直接进行PCR，可以通过将得到的扩增产物的一部分进行电泳来确认。图1给出了电泳图。图1中带1是将实施例1进行PCR使用的4μl缓冲液AmpdirectR-G/C换成2μl添加了ExTaq(宝酒造(株)制造)的PCR缓冲液的结果。带2是实施例1进行PCR的结果。带3是将实施例1进行PCR使用的缓冲液AmpdirectR-G/C 4μl换成8μl AmpdirectR-G/C：AmpAddition-4＝1∶1(体积比)混合液的结果。就象图1所表示的那样，虽然用以往类型的PCR缓冲液不能确认DNA的扩增(带1)，如果使用AmpdirectR-G/C或AmpdirectR-G/C与AmpAddition-4的混合物作为缓冲液可以明确确认DNA的扩增(带2和带3)。
[实施例2]
5个被检验者口中含少量水，轻轻漱漱口。然后用市售的牙刷刷牙，每一边10次(两边共20次)，然后将牙刷放入到加入了10ml的1重量％NaCl水溶液的离心管中，振荡几次，使採集的口腔粘膜悬浮于1重量％NaCl水溶液中，做成样品悬浮液。
向加入了下面给出的PCR反应溶液45μl的试管中加入上述样品悬浮液5μl。
(PCR反应溶液(50μl中))
引物
正向引物
ACCCACCCGGACTCAGAATCTCCT(序列表中的序列号7) 0.5μm
反向引物(用以下2种引物的混合引物。)
GGAGGCCATCCCCGGCGACCTAT(序列表中的序列号8) 0.25μM
GGAGGCCATCCCCGGCGATCTAT(序列表中的序列号9) 0.25μM
AmpdirectR-G/C((株)岛津制作所制造) 10μl
AmpAddition-4 10μl
dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各200μM
Z-Taq(宝酒造(株)制造) 1.25U
PCR反应使用thermal cycler(Applied Biosystems公司制造，GeneAmp9700)，在进行80℃-15分钟预处理，接着进行96-3分钟的预热后，于96℃-30秒钟、63℃-1分钟、72℃-3分钟的条件下进行40循环。最后进行72℃-5分钟的聚合。
回收各个反应溶液10μl，通过添加核酸外切酶和碱性磷酸酶的混合物(Amersham公司生产，ExoSAp-IT)1μl，进行纯化。
使用下述所示的测序反应液5μl，用下述的4种引物分别对上述纯化得到的PCR产物进行测序。
(测序反应液(5μl中))
上述纯化得到的PCR产物 0.25μl
引物 1μM
BigDye Terminator Ver3.1(Applied Biosystems公司生产) 1μl
(引物)
1.CACTCCATGAGGTATTTC(序列表中的序列号3)
2.TCTGGTTGTAGTAGC(序列表中的序列号4)
3.GGCCAGGGTCTCACA(序列表中的序列号5)
4.下述2种引物的混合引物
CCCCGGCGACCTAT(序列表中的序列号10)
GGAAGGCTCCCCACT(序列表中的序列号11)
对上述测序反应中得到的部分复制DNA用乙醇沉淀法进行纯化，使溶解于水，通过毛细管DNA测序仪(RISA-384)((株)岛津制作所制造)对部分复制DNA的序列数据进行解析。对来自异接合体的二重峰进行检测，确定共有序列，已确定的共有序列从http：//square.umin.ac.jp/JSHI/mhc.html公开的HLA型数据中进行检索，列举出进行了定位的类型。
对利用上述分型方法得到的HLA类型与通过血清学分型方法得到的HLA类型进行比较，5个样品都一致。
另外由口腔粘膜能否直接进行PCR，可以通过将得到的扩增产物的一部分进行电泳来确认。图2给出了电泳图。图2中带1是将实施例2进行PCR使用的4μl缓冲液AmpdirectR-G/C换成2μl添加了ExTaq(宝酒造(株)制造)的PCR缓冲液的结果。带3是实施例2进行PCR的结果。。就象图2所表示的那样，虽然用以往类型的PCR缓冲液不能确认DNA的扩增(带1)，如果使用AmpdirectR-G/C和AmpAddition-4的混合物作为缓冲液可以明确确认DNA的扩增(带3)。
在上述实施例中，虽然给出了本发明范围内的具体的两个形式，但本发明并不限定于这些实施例，可以以各种各样的形式实施。因此，上述实施例只不过是整个内容的简单的例子，不能解释为限定的意思。另外，属于等同本发明要求保护范围的变更都在本发明的范围内。
【序列表】
<110>株式会社岛津制作所
<120>HLA分型法
<130>G16-02-CN
<150>JP2003-57287
<151>2003-03-04
<160>11
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>1
ttctccccag acgccgagga tggcc
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>2
tgttggtccc aattgtctcc cctc
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>3
cactccatga ggtatttc
<210>4
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>4
tctggttgta gtagc
<210>5
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>5
ggccagggtc tcaca
<210>6
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>6
caattgtctc ccctc
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>7
acccacccgg actcagaatc tcct
<210>8
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>8
ggaggccatc cccggcgacc tat
<210>9
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>9
ggaggccatc cccggcgatc tat
<210>10
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>10
ccccggcgac ctat
<210>11
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>11
ggaaggctcc ccact