鉴定天然植物品种的方法、试剂盒及其应用 【技术领域】
本发明涉及一种天然植物品种的鉴定方法及该方法在鉴定藏茵陈药材原植物种类的应用；同时还涉及一种鉴定天然植物品种的试剂盒及该试剂盒在鉴定正品藏茵陈川西獐牙菜的应用。
背景技术
根据国家对药材的法规，只有进入药典的植物种类，才经过了药效、药理和安全性能的检查，才能在药品中使用。即使含有相同药效成分的种类，如果没有收入药典，也不能在药品中使用，因为它还可能含有其它未知的不安全成分。目前市场上出售的各种药材品种繁多，好多药材名称、形帽都很相似而价格相差悬殊，且药材干燥或者加工处理后，各种药材之间的特征难以鉴别。就市场上作为‘藏茵陈’药材出售的种类主要有川西獐牙菜Swertiamussotii、抱茎獐牙菜S.franchetiana、尼泊尔獐牙菜S.chirayita、椭圆叶花锚Halenia elliptica、四数獐牙菜S.tetraptera、华北獐牙菜S.wolfongiana、祁连獐牙菜S.przewalskii和大花肋柱花Lomatogoniummacranthum。其中仅有川西獐牙菜经过药效、药理的全过程研究，收入中国药典，抱茎獐牙菜进入青海省地方药典。但市场上出售的“藏茵陈”约有2/3标明是川西獐牙菜的药材经鉴定不是该种类，而分别是抱茎獐牙菜、椭圆叶花锚、大花肋柱花等种类，药效成分检查也发现这些伪品种类的有效成分类别、含量相差很远，新鲜药材收购的价格差距也很远，如椭圆叶花锚收购价仅有0.5元/斤，而川西獐牙菜则高达4元/斤。利用化学中的有效成分检验无法完成对“藏茵陈”药材正伪品的鉴定；此外，解剖学、形态学对于已经加工处理(如磨碎等)地药材不能鉴定到某一种类，因为这些种类的微形态学特征十分相似，只能鉴定到所检查的药材是否是属于“藏茵陈”这一大类。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种天然植物品种的鉴定方法以及该方法在鉴定藏茵陈药材原植物种类中的应用。
本发明的另一个目的是提供了一种鉴定天然植物品种的分子试剂盒及该分子试剂盒在鉴定正品藏茵陈川西獐牙菜的应用。
本发明的目的通过以下措施实现：
一种鉴定天然植物品种的方法，包括以下步骤：(1)、对植物进行总DNA提取；(2)、利用引物对上述提取的DNA进行PCR扩增；(3)将扩增得到的PCR产物纯化；(4)利用测序仪对纯化的PCR产品进行测序获得一段碱基序列，并将该碱基序列与植物的标准DNA序列进行比较，从而确定该植物的品种。
所述植物总DNA的提取方法为CTAB法。
所述引物为DNA片段。
所述鉴定天然植物的方法用于鉴定藏茵陈原植物种类，其中引物为P1：5’-CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3’和引物P2：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。
鉴定藏茵陈原植物品种的方法包括以下步骤：(1)、对藏茵陈药材进行总DNA提取；(2)、利用引物P1：5’-CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3’和引物P2：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’对上述提取的DNA进行PCR扩增；(3)将扩增得到的PCR产物进行纯化；(4)利用测序仪对纯化的PCR产品进行测序获得一段碱基序列，并将该碱基序列与各种藏茵陈原植物的标准DNA序列进行比较，从而确定藏茵陈的种类。
所述DNA进行PCR扩增的反应液包括：双蒸水、缓冲液、dNTP、引物P1、引物P2、Taq酶、提取的DNA模板。
上述PCR扩增液的体积配比为：双蒸水25ul；10×tris-CL缓冲液(PH 9.2，25mmol/L KCL，1.5mmol/L MgCl2)5ul；dNTP(8mmol/L)5ul；引物P1(2μmol/L)：2.5ul，引物P1(2μmol/L)：2.5ul；Taq酶(Unit/μL)0.3ul；药材DNA模板(12.5mmol/L)10ul；
扩增的工艺步骤为：70°-1分钟，94°-1分钟，53°-45秒，72°-50秒，循环2次，再接以94°-20秒，55°-40秒，72°-50秒，循环38次，然后在72°保温4分钟。
一种根据上述鉴定天然植物品种的方法制备的鉴定天然植物的分子试剂盒，其内的溶液主要由引物和DMSO试剂组成，其中所述引物为DNA片段。
将上述鉴定天然植物的分子试剂盒应用于鉴定正品藏茵陈川西獐牙菜，该分子试剂盒内的引物为ID1：GGCTTGCCTCTCGACGCTC和ID2：GCAAGCGTCACGAAGACGCG。所述试剂盒内反应液还包括：双蒸水、缓冲液、dNTP、Taq酶。
上述反应液的体积配比为：双蒸水：25ul，10×tris-CL缓冲液：5u1，dNTP(8mmol/L)：5ul，引物IDl(2μmol/L)：2.5ul，引物ID2(2μmol/L)：2.5ul，试剂DMSO(1.5mmol/L)：0.2ul，Taq酶(Unit/μL)：0.3ul。
上述的鉴定正品藏茵陈川西獐牙菜的试剂盒的应用，包括以下步骤：(1)、对藏茵陈药材进行总DNA提取；(2)、将上述提取的DNA取10ul滴入上述试剂盒内，使DNA进行PCR扩增；以70°-1分钟，94°-1分钟，62°-40秒，72°-50秒，循环2次，再以94°-20秒，55°-20秒，72°-50秒，循环38次，然后在72°保温4分钟；若得到约500bp片段的扩增产物，则为川西獐牙菜；无此扩增片段，则是伪品种类。
上述dNTP、Taq酶、DMSO试剂、tris-CL缓冲液(PCR Buffer)为生物化学试剂，均可直接从生物化学产品公司购买。
本发明第一次提供了鉴定药材原植物品种的方法及及鉴定“藏茵陈”药材原植物种类的准确方法；同时也第一次提供了鉴定正品“藏茵陈”川西獐牙菜的分子试剂盒。
【具体实施方式】
一种鉴定藏茵陈原植物品种的方法，包括以下步骤：
(1)、利用CTAB法对藏茵陈药材进行总DNA提取；
(2)、利用引物P1：5’-CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3’和引物P2：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’对上述提取的DNA进行PCR扩增；其中PCR扩增工艺如下：
扩增反应液体积配比：双蒸水25ul；10×tris-CL缓冲液(PH 9.2，25mmol/LKCL，1.5mmol/L MgCl2)5ul；dNTP(8mmol/L)5ul；引物P1(2μmol/L)：2.5ul，引物P1(2μmol/L)：2.5ul；Taq酶(Unit/μL)0.3ul；药材DNA模板(12.5mmol/L)10ul。
扩增工艺步骤：70°-1分钟，94°-1分钟，53°-45秒，72°-50秒，循环2次，再接以94°-20秒，55°-40秒，72°-50秒，循环38次，然后在72°保温4分钟。
(3)将扩增得到的PCR产物利用Wizard PCR Preps DNA PurificationSystem(按其要求进行实验过程)纯化；
(4)利用测序仪对纯化的PCR产品进行测序获得一段碱基序列，并将该碱基序列与各种藏茵陈原植物的标准DNA序列(见附页)进行比较，从而确定藏茵陈的原植物种类。
一种鉴定正品藏茵陈川西獐牙菜的分子试剂盒，该试剂盒内的反应液中各成分的体积配比为：双蒸水25ul；10×tris-CL缓冲液(PH 9.2，25mmol/L KCL，1.5mmol/L MgCl2)5ul，；dNTP(8mmol/L)5ul；引物ID1：GGCTTGCCTCTCGACGCTC：2.5ul(2μmol/L)，引物ID2：GCAAGCGTCACGAAGACGCG：2.5ul(2μmol/L)，DMSO(1.5mmol/L)0.2ul，Taq酶(Unit/μL)0.3ul。
上述鉴定川西獐牙菜分子试剂盒的应用，包括以下步骤：(1)、对药材进行总DNA提取；(2)、将上述提取的DNA取10ul(10-30ng)滴入上述试剂盒内，使DNA进行PCR扩增；以70°-1分钟，94°-1分钟，62°-40秒，72°-50秒，循环2次，再以94°-20秒，55°-20秒，72°-50秒，循环38次，然后在72°保温4分钟；若得到约500bp片段的扩增产物，则为川西獐牙菜；无此扩增片段，则是伪品种类
附：各类“藏茵陈”原植物标准DNA序列表
Swertia_mussotii TCGAATCCTGCGAAGCAGACGACCCGAGAACATGTTTAACAA-ACGGGTG
Swertia_franchetiana TCGAATCCTGCGAAGCGGACGACCCGAGAACATGTTTAACAA-ACGGGTG
Swertia_chirayiata TCGAATCCTGCGAAGCAGACGACCCGAGAACATGTTTACCGG-CACGGGG
Lomatogonium_macranthum TCGAATCCTGCGAAC-AGACGACCCGAGAACATGTTTAACGC-ACGGGCG
Halenia_elliptica TCGAATCCTGCGAAGCAGATGACCCGAGAACATGTTTAACGA-ACGGGCG
Swertia_tetraptera TCGAATCCTGCAAAGCAGACGACCCGAGAACATGTTTAACAA-ACGGGCG
Swertia_przewalskii TCGAATCCTGCGAAGCAGACGACCCGAGAACATGTTTAAAGC-ACGGACG
Swertia_wolfangiana TCGAATCCTGCGAAGCAGACGACCCGAGAACATGTTTAAAGC-ACGGACG
Swertia_mussotii --TCCGGGA-CGAGGGAAACCACGGACTGGCGCCCCGAGCA
Swertia_franchetiana --TCCGGGA-CGAGGGAAACCACGGACCGGTGCCCCGAGCA
Swertia_chirayiata CGTCCGGGA-CGGGGAAAACCACGGACCGGCGCCTCGAGCG
Lomatogonium_macranthum --TCCGGGA-CGAGGGAAACCTTGGACCGGCACCCCGAGCG
Halenia_elliptica --TCCGGAA-AGAGGGAAACCATGGACCGGCGCCC-GTGCG
Swertia_tetraptera --TCCGGAA-AGAGGGAAACCACGGACCGGCACCCCATGCA
Swertia_przewalskii --TCCGGGA-TGTGGGAAACCACGGACCGGCGCCCCGAGCA
Swertia_wolfangiana --TCCGGGA-TGTGGGAAACCACGGACCGGCGCCCCGAGCA
Swertia_mussotii CGGTGTCGACCT-TAGGTTGCTCGTCGTGCACACAAACAACCCCGGGCGCATAAAA
Swertia_franchetiana CGTTGTCGACCT-TAGGTTGCTCGTCGTGCACACAAACAACCCCGGGCGCATAAAA
Swertia_chirayiata CGGCGTCGACCA-TAGGTCGCTCGTCGTGCACATAAACAACCCCGGGCGCTTAAAA
Lomatogonium_macranthum CGGCGTCGACT--TAGGTCGCTCGTCGTGCACACAAACAACCCCGGGCGCATAAAA
Halenia_elliptica CGGCGTCGACCAGCCGGTCGTGCGTCATGCACACAAACAACCCCGGGCGTAGAAAA
Swertia_tetraptera TGACGTCGACCAGCCGGTCGTGCGTTCTGCACACAAACAACCCCGGGCGCATAAAA
Swertia_przewalskii CGGCGTCGACCA-ACGGTCGCTCTTCGTGCAGACAAACAACCCCGGGCGCATAAAA
Swertia_wolfangiana CGGCGTCGACCA-ACGGTCGCTCTTCGTGCAGACAAACAACCCCGGGCGCATAAAA
Swertia_mussotii GCGCCAAGGAAAAC-AAGAAAGGGATGGCTTGCCTCTCGACGCTCCGTTCGCGGAGTG
Swertia_franchetiana GCGCCAAGGAAAAC-AAGAAAGGGATGGCTTGCCTCTCGATGCTCCGTTCGCGGAGTG
Swertia_chirayiata GCGCCAAGGAAAAC-AAGAAAGGGATGGCCTGCCTCTCGACGCTCCGTTCGCGGAGTG
Lomatogonium_macranthum GCGCCAAGGAAAAC-AAGAAAAGGATGGCCTGCCTCTCGACGCTCCGTTCGCGTAGTG
Halenia_elliptica GCGCCAAGGAAAAC-AAGAAAGGGATGGCCTGCCTCTTGATGCCCCGTACGCGGAGTG
Swertia_tetraptera GCGCCAAGGAAAAC-AAGAAAGGGA-AGCCTGCCTCTTGACGCGCCGTACGCGGAGTG
Swertia_przewalskii GCGCCAAGGAAGAC-AAGGAAGGGATGGCCTTCCTCTCGATGCGCCGTACGCGGAGTG
Swertia_wolfangiana GCGCCAAGGAAGAC-AAGGAAGGGATGGCCTTCCTCTCGATGCGCCGTACGCGGAGTG
Swertia_mussotii CACGGGAGGGCAACAGGCACCTGAAGAAACAA-AAACGACTCTCGGCAACGGATATCTC
Swertia_franchetiana CATGGGAGGGCAACAGGCACCTGAAGAAACAA-AAACGACTCTCGGCAACGGATATCTC
Swertia_chirayiata CATGGGAGGGCAACAGGCACCTGAATAAACAA-AAACGACTCTCGGCAACGGATATCTC
Lomatogonium_macranthum TA-GTGAGGGCAACGGGCACCTAAAGAAACAA-AAACGACTCTCGGCAACGGATATCTC
Halenia_elliptica CACGGGAGGGCAGCAGGCACCTGAAGAATCTA-AAACGACTCCCGGCAACGGATATCTC
Swertia_tetraptera CACGAGAGGGCAACAGGCACCTGAAGAAACAA-AAACGACTCTCGGCAACGGATATCTC
Swertia_przewalskii CACGGGAGGGCAACAGGCGCCTGAAGAAACAA-AAACGACTCTCGGCAACGGATATCTC
Swertia_wolfangiana CACGGGAGGGCAACAGGCGCCTGAAAAAACAA-AAACGACTCTCGGCAACGGATATCTC
Swertia_mussotii GGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAACTGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCC
Swertia_franchetiana GGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAACTGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCC
Swertia_chirayiata GGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAACTGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCC
Lomatogonium_macranthum GGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAACTGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCC
Halenia_elliptica GGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAACTGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCC
Swertia_tetraptera GGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAACTGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCC
Swertia_przewalskii GGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAACTGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCC
Swertia_wolfangiana GGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAACTGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCC
Swertia_mussotii CGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCATTAGGCCGAGGGCACGT
Swertia_franchetiana CGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCATTAGGCCGAGGGCACGT
Swertia_chirayiata CGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCATTAGGCCGAGGGCACGT
Lomatogonium_macranthum CGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCATTAGGCCGAGGGCACGT
Halenia_elliptica CGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCAATAGGCTGAGGGCACGT
Swertia_tetraptera CGTGAACCATCGAGTTTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCAATAGGCCGAGGGCACGT
Swertia_przewalskii CGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCATCAGGCCGAGGGCACGT
Swertia_wolfangiana CGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCATCAGGCCGAGGGCACGT
Swertia_mussotii CTGCCTGGGCGTCACGCATCGCGTCGCCCCCCCGACCCCGTGTGTTAACTCGTACGGGT
Swertia_franchetiana CTGCCTGGGCGTCACGCATCGCGTCGCCCCCCCGACCTCGTGTGTTAACTCGTACGGGT
Swertia_chirayiata CTGCCTGGGCGTCACGCATCGCGTCGCCCCCC-AACCCCGTGTGTTAACTCGTACGGGT
Lomatogonium_macranthum CTGCCTGGGCGTCACGCATCGCGTCGCCCCCCAAACCCCGTGTGTTAACTCGTACGGGT
Halenia_elliptica CTGCCTGGGCGTCACGCATCGCGTCGCCCCTC-ACCCCAGTGTGTTAACCTTCACGGGT
Swertia_tetraptera CTGCCTGGGCGTCACGCATCGCGTCGCCCCCC-AACCCCGTGTGTTAAGTCGCATGGGT
Swertia_przewalskii CTGCCTGGGCGTCACGCATCGCGTCGCCCCCCCAACCCCGTGTGTTAAATCGTACGGAT
Swertia_wolfangiana CTGCCTGGGCGTCACGCATCGCGTCGCCCCCC-AACCCCGTGTGTTAAATCGTACGGAT
Swertia_mussotii GACGTGAGGGGG-CGGAAACTGGCTTCCCGTGCTTGGCTGCGGCTGGCCTAAATGC
Swertia_franchetiana GACGTGAGGGGG-CGGAAACTGGCTTCCCGTGCTTGGCTGCGGCTGGCCTAAATGC
Swertia_chirayiata GACGTGAGGGGG-CGGAAACTGGCTTCCCGTGCTTGGCCGCGGCTGGCCTAAATGC
Lomatogonium_macranthum TACTTTAGGGGG-CGGAGATTGGCTTCCCGTGCTTGG-CGCGGCTGGCCTAAATGC
Halenia_elliptica CACGTGAGGGGA-CGGAAACTGGCTTCCCGTGCTTCGTCGCGGCTGGCCTAAATAT
Swertia_tetraptera GACGTGAGGGGGGCGTAAACTGGCTTCCCGTGCTTTGTCGCGGCTGGCCTAAATAT
Swertia_przewalskii AACGTGTGGGGG-CGGAAAATGGCTTCCCGTGCTTGG-TGCGGCTGGCCTAAATGC
Swertia_wolfangiana AACGTGTGGGGG-CGGAAAATGGCTTCCCGTGCTTGG-TGCGGTTGGCCTAAATGC
Swertia_mussotii GAGTCCCTTGTGACGGACGCGACGACAAGTGGTGGTTGTTTGTCTCAACTAAGGTGCT
Swertia_franchetiana GAGTCCTTTGCGACGGACGCGACGACAAGTGGTGGTTGTTTGTCTCAACTAAGGTGCT
Swertia_chirayiata GAGTCCCTTGCGACGGACGCGACGACAAGTGGTGGTTGATTGCCTCAACTAAGGTGCT
Lomatogonium_macranthum GAGTCCCTTGCGACGGACGCGACGACAAGTGGTGGTTGATTATCTCAACTAAGGTGCT
Halenia_elliptica GAGTCCCTTGCGACGGACGCGACGACAAGTGGTGGTTGATTTCCTCAACTAAGGTGCT
Swertia_tetraptera GAGTCCCTTGCGACGGACACGACGACAAGTGGTGGTTGATTTTGTCAACTGAGGTGCT
Swertia_przewalskii GAGTCCCTTGCGACGGACGCGACGACAAGTGGTGGTTGATTGCCTCAACTAAGGTGCT
Swertia_wolfangiana GAGTCCCTTGCGACGGACGCGACGACAAGTGGTGGTTGATTGCCTCAACTAAGGTGCT
Swertia_mussotii GTCGTCCGACGC-CCGTCGAATGAGGAGACTCCCC-GACCCTGATGCACGCGTCTT
Swertia_franchetiana GTCGCACGACGA-CCGTCGAATGAGGAGACTCCCT-GACCCTGATGCACGTGTCTG
Swertia_chirayiata GTCGCGCGACGC-CCGTCGAATGAGGAGACTCCCT-GACCCTGATGCATGCGTTGT
Lomatogonium_macranthum GTCGCGCGACGC-CCGTCGAATGAGGAGACTCCCT-GACCCTGATGCAATCGTCGT
Halenia_elliptica GCCGCGCGACGT-CTGTCGAGTTAGGAGACTCCTT-GACCCTGATGCATGCGTCGT
Swertia_tetraptera GTCGCGCGACGC-CTGTCGAGTTAGGAGACTCCCC-GACCCTGATGCACGCGTCGT
Swertia_przewalskii GTCGCGCGACGC-CCGTCGAACGAGGAGACTACCC-GACCCTGATGCATGCGTCGT
Swertia_wolfangiana GTCGCGCGACGC-CCGTCGAACGAGAAGACTACCC-GACCCTGATGCATGCGTCGT
Swertia_mussotii CGTGACGCTTGCTACGACCGC
Swertia_franchetiana CATGACGCTTGCTACGACCGC
Swertia_chirayiata CACGACGCTTGCTACGACCGC
Lomatogonium_macranthum CACGACGTTTGCTACGACCGC
Halenia_elliptica CACGATGCTTGCTACGACCGC
Swertia_tetraptera CACGACGCTTGCTACGACCGC
Swertia_przewalskii CACGACGCGTGCTACGACCGC
Swertia_wolfangiana CACGACGCCTGCTACGACCGC