人成纤维细胞滋养的人角膜缘干细胞组织工程产品及制备 所属领域：
本发明涉及一种生物工程领域中用于治疗眼表疾病的产品及其制备方法，特别涉及一种可以修复角膜缘干细胞损伤，用于眼表重建的人角膜缘干细胞—羊膜组织工程复合体及其制备方法。
背景技术：
近年来在眼表疾病的治疗中，最重要的突破是对角膜缘干细胞的功能和定位的认识。大量研究结果显示角膜缘基底层的部分细胞保持了未分化特性，为角膜上皮细胞的“干细胞”，这些细胞具有以下几个特征：(1)具有增殖潜力，(2)能够自我更新，(3)能产生大量终末分化的功能性细胞，(4)能修复组织损伤。以角膜缘干细胞缺陷为特征的眼表疾病是由于角膜缘干细胞损伤造成角膜上皮修复缺陷，最终导致角膜基质瘢痕化，其病变范围只涉及眼表上皮，但却往往严重损害视功能，是严重的致盲性眼病。对于此类患者，其角膜后部基质和内皮以及眼球其它组织都很健康，只需要解决由于干细胞缺陷造成的眼表重建障碍即可提高患者的视功能。然而传统的手术方法如：睑缘缝合术、自体结膜移植、口腔粘膜移植、羊膜移植、角膜缘干细胞移植都具有诸多局限性。严重地角膜缘干细胞缺陷性眼表疾病的治愈亟待新的治疗技术和治疗产品。
目前，随着组织工程技术的迅速发展，在借鉴传统上皮细胞培养体系的基础上，引入羊膜作为角膜缘干细胞体外培养的载体，培养的角膜缘干细胞移植已在临床应用中获得了初步成功。在此项技术中，合理的体外培养体系是取得良好结果的最重要的前提，其中最重要的是保证在培养体系中含有一定数量的干细胞，并且所用的培养体系能较好地维持角膜缘干细胞的原始细胞特性。此外，上皮细胞培养体系中需要加入3T3成纤维细胞作滋养层，但由于3T3成纤维细胞为鼠源性的永生细胞系，含有鼠源性异种基因和逆转录病毒基因，为临床应用带来了潜在威胁。因此建立合理的人角膜缘干细胞—羊膜复合体的体外培养体系，使之具有有效性和生物安全性，则具有特别重要的临床意义。
发明内容：
本发明的目的就在于克服上述现有技术中存在的不足，而提供一种人成纤维细胞滋养的人角膜缘干细胞组织工程产品及制备方法，该羊膜复合体具有有效性和生物安全性。
本发明的技术方案是：一种人成纤维细胞滋养的人角膜缘干细胞组织工程产品，其特征在于：在组织学形态上接近人角膜上皮形态，在免疫学表型上与人角膜缘上皮类似，其超微结构显示细胞与细胞之间的连接发育成熟，上皮细胞与羊膜载体之间为紧密的粘连。
上述人角膜缘干细胞—羊膜组织工程复合体的组织学形态为：在羊膜载体上生长的复层人角膜缘上皮细胞分化为4～6层细胞的复层结构，基底细胞呈柱状。
上述人角膜缘干细胞—羊膜组织工程复合体的表型为：在羊膜上生长的复层角膜缘上皮细胞表层细胞细胞角质蛋白(CK3)阳性，基底层细胞阴性，大部分表层细胞ΔNp63阳性，基底层细胞ΔNp63为阴性；基底层细胞很少表达缝隙连接蛋白(Cx43)，仅在表层细胞有少量表达。
上述人角膜缘干细胞—羊膜组织工程复合体的超微结构为：角膜缘上皮细胞长势良好，易见上皮有丝分裂相，细胞核大；细胞之间有丰富的桥粒连接；基底部细胞的基底部胞浆有大量的突起深入基底板和网状板，细胞与基底膜之间没有空隙，由细胞分泌产生的基底板发育比较完整，网状板增厚；并与胶原纤维融合。
上述人成纤维细胞滋养的人角膜缘干细胞组织工程产品的制备方法，其特征在于：依照下列步骤完成：①人角膜缘干细胞的体外培养载体—羊膜的制备：分离和保存羊膜，使用时取出冻存的羊膜，0.1％的EDTA和0.1％的胰蛋白酶先后作用去除羊膜上皮细胞；②人角膜缘成纤维细胞滋养层的制备：分离胎儿角膜缘间质组织，培养人角膜缘成纤维细胞，用4μg/ml丝裂霉素C处理人角膜缘成纤维细胞；③人角膜缘上皮细胞悬液的制备：包括以下步骤：分离人角膜缘组织，用1.2U/ml的Dispase II分离人角膜缘上皮细胞，用0.1％的胰蛋白酶和机械抽吸制备单细胞悬液；④人角膜缘干细胞—羊膜复合体的培养：将上述经过处理的羊膜放入铺有丝裂霉素C处理过的人角膜缘成纤维细胞的培养板内，并将人角膜缘上皮细胞悬液以5×103/cm2的密度接种于羊膜上，经过培养液的培养14-21天后采用air-lifting技术，把细胞置于气液交界面7天。
上述羊膜来自健康孕妇剖宫产的胎膜。
上述角膜缘间质组织来自胎儿的眼球。
上述人角膜缘上皮细胞来自新鲜尸体眼、患者自身眼球或亲属健康眼球。
上述培养液采用60％DMEM和30％Ham’s F12培养液，内加10％胎牛血清、5μg/ml胰岛素、0.18mM腺嘌呤、0.1nM霍乱毒素、0.4μg/ml氢化考的松、2nM三碘甲腺原氨酸、4mM谷氨酰胺、50IU/ml氢链霉素和10ng/ml表皮生长因子。
本发明的优点为：1、本发明在人角膜缘干细胞组织工程产品的制备方法中引入羊膜作为角膜缘干细胞的体外培养载体，使产品具有生物相容性，并可发挥羊膜用于眼表疾病治疗的优越性。采用细胞悬液法培养，可保证在培养体系中含有一定数量的干细胞。采用air-lifeing技术以促进细胞分化，且利用人角膜缘成纤维细胞为滋养层，既能有效地发挥滋养层的作用，有助于维持角膜缘干细胞原始细胞的特征，又能去除了鼠源性3T3成纤维细胞可能带来的异源性基因的潜在威胁，使产品具有安全性。2、本发明中的产品人角膜缘干细胞组织工程产品具有和人角膜缘上皮相似的表型，超微结构显示细胞之间连接发育成熟，细胞与羊膜之间建立了紧密粘连，从而使产品在临床应用上具有有效性。
本发明具有特别重要的用途：
1.按照本发明提供的制备技术，可以为人角膜缘干细胞的体外培养提供合适载体。
2.按照本发明提供的人角膜缘成纤维细胞滋养层的制备技术，可以建立人角膜缘成纤维细胞系，用于作为人角膜缘干细胞体外培养的滋养层。
3.按照本发明提供的人角膜缘上皮细胞悬液的制备技术，可以获得包含人角膜缘干细胞在内的纯的上皮细胞悬液。
4.按照本发明提供的人角膜缘干细胞组织工程产品的制备技术，可以使得角膜缘干细胞在羊膜上大量扩增，并分化为复层上皮样结构，用于制备人角膜缘干细胞组织工程产品。
5.按照本发明制备技术制备的人角膜缘干细胞—羊膜组织工程复合体可以用于治疗以角膜缘干细胞缺陷为特征的眼表疾病。
附图说明：
图1为人角膜缘干细胞组织工程产品的组织学结构图，其中a：在羊膜上形成的单层细胞较为扁平；b：在羊膜上生长的复层人角膜缘上皮细胞分化为4～6层细胞的复层结构，基底细胞呈柱状。
图2为正常角膜和角膜缘上皮细胞的表型图，其中a：角膜缘上皮表层细胞表达CK3，基底层细胞不表达；b：角膜上皮全层表达CK3；c：角膜缘基底层细胞ΔNp63表达阳性；d：周边角膜基底层细胞间或有ΔNp63的表达；e：中央角膜上皮不表达；f：角膜缘基底部细胞表达Cx43较少；g：角膜上皮的基底部细胞大量表达Cx43。
图3为人角膜缘干细胞组织工程产品的表型图，其中a：在羊膜上生长的单层角膜缘上皮细胞CK3阳性率14.3％；b：在羊膜上生长的单层角膜缘上皮细胞ΔNp63阳性率为87.5％；c：在羊膜上生长的单层角膜缘上皮细胞仅偶有Cx43的表达；d：在羊膜上生长的复层角膜缘上皮细胞表层细胞CK3阳性，基底层细胞阴性；e：在羊膜上生长的复层角膜缘上皮细胞基底层细胞ΔNp63阳性，表层细胞大部分为阴性；f：在羊膜上生长的复层角膜缘上皮细胞基底层细胞很少表达Cx43，仅在表层细胞有少量表达。
图4为人角膜缘干细胞组织工程产品的超微电镜结构图(细胞在羊膜上生长至单层的形态)，其中：a：角膜缘上皮细胞核大，染色质丰富，有大核仁；b：细胞间可见到桥粒结构(arrow)和紧密连接(arrowhead)；c：基底部的胞浆突起伸入间断的基底板(arrow)，偶见锚状纤维(arrowhead)；d：部分胞浆突起处有浓集的蛋白质沉着(arrow)，上皮细胞分泌形成间断的基底板(arrowhead)，网状板不完整(star)，其下为胶原纤维组成的羊膜基质。
图5为人角膜缘干细胞组织工程产品的超微电镜结构图(细胞在羊膜上生长至复层的形态)，其中：a：角膜缘上皮细胞长势良好，易见上皮有丝分裂相(arrowhead)，细胞核大；b：有丰富的桥粒连接(arrowhead)，远较单层细胞为多；c：基底部细胞的基底部胞浆深入基底板和网状板的乳头多而大，细胞与基底膜之间基本没有明显的空隙，基底板发育比较完整(arrow)，网状板增厚(star)；d：基底板发育完整，网状板增厚，与胶原纤维融合(star)。
具体实施方式：
一种用于治疗角膜缘干细胞缺陷性眼表疾病的人角膜缘干细胞—羊膜组织工程复合体的培养方法依照下列步骤完成：1、羊膜的制备：取健康孕妇剖宫产胎膜，沿生理间隙分离羊膜和绒毛膜，将羊膜上皮面朝上平铺于硝酸纤维膜上，放入由50％的DMEM(Gibco，USA)和50％的甘油组成的保存液中，置-80℃保存三个月以上。使用时从冰箱取出冻存的羊膜，置37℃水浴箱中融化。用0.1％的EDTA作用30分钟，再用0.1％的胰蛋白酶作用30秒，用细胞刮子轻轻刮去羊膜上皮细胞。将羊膜上皮面朝上平铺于culture insert(Millipore，USA)内备用。2、人角膜缘成纤维细胞滋养层的制备：显微镜下取胎儿眼角膜缘组织，用1.2U/ml的Dispase II(Millipore，USA)作用后去除上皮，将上皮下结缔组织置入25cm培养瓶中，加入DMEM(10％胎牛血清，100U/ml青链霉素)培养液进行培养。待人角膜缘成纤维细胞铺满约1/2瓶底后传代。用4μg/ml的丝裂霉素C作用生长近融和的人角膜缘成纤维细胞2小时，作用后的细胞冻存备用。用时以2×104/cm2的密度接种六孔板，24小时后备用。3、人角膜缘上皮细胞悬液的制备：取来自眼库的新鲜尸体眼球，显微镜下取厚约100μm的板层角膜缘组织，用1.2U/ml的Dispase II 37℃作用2小时。显微镜下分离角膜缘上皮，将上皮置入0.1％的胰蛋白酶溶液中作用4分钟。用4号针头抽吸细胞制成单细胞悬液。4、人角膜缘干细胞—羊膜复合体的培养：人角膜缘干细胞—羊膜复合体的培养：将铺有羊膜的culture insert放入铺有丝裂霉素C处理过的人角膜缘成纤维细胞的6孔板内，人角膜缘上皮细胞悬液以5×103/cm2的密度接种于羊膜上，培养液采用DMEM和Ham’s F12(Gibco，USA)培养液(2∶1混合)，内加胎牛血清(10％)(Hyclone，USA)、胰岛素(5μg/ml)(Sigma，USA)、腺嘌呤(0.18mM)(Sigma，USA)、霍乱毒素(0.1nM)(Sigma，USA)、氢化考的松(0.4μg/ml)(Sigma，USA)、三碘甲腺原氨酸(2nM)(Sigma，USA)、谷氨酰胺(4mM)、氢链霉素(50IU/ml)，置37℃、5％的CO2孵箱中培养。接种3天以后，培养液中开始加入表皮生长因子(10ng/ml)(PeproTech，UAS)。之后每两天换液一次。培养21天以后，采用air-lifting技术，把细胞置于气液交界面7天。
采用上述方法培养的人角膜缘干细胞—羊膜复合体的实验检测：
1、组织学观察：培养14天和培养28天的人角膜缘干细胞—羊膜复合体作冰冻切片，HE染色。
2、免疫组织化学技术检测ΔNp63和CK3的表达：在培养14天细胞形成单层后，将人角膜缘干细胞—羊膜复合体直接铺于载玻片上，正常人角膜组织和培养28天分化为复层上皮的人角膜缘干细胞—羊膜复合体作冰冻切片，采用免疫组织化学技术行ΔNp63和CK3的检测，分别以鼠抗CK3单克隆抗体(ICN，USA)和鼠抗ΔNp63单克隆抗体(BD，USA)为一抗，采用SAB试剂盒(中山公司)，DAB显色，苏木素复染。
3、免疫荧光技术检测Cx43的表达：单层人角膜缘干细胞—羊膜复合体直接铺于载玻片上，正常人角膜组织和复层人角膜缘干细胞—羊膜复合体作冰冻切片，采用免疫荧光技术检测Cx43的表达。以鼠抗Cx43单克隆抗体(CHEMICON，USA)为一抗，FITC标记的羊抗鼠IgG(Sigma，USA)为二抗，用Hoechst荧光染料(Sigma，USA)复染核，荧光显微镜观察。
4、透射电镜观察：取培养14天和28天的角膜缘上皮细胞—羊膜复合体，用2.5％的戊二醛/多聚甲醛固定，1％的四氧化锇后固定，上升梯度酒精脱水后，用Epon812环氧树脂包埋。LKB-V超薄切片机半薄切片(1μ)定位后，进行超薄切片。醋酸铀、柠檬酸铅染色，JEOL-100CX透射电镜观察。
检测结果如下：
1)人角膜缘干细胞—羊膜复合体的组织学形态
组织学切片显示，在羊膜上形成的单层细胞较为扁平，与羊膜粘连紧密。28天后，上皮细胞分化为4～6层细胞的复层结构，基底层细胞接近柱状。(附图1)
2)人角膜缘干细胞—羊膜复合体的表型
正常的人角膜缘上皮表层细胞表达CK3，基底层细胞不表达，角膜上皮全层CK3阳性；角膜缘基底层细胞ΔNp63表达强阳性，周边角膜基底层细胞间或有ΔNp63的表达，中央角膜上皮不表达ΔNp63；角膜缘基底部细胞表达Cx43较少，而角膜上皮的基底部细胞大量表达Cx43。(附图2)
培养的人角膜缘上皮细胞长成单层时，ΔNp63表达阳性率为87.5％，表达细胞角质蛋白3的细胞只有14.3％，免疫荧光显示只极少数细胞表达Cx43。分化为复层的人角膜缘上皮细胞的基底层细胞ΔNp63表达强阳性，不表达CK3和Cx43，基底层以上细胞CK3阳性。以上结果表明在我们的培养体系中，角膜缘干细胞的原始细胞特性能够在整个培养过程中得以保留。(附图3)
3)人角膜缘干细胞—羊膜复合体超微结构
培养14天后，电镜下可见在羊膜上生长的单层角膜缘上皮细胞核大，染色质丰富，有大的核仁，细胞间有完整的桥粒和紧密连接形成。角膜缘上皮细胞基底部有胞浆突起伸入间断的基底板以及网状板，基底部的胞浆与基底板留有多处空隙，在部分胞浆突起处有浓集的蛋白质沉着，偶见斜向或略垂直的锚状纤维。上皮细胞分泌形成间断的基底板，网状板不太完整。(附图4)
培养28天以后，角膜缘上皮细胞长势良好，易见上皮有丝分裂相，细胞核大，上皮细胞表面微绒毛增生，呈复杂的指状交叉。有丰富的紧密连接和桥粒连接，远较单层细胞为多。基底部细胞的基底部胞浆深入基底板和网状板的乳头多而大，细胞与基底膜之间基本没有明显的空隙；基底板发育更加成熟，比较完整；网状板增厚，更为完整，局部与羊膜的胶原纤维融合。(附图5)