2咪唑啉2基氨基喹喔啉的制药应用.pdf

公开了下式I化合物在制备用于保护哺乳动物视网膜或视神经细胞以抑制或防止神经细胞损伤或死亡的药物方面的应用，该哺乳动物的所说的神经细胞正遭受有害的作用或经受有害作用的危险。式I中2-咪唑啉-2-基氨基基团可以在喹喔啉母核的5-或6-位；x、y和z可以在剩余5-、6-、7-或8-位的任何位置并且选自氢、卤素、低级烷基，低级烷氧基或三氟甲基；并且R是在喹喔啉母核的2-或3-位的任意取代基并且可以是氢，低级烷基或低级烷氧基。

1.  下式I化合物或其可供药用的盐或其混合物在制备用于保护哺乳动物视网膜或视神经细胞以抑制或防止神经细胞损伤或死亡的药物方面的应用，该哺乳动物的所说的神经细胞正遭受有害的作用或经受有害作用的危险，

式I
其中2-咪唑啉-2-基氨基基团位于喹喔啉母核的5-或6-位；x、y和z位于剩余的5-、6-、7-或8-位的任一位置，并且选自氢、卤素、低级烷基、低级烷氧基或三氟甲基；R是在喹喔啉母核的2-或3-位的任意取代基并且可以是氢、低级烷基或低级烷氧基。

2.  权利要求1的应用，其中有害的作用是青光眼的眼内压升高。

3.  权利要求1的应用，其中有害的作用是与青光眼有关的局部缺血。

4.  权利要求1的应用，其中有害的作用是糖尿病性视网膜病变。

5.  权利要求1的应用，其中有害的作用是非青光眼性局部缺血。

6.  权利要求1的应用，其中有害的作用的性质是微血管病变并且是选自下列疾病的症状，所述疾病包括结节性多动脉炎，巨细胞动脉炎，主动脉炎综合症和全身性红斑狼疮。

7.  权利要求1的应用，其中所述药物通过口服将化合物全身应用于哺乳动物。

8.  权利要求7的应用，其中施用的化合物的剂量是5-15mg/kg。

9.  权利要求1的应用，其中所述药物通过应用在眼中的球内注射将化合物提供给哺乳动物。

10.  权利要求1的应用，其中所述药物通过应用非经肠道给药将化合物全身应用于哺乳动物。

11.  权利要求1的应用，其中所述药物通过应用肌内注射将化合物全身应用于哺乳动物。

12.  权利要求1的应用，其中式I的化合物于喹喔啉环的6-位有2-咪唑啉-2-基氨基，y和z均是氢和位于7-位和8-位，和x位于喹喔啉环的5-位上。

13.  权利要求1的应用，其中式I的化合物是


14.  权利要求1的应用，其中式I的化合物是


15.  权利要求1的应用，其中式I的化合物是

其中x如权利要求1所定义，且有害的作用是眼内压升高。

16.  权利要求1的应用，其中式I的化合物是

其中x如权利要求1所定义，并且有害的作用是与青光眼有关的局部缺血。

17.  权利要求1的应用，其中式I的化合物是

其中x如权利要求1所定义，并且有害的作用是糖尿病性视网膜病变。

18.  权利要求1的应用，其中式I的化合物是

其中x如权利要求1所定义，并且有害的作用是非青光眼性的局部缺血。

19.  权利要求1的应用，其中式I的化合物是

其中x如权利要求1所定义，并且有害的作用的性质是微血管病变并且选自下组疾病，所述疾病是结节性多动脉炎，巨细胞血管炎，主动脉炎综合症和全身性红斑狼疮。

(2-咪唑啉-2-基氨基)喹喔啉的制药应用
本申请系申请日为1996年6月17日、申请号为96196328.X、发明名称为“用(2-咪唑啉-2-基氨基)喹喔啉治疗视神经损伤的方法”的发明专利申请的分案申请。
发明背景
本发明涉及保护哺乳动物眼睛的视神经和视网膜免受有害刺激的方法，此有害刺激包括由于青光眼或其它病因因素导致眼内压升高的压迫性(机械的)效应以及供给这些神经的血流受损。
青光眼是一种特征为眼内压升高的眼睛疾病。按病因分类，青光眼可分为原发性及继发性。进一步地，成人的原发性青光眼可以是慢性开角型或慢性闭角型。继发性青光眼由先于其存在的眼睛疾病如色素膜炎，眼内肿瘤或增大的白内障所致。
原发性青光眼的根本原因尚不很清楚。眼内压的升高是由于阻塞或房水外流。在慢性开角型青光眼，前房角及其解剖结构显示正常，但房水引流有障碍。在急性和慢性闭角型青光眼，前房角浅，滤过角狭窄，虹膜可能在Schlemm管的入口外阻塞了小梁网络。瞳孔扩大可能推动虹膜根部进一步压迫房角，或可能产生瞳孔的阻滞，因此出现急性发作的眼内压升高。前房角狭窄的眼易于出现各种严重程度的急性闭角型青光眼发作。
继发性青光眼是由于对房水自后房角至前房角，并随之至Schlemm管流动的任何干扰所致。
眼前部的炎症性疾病可能引起虹膜“隆起部位”(bombe)内完全性后虹膜粘连而阻碍房水外流，并且渗出物可能堵塞引流通道。其它常见的原因有眼内肿瘤，增大的白内障，腹侧视网膜静脉闭塞，眼部创伤，手术操作及眼内出血。
将所有类型考虑在一起，在所有40岁以上的人中约2％发生青光眼，并且在进行性并到迅速视力丧失之前的许多年可以是无症状的。在无外科手术适应症的情况，局部用β-肾上腺素受体拮抗剂是治疗青光眼的选择药物。然而，α-肾上腺素能激动剂正等待批准用于治疗眼内压升高，且一旦它们得到应用，将可能成为治疗这种病的主力。
具有α₂激动剂活性的各种喹喔啉衍生物已被建议作为治疗剂，例如Danielewicz等，美国专利第3,890,319和4,029,792号。他们公开了作为心血管系统调节剂的化合物，它具有如下通式：

其中2-咪唑啉-2-基氨基基团可在喹喔啉母核的5-、6-、7-或8-位置的任何一位；x、y和z可在剩余的5-、6-、7-或8-位置的任何一位且可选自氢、卤素、低级烷基、低级烷氧基或三氟甲基；R是在喹喔啉母核的或2-或3-位置的任意取代基并且可以是氢、低级烷基或低级烷氧基。目前有用的化合物可按照Danielewicz等提出的步骤制备。美国专利第3,890,319和4,029,792号的内容被在此全部收载作为参考。
在“相对选择性α-2激动剂(UK-14，304-18)对猫、兔和猴的眼部效应”〔J.A.Burke，等，Current Eye Rsrch 5，(9)，pp 665-676(1986)〕中，喹喔啉衍生物对降低兔、猫和猴的眼内压显示有效。此研究中的化合物被局部应用于所研究动物的眼。

很早就已知青光眼的后遗症之一是对视神经头的损伤。此损伤，被称为“杯状陷凹形”或“cupping”导致视盘的神经纤维区域机能降低。由于此cupping所致的视力丧失是进行性的，且如果此疾病未得到有效的治疗则会致盲。
然而不幸的是，应用药物或外科手术促进房水外流而降低眼内压并不总能有效地避免青光眼状况对神经的损伤。这个明显的矛盾由Cioffi和Van Buskirk〔眼科学研究，38，增刊，p.S107-16，讨论S116-171994年5月〕在文章“前眼神经的微血管系统”中谈到。摘要说明：
青光眼的传统定义是眼内压(IOP)升高的异常，使得临床状况过分简单化。一些青光眼病人从未具有高于正常的IOP，而另一些病人尽管最大限度降低IOP仍继续发生视神经损伤。在青光眼病因学中的其它可能因素是前眼神经局部微血管系统的调节。相信微血管因素是重要的一个理由是许多微血管疾病与青光眼视神经病变有关。
继Cioffi等之后，Matusi发表了关于“系统性血管炎的眼科学改变”〔Nippon Rinsho，52(8)，p.2158-63，August 1994〕的文章进一步支持许多微血管疾病与青光眼视神经病变有关的观点。摘要说明：
全身性血管炎如结节性多动脉炎，巨细胞小血管炎和主动脉炎综合症的眼部表现已被评述。全身性红斑狼疮未分类为全身性血管炎，然而它的眼部表现是微血管病变。因此其眼部表现的评述亦包括在本文中。这些疾病最常见的眼底发现是局部缺血性视神经病变或视网膜血管闭塞。因此一些关于视神经病变和视网膜及脉络膜血管闭塞的诊断或发病机理的观点得到讨论。由于荧光素血管造影被应用于这些疾病，脉络膜局部缺血已经能够临床诊断。当脉络膜动脉闭塞时，压在上面的视网膜色素上皮细胞将受到损伤。此导致上皮细胞的屏障功能受损，并使得来自脉络膜血管系统的液体能够进入感光层下的视网膜空间。这是浆液性视网膜脱离的发病机理。视网膜动脉闭塞形成了无灌注视网膜。此缺氧的视网膜释放血管形成因子，它刺激视网膜和虹膜新生血管形成，而虹膜新生血管形成可能造成新生血管性青光眼。
B.Schwartz在“眼科高血压和高压性开角型青光眼中视盘和视网膜的循环缺陷”〔Surv.Ophthalmol.，38，Suppl.pp.S23-24，1994年5月〕一文中讨论了与青光眼进展有关的进行性视神经和视网膜缺陷的治疗，他说明：
荧光素缺陷与视野丧失及视网膜神经纤维层丧失显著相关。其次的循环缺陷是视网膜血管，特别是视网膜静脉内荧光素流量的下降，以致于年龄越大，舒张期血压越高，眼压及视野丧失越大，流量就越小。视盘和视网膜循环缺陷均发生于未治疗的眼压过高的眼。这些观察表明视盘和视网膜循环缺陷发生于眼压过高和开角型青光眼，且随疾病的进展增加。
因此，显然有着不能满足的对一种药物的需要，这种药物具有眼内神经保护作用，它能够阻止或延缓青光眼或其它眼科疾病导致的神经的进行性损伤。
发明概要
一种保护哺乳动物眼睛的视神经和视网膜免受青光眼和其它有害刺激伤害的新方法已被发明。此方法包括应用于哺乳动物或者全身性或者球内注射有效剂量的一种或多种某些芳香基-亚氨基-2-咪唑烷(如在此定义)，其盐类和其混合物。当用作预防性治疗时，此新方法尤其有效，即用在神经损伤发生之前，或用在疾病如青光眼的长期进展已经发生之前。
发明的详细描述
首先对图作简短的描述。
图1是自谷氨酸治疗的天数绘制的直方图，显示细胞被谷氨酸处理后杀死的百分率。包括未用谷氨酸处理的对照以测定未用任何这种处理时发生的细胞死亡。还显示的有用AGN 191103和谷氨酸处理后，及用MK-801和谷氨酸处理后的测定结果。MK-801是本领域熟知的神经保护制剂。在谷氨酸；AGN 191103+谷氨酸；和MK-801+谷氨酸直方柱下面的数据显示用于各个例子的谷氨酸和药物的浓度。在第8天，在保护细胞免受谷氨酸诱导的神经毒性方面，AGN 191103和MK 801显示了类似的效应。产生此图的数据的实验步骤详见实施例1。
图2显示测量的视神经纤维复合动作电位(CAP)图：在左手的图框内，测定于损伤后2周(即，神经压碎后)，用AGN 191103治疗的视神经(上面的线)和用作对照的未治疗的神经(下面的线)；在右手的图框内，为未损伤视神经的对照CAP。在每个图框中给出了图的标度。损伤后的图横座标标度是未损伤图标度的25×(单位：毫伏和毫秒)。复合动作电位的值以每一曲线下面积的积分计算。曲线的不规则性是复合反应分散的特征；一些神经细胞传导较其它更为迅速，因此测量电压的振幅随时间而变化。
图3是以微伏(μV)表示的细胞最大CAP振幅的直方图，这些细胞是大鼠视神经压碎而损伤并用以下治疗：1)单用赋形剂；2)可乐定和3)AGN 191103。每种药物以四种不同的浓度试验(用作被试验对象体重的倍数)并以图中的直方柱表示。可乐定以其已被非常明确的药理学作用被选为标准α₂激动剂化合物，与被试验化合物AGN 191103相比较，但是当可乐定较单用赋形剂相比的确显示一些神经保护活性时，它只显示AGN 191103最大CAP反应的约一半值。
图4是视觉激发性电位反应的曲线图，并显示了作为视觉(光)刺激的结果在视觉脑皮质的表明激发的电的电位活性(类似于脑电图)。此试验在活的大鼠进行并且是整个视觉系统的完整性的测量，即自视网膜经过视神经进入双侧膝状核并最后进入位于脑后部的神觉脑皮质的整个视觉系统。左手的图框显示无神经压碎损伤的反应，右手的图框显示于损伤后2周测量的用AGN 191103治疗的大鼠的反应，为上面的线(标为阳性)，及神经压碎前对照大鼠的反应，为下面的线(标为阴性)。两张图均以μV对毫秒标度，显示于纵座标轴下方。
关于神经压碎模型及其在评价神经损伤和修复中它的重要性的讨论及文献目录参见：“视神经损伤后的功能修复及形态学变化”，Sabel，B.A.和Aschoff.A.，神经精神生物学28.pp.62-65(1993)。
哺乳动物视神经的损伤，如同哺乳动物中枢神经系统(CNS)的任何其它部位，致使轴突的变性及随后细胞体丧失，轴突自幸存的神经元不能再生。起初，损伤的神经的变性可能归因于直接的神经元损伤。然而，损伤后立即发生于神经中的有关生理和生化事件可能对随后的进行性变性有作用，不仅是对直接损伤的轴突，而且是对那些避开了初次的损伤而且在更大程度上决定了长期功能的后果。
立即的损伤诱导反应极大地影响了随后的变性反应。因此减少或减弱立即反应的治疗似乎是达到最理想的预防或延缓继发的变性过程。为了监测立即反应，显然优选应用非侵入性的技术。修正的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)监测技术使得能够测定最早期的创伤后事件，已被证明是有价值的非侵入性方法。此技术的应用使损伤的立即反应能够在真实时间内得到评价并在活体成年大鼠视神经遭到仔细控制的压碎损伤之前和之后进行的评价。在此实验范例中，损伤的视神经代谢活性的测定代表了损伤的轴突和它们相关的非神经元细胞的活性，因此等于评价了应付损伤性应激反应的潜在能力。此模型还可用于各种试剂的活性的监测，这些试剂可以克服或缓解来自于此类应激反应的神经细胞损伤或死亡。
在局部缺血性事件能够被完全排除的情况下，最早期的损伤诱导反应是神经的能量状态减少。能量状态的减少可能涉及：1)游离脂肪酸水平在损伤后升高，这可能干扰线粒体功能并导致电子转运的解偶联；和2)细胞内游离Ca²⁺水平显著升高。已知轴突的损伤通常随后出现细胞外钾离子的升高，它通过电压敏感通道(L，T或N型)或受体-操纵的Ca²⁺通道，刺激了Ca²⁺的摄取。细胞内游离Ca²⁺的显著升高能加速不利于细胞生存的过程，包括那些涉及Ca²⁺依赖性的酶，主要是脂酶，蛋白酶和核酸内切酶的过程，这可能引起线粒体损伤并最后导致细胞死亡。为了克服这些事件，细胞需要更多的能量以便主动地恢复离子的内环境稳定。在损伤部位由于线粒体功能障碍所致的增加的能量需求和减少的能量保存的组合可能是损伤后随之发生的不同逆性神经损伤及神经变性的主要原因。因此对代谢活性的早期测定能够提示轴突，与其相关的神经胶质细胞和它的非神经元细胞体的命运。从上述可得出，在预防损伤后神经发生变性中，线粒体活性的恢复可能是关键性的。
由于在神经压碎模型中，加在神经上的损伤是良好控制的，校准过的和可重复的损伤，因而有可能将早期创伤后代谢缺损和通过药物或其它治疗可能将其减轻，与长期的形态学的及生理学的效应相联系。
从前面的图及讨论可见，对于谷氨酸诱导的毒性及在神经压碎模型中的物理损害，显然神经细胞是得到了神经保护。
现已发现，在视神经细胞受到损伤前或之后但在细胞死亡之前的时期内，将式I的药物施用于哺乳动物的视神经和/或视网膜，视神经细胞得到了神经保护。

式I
其中，2-咪唑啉-2-基氨基基团可以在喹喔啉母核的5-或6-位；x、y和z可在剩余的5-、6-、7-或8-位的任一位置并且是选自氢，卤素，低级烷基，低级烷氧基或三氟甲基；R是在喹喔啉母核的2-或3-位的任意取代基且可能是氢，低级烷基或低级烷氧基。
定义
鉴定为AGN 191103的化合物具有所示的化学结构：

其化学名称为6-甲基-(2-咪唑啉-2-基氨基)喹喔啉。
鉴定为MK-801的神经保护剂称之为地佐环平并具有以下化学结构：

在第11版Merck索引专题第3392号中有附加的鉴定和描述。
人的剂量和施用
本发明的方法可用于治疗任何哺乳动物，包括人类。
按照本发明，哺乳动物用药学有效量的神经保护剂治疗一段时间，并在对视神经和视网膜的毒性刺激没有杀死或未永久性损伤神经细胞的时候使用。保护剂可以口服或应用下面描述的或本领域熟知的任何合适的给药方法。
按照本发明，药学有效剂量的保护剂可单独给药以治疗神经损伤或预防神经细胞死亡。或者，保护剂可与抗青光眼药物顺序地或同时使用，如与β-阻滞剂，α₂-激动剂，绳覃碱类制剂如毛果芸香硷，碳酸酐酶抑制剂(CAI)，或其它用于维持眼内压(IOP)于正常水平或降低升高的IOP的药物。保护剂最有效的给药方式和剂量程序取决于欲治疗的疾病类型，该疾病病程和严重程度，先前的治疗，病人的健康状态，对药物的反应以及治疗医师的判断。一般地说，神经保护剂应该给药的剂量为达到血清或玻璃体内浓度为0.01nM至50nM。优选神经保护剂在神经损伤前使用，但也可在损伤发生后使用，效果较差。
可以应用保护剂，如MK-801的常规给药方式及标准剂量程序，与其他药物，如一种IOP降低药，与神经保护剂，合并给药的最佳剂量，可用本领域熟知的方法决定。基于与神经保护剂同时给药的药物的剂量和病人对疗程的反应，可按具体病人调整神经保护剂的剂量。也可将保护剂在一定时间或经一系列治疗期间给药于病人。
不能通过血/脑屏障的试剂，如MK-801，可局部给药，如通过眼球内注射至玻璃体内，或鞘内应用。能够通过血/脑屏障的试剂，如AGN 191103可以全身性给药，如口服，静脉内；或注射。
这些疗法中应用的组合物也可以是多种形式。它们包括，例如，固体，半固体，和液体剂量形式。如片剂，丸剂，粉剂，液体溶液或悬浮剂，脂质体，栓剂，可注射和输注溶液。组合物还优选包括本领域技术人员熟知的常规的可供药用的载体。
下列非限制性的实施例描述了分析和测定。用于1)测定保护神经细胞免于谷氨酸诱导的毒性和2)在机械损伤的神经压碎模型中，测定神经保护剂给予的神经保护作用的方法。
实施例1：
在谷氨酸诱导的神经细胞兴奋中毒效应的模型中测定神经保护作用的实验方法：
低密度大鼠海马神经元的培养物是用Goslin和Banker的方法制备的。盖片在瓷制架中清洗和灭菌以使它们不相互粘连(Cohen盖玻片染色架，Thomas Scientific)盖片(13mm)被置于染色架中，用蒸馏水冲洗(四次冲洗，每次1分钟)以除去灰尘并转移至浓HNO₃中36小时。盖片于蒸馏水中冲洗(四次换水，3小时以上)并用干热灭菌(225℃过夜)将盖片转移至24-孔板上，每孔一个盖片。在共培养时，为支撑在神经胶质上的盖片，在置入盖片前将石蜡点置于板上，并用uv照射(30分钟)。将1mg/ml聚-L-赖氨酸氧溴酸盐(PLL)(Sigma)(MW 30,000-70,000)溶解于硼酸缓冲液中(0.1M，pH8.5)，过滤，灭菌并用于覆盖每个盖片过夜。除去PLL，盖片用蒸馏水冲洗(冲洗两次，每次2小时)，加入平板培养基〔Eagle′s  MEM与Earle′s的盐，它含有额外的葡萄糖(600mg/L)和10％马血清〕并将板贮存于孵育器中。星形神经胶质培养物制备自新生大鼠的脑，系用类似于Levinson和Mc Carthy描述的方法，只是它们以较低的密度铺平板接种以便它们主要含有I型星形神经胶质。每孔平板接种10⁵细胞。神经胶质培养物饲以平板培养基每周两次并在接种后约2周达到融合后使用。使用前一天，除去平板培养基，加入神经元维持培养基(MEM含有N₂补充物)，并继续孵育。3×104有活力的大鼠海马神经(E18胚胎)被平板接种于PLL-处理的保存于平板培养基中的盖片上。3-4小时后，当大部分神经元附着后，将盖片转移至含有在维持培养基中神经胶质细胞的器皿中，且让神经元一边面对神经胶质，神经胶质支持神经元的生存和生长。为减少神经胶质增殖，在平板接种后2天于培养物中加入阿糖胞苷(1-β-D-阿糖呋喃胞嘧啶)(Calbiochem)(5×10M终浓度)。于培养第6天，用1mM谷氨酸或用谷氨酸与或者AGN-191103-0.1nM(MW＝200)或者MK-801-10nM一起处理细胞(每种处理用2-3个盖片)。
孵育24小时后，用台盼蓝行细胞染色。随机选择培养物视野(每个盖片5个视野)计数活的和死的神经元。计算死亡细胞百分数。
实施例2
神经压碎损伤和测量损伤后复合动作电位(CAP)的方法
A部分。
代谢测定
所用动物按照关于研究动物的应用的ARVO决议。雄性Sprague-Dawley(SPD)大鼠，体重300-400g用戊巴比妥钠麻醉(腹腔内，35mg/kg)。气管内插入插管以备需要时人工通气。将动物的头用头架固定于一定位置，于双目操作显微镜下行侧面眦切开术且结膜被侧面切开至角膜。分离眼球收缩肌后，确定视神经且行钝性分离自近眼球处暴露303.5mm长度。保留硬膜完整并注意不要损伤神经。光导装置架(见下文)的第一部分被插入视神经下方并且将视神经轻轻释放入光导管道内。然后将第二部分固定于一定位置，以使光导装置位于距视神经将要被损伤处的1mm视神经表面。
表面荧光光度测定-反射系数测定
线粒体内NADH氧化-还原状态的监测是基于NADH于366nm处的荧光，导致发射出峰强度在450nm的蓝光，它不同于它的氧化形式，NAD+，后者缺乏此荧光。366nm激发的来源是100-W空气冷却的用强366nm滤器装备的Coroing 5860(7-37)加9782(4-96))水银灯。柔韧的Y形光学纤维束(光传导)用于传送到达或来自视神经的光，因此使得体内测定在技术上可行。激发光通过激发纤维束传送至神经。发射自神经的光，在传送通过第二纤维束后，分开为90∶10的比例量，以测定在450nm的荧光(90％)和在366nM的反射光(10％)，它是通过连接于一通道直流电荧光计-反射计的二个光电倍增管进行的，为减小动物间的变异，在记录开始时应用标准信号校正程序。实验中荧光和反射信号的变化按相对于校正的信号计算。此种类型的校正，尽管不是绝对值，然而在各种动物和不同的实验室已发现产生了可靠的和可重复的结果。
继发于动脉血压和神经容量改变的血流动力学效应和视神经运动导致的组织吸收值的改变是与反射光的改变相互关连。荧光测定值发现可被适当修正为NADH氧化-还原状态测定值，这是通过将荧光中减去反射光(366nm)(1∶1比例)以获得修正的荧光信号。
代谢测定
将仍然麻醉状态的动物在30分钟从上述的外科步骤复苏，然后暴露于缺氧和多氧条件。通过让大鼠在100％氮气中呼吸两分钟达到缺氧状态，之后将其返回空气中。当动物未自动恢复至正常呼吸时，通过向气管内吹气两次进行通气。多氧状态是通过让动物在100％氧中呼吸6-10分钟诱发的。为评价视神经的代谢活性，在压碎损伤前后，测定了对缺氧和多氧的反应引起的反射光和荧光强度的相对变化。
代谢测定的实验方案
用校正的交叉作用(cross-action)镊子，在眼和光传导架之间的神经上进行仔细校正的适度的压碎损伤，相应压力为120g 30秒钟。
B部分
生理学测定
记录复合动作电位(CAP)的实验
在去除视神经行电生理测定之前，大鼠以70mg/kg戊巴比妥深度麻醉。自颅骨去除皮肤，自眼球分离视神经。行次全断头术并用咬骨钳打颅骨。大脑移置侧面，暴露视神经的颅内部分。在交叉水平分离使能够切除全部长度的神经，并将它转移至装有新鲜冷Krebs溶液的玻璃瓶中。Krebs溶液含有：NaCl(125mM)，KCl(5mM)，KH₂PO₄(1.2mM)，NaHCO₃(26mM)，MgSO₄(0.6mM)，CaCl₂(24mM)D-葡萄糖(11mM)，用95％O₂和5％CO₂通气。神经保存在此溶液中，在其中电活性将至少3-4小时保持稳定。1小时恢复后，将神经于37℃浸入Krebs溶液中。在矩压碎损伤的远端神经处获得电生理记录，由于神经太小，不允许在压碎的两侧进行测定。然后将神经末端连接于浸在浴液中的两个吸入Ag-AgCl电极。经近端的电极应用刺激脉冲并经远端电极记录动作电位。Grass SD9刺激器用作电刺激(2V，50μs)。信号被传递至Medelec PA63前置放大器并由此到Medelec MS7肌电图仪和AA7T放大器。溶液，刺激器和放大器有共同的基座。8个平均的CAPs的最大波幅用波拉罗伊德(Polaroid)照相机记录和照像。剩余的神经(未损伤的)用于测定正常神经的参考值并校正用以压碎的镊子。
视觉激发性电位(VEP)反应的记录
损伤的用药物治疗的大鼠于损伤后2周检查，评价其功能恢复。在此组实验中，从初级视觉脑皮质记录了对光刺激反应引起的纵行电位图形。电位被来源于视网膜的光激发并延着存活的轴突传播到达它们的最终目标，视觉皮质。只有那些在初级及次级变性过程中存活下来的轴突能够传导动作电位。对治疗的及未治疗的动物的场电位图形的比较分析，将揭示治疗对轴突存活的作用。
将麻醉的大鼠(Rumpon，Ketalar)置于一小的动物sterotaxic仪器中。暴露颅骨后，用圆柱形钻头钻两个孔，并保持硬膜完整以减小皮质损伤。一个孔，钻于鼻骨上方，用作参考点。第二个孔在OC1区域，坐标为前颅#8mm，侧面#3mm。连接于螺丝钉的金触针被用作电极，它被拧紧在孔中并用丙烯酸粘接剂胶粘于颅骨。场电位用频闪仪刺激激发，平均每分钟90扫描。通过应用Lab View数据收集和处理系统分析闪光-激发性电位。场电位被数字化并贮存行脱机分析。
C部分
检测神经保护性质的药物效果的测定
第一组的实验包括代谢测定。每种药物以7种不同的浓度腹腔内注射。每组药物在一组8只动物中检测，同时有8只对照(损伤的动物预缓冲赋形剂处理)。在各个例中，于损伤前，损伤后0.5小时和以后的4-6小时的每一小时进行线上的代谢测定。获得的数据用ANOVA分析。
长期效果的测定。生理学活性
CAPS
损伤后即刻将待检测的药物注射于10只动物，并用赋形剂注射10只对照动物。二周后每个神经的CAPs被体外记录，用吸入电极。对侧的一边用作内部对照。结果表明被检测的药物是否对挽救剩余的轴突和/或延缓变性具有任何电位效应。阳性结果将导致继续对各个有前途药物测定最佳剂量。
VEP效应
于两组年龄-和性别-匹配的首次用作实验的SPD大鼠的皮质内植入电极。植入后即刻，当光线闪烁于右眼而左眼被覆盖时，左侧记录VEP效应。然后在视神经上进行仔细控制的压碎损伤，并将预先已确定的最佳剂量的药物立即施用。对照动物以相同的方法处理，只是施用赋形剂而不是药物。每只动物的VEP效应于手术后1天，1周、2周和4周记录。
虽然本发明已通过各种具体实施例和实施方案进行描述，应理解到本发明不限于此，而只应通过所附权利要求书的范围的阐述来解释。