山豆根多糖硫酸酯的制备方法及该方法制得的山豆根多糖硫酸酯.pdf

本发明公开了一种主要用于抗乙型肝炎病毒(HBV)活性的山豆根多糖硫酸酯的制备方法。该方法包括酯化试剂的制备、山豆根多糖悬浮液的制备、酯化反应、脱氨和纯化等步骤后制得山豆根多糖硫酸酯。本发明方法通过对山豆根多糖进行硫酸化的修饰，基于其硫酸根具强负电荷，能与病毒分子结合而阻断病毒对细胞的吸附，从而抑制病毒的反向转录酶(RT)；另一方面，硫酸根聚阴离子与受体细胞表面的正电荷分子结合，干扰病毒对受体细胞的吸附，消除病毒引起的细胞病变，从而使药物保存原多糖功能的同时，增强了其抗病毒的疗效。本发明还涉及

1.  山豆根多糖硫酸酯的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)酯化试剂的制备：按照体积比吡啶∶氯磺酸＝10∶(2～3)分别量取吡啶和氯磺酸；将附有冷凝装置和搅拌装置的容器置于冰浴中，加入吡啶，剧烈搅拌下缓慢滴加氯磺酸，继续搅拌20～50分钟，得到酯化试剂；
(2)山豆根多糖悬浮液的制备：按照质量比山豆根多糖粉末∶N，N-二甲基甲酰胺＝(0.5～1.5)∶(40～45)称取山豆根多糖粉末和N，N-二甲基甲酰胺，将山豆根多糖粉末悬浮于N，N-二甲基甲酰胺中，得到山豆根多糖悬浮液；
(3)酯化反应：按照体积比酯化试剂∶山豆根多糖悬浮液中的N，N-二甲基甲酰胺＝(25～35)∶70量取酯化试剂，将山豆根多糖悬浮液缓慢加入到酯化试剂中，于50～70℃水浴下搅拌反应2～5小时；
(4)脱氨：待反应溶液冷却至室温，用浓度为2.0～4.0mol/L NaOH中和至pH值为6～8后，反应液减压蒸馏，除去吡啶、N，N-二甲基甲酰胺和水，残留物加蒸馏水溶解，然后在搅拌下缓慢加入95％乙醇至含醇量达70％～80％，析出沉淀，静置12～24小时，离心分离得到沉淀物；
(5)纯化：将沉淀物溶于蒸馏水中，流动水透析48～72小时，蒸馏水透析12～24小时，得到除去小分子杂质后的水溶液，搅拌下缓慢加入95％乙醇至含醇量达70％～80％，析出沉淀，静置12～24小时，离心，收集沉淀物，冷冻干燥，得山豆根多糖硫酸酯。

2、  权利要求1所述方法制得的山豆根多糖硫酸酯。

山豆根多糖硫酸酯的制备方法及该方法制得的山豆根多糖硫酸酯
技术领域
本发明涉及一种主要用于抗乙型肝炎病毒(HBV)活性的多糖硫酸酯的制备方法，具体涉及的是对山豆根多糖(山豆根水提多糖与山豆根碱提多糖)进行硫酸酯化修饰制备山豆根多糖硫酸酯的方法。本发明还涉及上述方法制得的山豆根多糖硫酸酯。
背景技术
山豆根始载于唐《开宝本草》，来源于豆科槐属植物越南槐Sophoratonkinensis Gapnep.的干燥根及根茎，其运用历史已超过1100年。山豆根以广西产量最大、产品质量最佳，故有“广豆根”之称。山豆根味苦性寒，有毒。归肺、胃经。具有清热解毒，消肿利咽的功效。常用于火毒热结、咽喉肿痛、齿龈肿痛、肺热、咳嗽、肿瘤、皮肤病的治疗。近年来，临床上用于治疗肝炎伴有脾胃湿热、黄疸、谷丙转氨酶高等症状明显的患者有显著疗效。处方中常用山豆根配伍五味子、垂盆草、龙胆、黄芩、蒲公英等清热解毒类中药。药理实验和临床用药表明，山豆根的降酶作用疗效可靠，反跳率低，且对乙肝DNA-P有较强的抑制作用，运用前景十分广阔。
山豆根含有黄酮、生物碱、皂苷、多糖类等化学成分，具有抗心律失常、抗肝炎、消炎等生理活性。近年来，对山豆根的研究开发多集中在其所含的生物碱部分，如山豆根制剂肝炎灵注射液常用于慢性乙型肝炎的临床治疗，其主要活性成分是苦参碱、氧化苦参碱。然而，当前研究发现山豆根中多糖类成分能抑制HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg，促进B淋巴细胞增殖，具有免疫抑制和良好的抗HBV作用。
慢性乙型肝炎在世界上导致死亡的病因中列居第10位，有约3.5亿的人口感染(终生感染)。另外，世界上80％的原发性肝癌是由慢性乙型肝炎引发的，每年大约有120万人死于与慢性乙型肝炎有关的肝病。中国是全世界感染乙型肝炎病毒人数最多的国家，大约有1.2亿人(占总人口的9.8％)，其中有3000万为慢性感染者。
临床验证，西药中抗HBV药物干扰素、核苷类似物和免疫调节剂显示出良好的治疗作用，但多数停药后复发率高，且毒副作用较多。多糖是一种良好的的中药活性成分，能调节机体的免疫功能，具有防衰老、防癌、抗癌、抗肝炎等作用，临床上已用于癌症辅助治疗以及用于治疗肝炎。目前用于治疗病毒性乙型肝炎的中药有：苦参素、香菇多糖、猪苓多糖、肝炎灵注射液等。自1987年发现硫酸酯化葡聚糖可抑制艾滋病病毒(HIV)的活性以来，人们对硫酸酯化多糖(SPS)或称多糖硫酸酯(PSS)产生了极大的兴趣。有些本身不具有抗病毒活性的多糖，经过化学修饰得到其硫酸酯化多糖，从而具有抗病毒活性，这类人工合成的硫酸酯化多糖有：硫酸化右旋糖酐、硫酸化香菇多糖、硫酸化猪苓多糖、硫酸化黄芪多糖、硫酸化当归多糖等。
目前国内外尚无文献报道有关山豆根多糖硫酸酯的合成及对山豆根多糖生物活性影响的研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于对山豆根多糖进行硫酸化的修饰，并提供一种生物活性强的山豆根多糖硫酸酯的制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明提出的山豆根多糖硫酸酯的制备方法，包括如下步骤：
(1)酯化试剂的制备：按照体积比吡啶∶氯磺酸＝10∶(2～3)分别量取吡啶和氯磺酸；将附有冷凝装置和搅拌装置的容器置于冰浴中，加入吡啶，
剧烈搅拌下缓慢滴加氯磺酸，继续搅拌20～50分钟，得到酯化试剂；
(2)山豆根多糖悬浮液的制备：按照质量比山豆根多糖(山豆根水提多糖或山豆根碱提多糖)粉末∶N，N-二甲基甲酰胺＝(0.5～1.5)∶(40～45)称取山豆根多糖粉末和N，N-二甲基甲酰胺，将山豆根多糖粉末悬浮于N，N-二甲基甲酰胺中，得到山豆根多糖悬浮液；
(3)酯化反应：按照体积比酯化试剂∶山豆根多糖悬浮液中的N，N-二甲基甲酰胺＝(25～35)∶70量取酯化试剂，将山豆根多糖悬浮液缓慢加入到酯化试剂中，于50～70℃水浴下搅拌反应2～5小时；
(4)脱氨：待反应溶液冷却至室温，用浓度为2.0～4.0mol/L NaOH中和至pH值为6～8后，反应液减压蒸馏，除去吡啶、N，N-二甲基甲酰胺和水，残留物加蒸馏水溶解，然后在搅拌下缓慢加入95％乙醇至含醇量达70％～80％，析出沉淀，静置12～24小时，离心分离得到沉淀物；
(5)纯化：将沉淀物溶于蒸馏水中，流动水透析48～72小时，蒸馏水透析12～24小时，得到除去小分子杂质后的水溶液，搅拌下缓慢加入95％乙醇至含醇量达70％～80％，析出沉淀，静置12～24小时，离心，收集沉淀物，冷冻干燥，得山豆根多糖硫酸酯。
本发明对山豆根多糖进行硫酸化的修饰，基于其硫酸根具强负电荷，能与病毒分子结合而阻断病毒对细胞的吸附，从而抑制病毒的反向转录酶(RT)；另一方面，硫酸根聚阴离子与受体细胞表面的正电荷分子结合，干扰病毒对受体细胞的吸附，消除病毒引起的细胞病变，从而使药物保存原多糖功能的同时，增强了其抗病毒的疗效。
附图说明
图1为山豆根水提多糖与山豆根水提多糖硫酸酯的红外光谱对照图(图中：1为山豆根水提多糖，2为山豆根水提多糖硫酸酯)。
图2为山豆根碱提多糖与山豆根碱提多糖硫酸酯的红外光谱对照图(图中：1为山豆根碱提多糖，2为山豆根碱提多糖硫酸酯)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。
1.实验仪器：恒温水浴锅(上海医疗器械五厂)、玻璃棒、烧杯(500ml)、量筒(1000ml)、烘箱、分析天平、温度计、透析袋、移液管、吸管、三颈瓶、恒压式筒形分液漏斗、搅拌机、台式离心机(TDL-5-A Centrifuge)、旋转蒸发仪(Buchi Rotavavor R-210)、循环水真空泵(上海东玺制冷仪器设备有限公司)、超声波清洗仪、傅立叶变换红外光谱仪。
2.实验试剂：吡啶、氯磺酸、95％乙醇、氢氧化钠、蒸馏水(以上试剂均为分析纯)。
3.山豆根多糖的鉴定：
α-萘酚-浓硫酸反应(Molisch反应)：分别在山豆根多糖与山豆根碱提多糖的水解溶液中加入10％α-萘酚乙醇溶液，然后沿着器壁滴加浓硫酸，使酸层集于下层，多糖类在此条件下水解成单糖，并于两液层交界处呈现紫色环。本实验中山豆根多糖与山豆根碱提多糖都呈正反应，鉴定了山豆根中提取的多糖类成分。
实施例1(山豆根水提多糖硫酸酯的制备)
将附有冷凝管和搅拌装置的250ml三颈瓶置于盐水-冰浴中，加入吡啶50ml，搅拌，充分冷却，用恒压式筒形分液漏斗缓慢滴加氯磺酸10ml，加完后继续搅拌20～50分钟，反应瓶中出现大量淡黄色固体，即得酯化试剂；
将山豆根水提多糖粉末0.80克混悬于70ml DMF中，得山豆根水提多糖悬浮液；
将山豆根水提多糖悬浮液加入到酯化试剂中，然后将三颈瓶移入60℃水浴中，恒温搅拌3小时，移出三颈瓶，冷却至室温，用浓度为2.5mol/LNaOH中和至PH值为6～8；
中和后的反应液减压蒸馏除去吡啶、DMF、水至干，残留物加蒸馏水400mL溶解，然后在搅拌下缓慢加入95％乙醇至含醇量达75％，析出沉淀，静置24小时，离心分离得到沉淀物；
将沉淀物溶于400ml蒸馏水中，流动水透析72小时，蒸馏水透析12小时，得到除去小分子杂质后的水溶液，搅拌下缓慢加入95％乙醇至含醇量达75％，析出沉淀，静置24小时，离心，收集沉淀物，冷冻干燥，得山豆根水提多糖硫酸酯0.71克。
用傅立叶变换红外光谱仪对山豆根水提多糖和本实施例制得的山豆根水提多糖硫酸酯进行红外光谱测试，两者的红外光谱对照如图1所示。
由图1可知，通过山豆根多糖与山豆根多糖硫酸酯的红外光谱对照分析表明，山豆根多糖硫酸酯除了有多糖母体特征吸收峰，增加了1240cm^-1左右的吸收峰，表明OSO₃^-的S＝O伸缩振动，810cm^-1左右的吸收表明C-O-C的伸缩振动，这些都是硫酸键的特征吸收峰。同时，还可以看出山豆根多糖硫酸酯在3392cm^-1附近的羟基吸收峰有所降低，表明部分羟基已经被酯化，以上充分说明山豆根多糖已经形成山豆根多糖硫酸酯。
实施例2(山豆根碱提多糖硫酸酯的制备)
将附有冷凝管和搅拌装置的250ml三颈瓶置于盐水-冰浴中，加入吡啶50ml，搅拌，充分冷却，用恒压式筒形分液漏斗缓慢滴加氯磺酸10ml，加完后继续搅拌20～50分钟，反应瓶中出现大量淡黄色固体，即得酯化试剂；
将山豆根碱提多糖粉末0.83克混悬于70ml DMF中，得山豆根碱提多糖悬浮液；
将山豆根碱提多糖悬浮液加入到酯化试剂中，然后将三颈瓶移入60℃水浴中，恒温搅拌3小时，移出三颈瓶，冷却至室温，用浓度为2.5mol/LNaOH中和至PH值为6～8；
中和后的反应液减压蒸馏除去吡啶、DMF、水至干，残留物加蒸馏水400mL溶解，然后在搅拌下缓慢加入95％乙醇至含醇量达75％，析出沉淀，静置24小时，离心分离得到沉淀物；
将沉淀物溶于400ml蒸馏水中，流动水透析72小时，蒸馏水透析12小时，得到除去小分子杂质后的水溶液，搅拌下缓慢加入95％乙醇至含醇量达75％，析出沉淀，静置24小时，离心，收集沉淀物，冷冻干燥，得山豆根碱提多糖硫酸酯0.68克。
用傅立叶变换红外光谱仪对山豆根碱提多糖和本实施例制得的山豆根碱提多糖硫酸酯进行红外光谱测试，两者的红外光谱对照如图2所示。
由图2可知，通过山豆根多糖与山豆根多糖硫酸酯的红外光谱对照分析表明，山豆根多糖硫酸酯除了有多糖母体特征吸收峰，增加了1240cm^-1左右的吸收峰，表明OSO₃^-的S＝O伸缩振动，810cm^-1左右的吸收表明C-O-C的伸缩振动，这些都是硫酸键的特征吸收峰。同时，还可以看出山豆根多糖硫酸酯在3392cm^-1附近的羟基吸收峰有所降低，表明部分羟基已经被酯化，以上充分说明山豆根多糖已经形成山豆根多糖硫酸酯。
实施例3(山豆根水提多糖硫酸酯的制备)
将附有冷凝管和搅拌装置的250ml三颈瓶置于盐水-冰浴中，加入吡啶60ml，搅拌，充分冷却，用恒压式筒形分液漏斗缓慢滴加氯磺酸20ml，加完后继续搅拌20～50分钟，反应瓶中出现大量淡黄色固体，即得酯化试剂；称取山豆根水提多糖粉末1.0克直接加入到盛有酯化试剂的三颈瓶中，然后将三颈瓶移入70℃水浴中，恒温搅拌2小时，移出三颈瓶，冷却至室温，将反应液倒入300mL冰水中，用浓度为2.5mol/LNaOH中和至PH值为6～8；中和后的反应液在搅拌下缓慢加入95％乙醇至含醇量达75％，析出沉淀，静置24小时，离心分离得到沉淀物；将沉淀物溶于400ml蒸馏水中，流动水透析72小时，蒸馏水透析12小时，得到除去小分子杂质后的水溶液，搅拌下缓慢加入95％乙醇至含醇量达75％，析出沉淀，静置24小时，离心，收集沉淀物，冷冻干燥，得山豆根水提多糖硫酸酯0.88克。
实施例4(山豆根碱提多糖硫酸酯的制备)
将附有冷凝管和搅拌装置的250ml三颈瓶置于盐水-冰浴中，加入吡啶60ml，搅拌，充分冷却，用恒压式筒形分液漏斗缓慢滴加氯磺酸20ml，加完后继续搅拌20～50分钟，反应瓶中出现大量淡黄色固体，即得酯化试剂；称取1.0克山豆根碱提多糖粉末加入到盛有酯化试剂的三颈瓶中，然后将三颈瓶移入70℃水浴中，恒温搅拌2小时，移出三颈瓶，冷却至室温，将反应液倒入300mL冰水中，用浓度为2.5mol/LNaOH中和至PH值为7；中和后的反应液在搅拌下缓慢加入95％乙醇至含醇量达75％，析出沉淀，静置24小时，离心分离得到沉淀物；将沉淀物溶于400ml蒸馏水中，流动水透析72小时，蒸馏水透析12小时，得到除去小分子杂质后的水溶液，搅拌下缓慢加入95％乙醇至含醇量达75％，析出沉淀，静置24小时，离心，收集沉淀物，冷冻干燥，得山豆根碱提多糖硫酸酯0.83克。