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本发明涉及用作用于引导组织再生术和修复的医疗器材的支架，其中在支架中纤维直径和孔径之间的关系被断开，由此能够达到细胞附连和增殖所需的小纤维直径以及细胞移行到支架中所需的大孔径。

1.  一种制造聚合物支架的方法，该方法包括以下步骤：
(a)由第一聚合物溶液生成第一组纤维；
(b)由第二聚合物溶液生成第二组纤维，其中将所述第二组纤维散布在所述第一组纤维之间；以及
(c)从所述支架中提取第二组纤维。

2.  根据权利要求1所述的方法，其中所述支架是静电纺丝制成的，并且所述方法包括以下步骤：
(a)由第一分配器沿着靶方向在静电场内分配第一聚合物溶液，以便形成至少一条所述第一聚合物溶液的喷射流；
(b)由第二分配器沿着靶方向在静电场内分配第二聚合物溶液，以便形成至少一条所述第二聚合物溶液的喷射流；
(c)将各个步骤(a)和(b)中产生的至少一条喷射流聚集到靶上以形成聚合物支架；以及
(d)从所述支架中提取由第二聚合物溶液形成的纤维。

3.  根据权利要求2所述的方法，其中将所述第一和第二聚合物溶液同时分配到所述靶上。

4.  根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法还包括在所述的提取步骤之前将支架干燥的步骤。

5.  根据权利要求1所述的方法，其中所述第一和第二组纤维是通过热诱导的相分离法(TIPS)而生成的。

6.  根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一聚合物溶液包括生物适合的聚合物。

7.  根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一聚合物溶液包括生物可再吸收的聚合物。

8.  根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一聚合物溶液包括乙交酯。

9.  根据权利要求8所述的方法，其中所述乙交酯是聚乙醇酸(PGA)。

10.  根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二聚合物溶液包括聚己内酯(PCL)。

11.  根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中利用溶剂提取由第二聚合物溶液形成的纤维。

12.  根据权利要求11所述的方法，其中所述溶剂是卤代溶剂。

13.  根据权利要求12所述的方法，其中所述卤代溶剂是氯代或氟代溶剂。

14.  根据权利要求11所述的方法，其中所述溶剂是含水的。

15.  根据权利要求11所述的方法，其中所述溶剂是离子性液体。

16.  根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中基于第一和第二组聚合物纤维之间的熔融温度差异来提取由第二聚合物溶液形成的纤维。

17.  根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中通过酶解提取由第二聚合物溶液形成的纤维。

18.  根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中由第一聚合物溶液形成的纤维的平均直径小于10μm。

19.  根据权利要求18所述的方法，其中所述纤维的平均直径为约10μm-10μm。

20.  根据权利要求18或19所述的方法，其中所述纤维的平均直径为约500nm-5μm。

21.  根据权利要求18-20中任一项所述的方法，其中所述纤维的平均直径为约1μm-5μm。

22.  根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在提取了由第二聚合物溶液形成的纤维之后所述支架具有的平均孔径为约10-20μm。

23.  根据权利要求22所述的方法，其中所述平均孔径为约15μm。

24.  根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将至少一种用于促进细胞定居、分化、外渗和/或移行的试剂与由第一聚合物溶液所形成的聚合物纤维缔合。

25.  根据权利要求24所述的方法，其中将所述试剂附连到由第一聚合物溶液所形成的聚合物纤维上、植入其中或浸渗在其内。

26.  根据权利要求24或25所述的方法，其中在纤维形成期间将所述试剂缔合。

27.  根据权利要求24或25所述的方法，其中在纤维形成后将所述试剂缔合。

28.  根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述方法还包括将支架引入创伤敷料中的步骤。

29.  一种在活体外诱发组织形成的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供根据权利要求1-27中任一项所制造的支架；
(b)给所述支架接种细胞由此诱导所述组织的形成，该细胞处在适用于所述细胞增殖、分化和/或移行的所选择的介质中。

30.  一种在受治疗者中在活体内诱导组织形成的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供根据权利要求1-27中任一项所制造的支架；
(b)将所述支架植入受治疗者中，由此诱导所述组织的形成。

31.  根据权利要求30所述的方法，其中将所述支架植入真皮创面床中。

32.  一种治疗具有以组织损伤或缺失为特征的病状的受治疗者的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供根据权利要求1-27中任一项所制造的支架；
(b)将所述支架植入受治疗者中，由此诱导组织形成并治疗受治疗者。

33.  根据权利要求1-27中任一项所述方法制造的医用敷料。

具有增大的孔径的支架
发明领域
本发明涉及可用作引导组织再生术和修复的医疗器材的支架。
发明背景
静电纺丝是用于生产具有宽范围的纤维直径和孔径的纤维支架和膜而通常采用的聚合物加工技术。这些支架典型地呈无纺布形式，其由聚合物纤维随机沉积到靶上而产生。在医疗应用中，这类支架助长了宿主细胞的内生长，由于生物可降解聚合物支架降解，其依次沉积天然细胞外基质。
在静电纺丝聚合物纤维直径和这些纤维间的孔之间存在一种已经得到完全证明的关系。低浓度聚合物溶液导致小纤维和小的单个孔径的形成(Boland等人，2004)。随着聚合物浓度增大，纤维直径和孔径两者增大并且细胞对这些变化作出响应。
虽然在静电纺丝支架中细纤维的存在为细胞附连和增殖提供了较大的表面积，然而不利之处是这些纤维与小孔径有关，这种小孔径对于细胞移行通过支架有害(Lannutti等人，2006)。
为了将所有这三种细胞行为增加到最大限度，理想的支架结构含有细纤维，其提供最佳的表面积以促进细胞附连和增殖并提供最佳的孔径以促进细胞移行。为达到此目的，需要断开纤维直径和孔径之间的关系。
已经采用了各种方法以在标准支架中产生增大的孔径，包括：利用致孔剂的粒子沥滤、利用发泡剂的发泡、利用激光的烧蚀、电子束或机械穿孔、以及利用具有不同化学性能的静电纺丝纤维。
已知这样的静电纺丝复合材料支架，其中孔隙率增加是由支架植入后原位除去一种聚合物纤维而造成的，这是由于这种聚合物纤维的降解速率比其它聚合物高的结果(Pham et al.，2006)。虽然这最终产生了比植入前的支架中孔径更大的孔，但是该最佳孔几何结构不能在恰好开始使用该装置时得到，这将随后使细胞响应延迟(Lannutti等人，2006)。
因此需要一种在植入时具有最佳结构的支架。
发明概述
本发明使支架中的纤维直径和孔径之间的关系能够被断开，由此能够达到细胞附连和增殖所需的小直径以及细胞移行到支架中所需的大孔径。
因此根据本发明的一个方面，提供了一种制造聚合物支架的方法，该方法包括以下步骤：
(a)由第一聚合物溶液生成第一组纤维；
(b)由第二聚合物溶液生成第二组纤维，其中将所述第二组纤维散布在所述第一组纤维之间；以及
(c)从所述支架中提取第二组纤维。
第一组纤维是形成最终支架的那些纤维。第二组纤维是“牺牲的”纤维，即为创造最佳孔径在植入支架之前从该支架中除去的那些纤维。
聚合物溶液的浓度被如此选择以使它们产生纤维直径不同的各纤维组。第二组纤维的直径大于第一组纤维的直径，所以在除去第二组纤维之后形成的孔大于在分离中已经产生的第一组纤维。
在本发明的一种实施方式中，支架是通过静电纺丝产生的，其中将至少两种聚合物溶液静电纺丝以形成无纺纤维支架。
由此在本发明的进一步的实施方式中，提供了一种制造静电纺丝聚合物支架的方法，该方法包括以下步骤：
(a)由第一分配器沿着靶方向在静电场内分配第一聚合物溶液，以便形成至少一条所述第一聚合物溶液的喷射流；
(b)由第二分配器沿着靶方向在静电场内分配第二聚合物溶液，以便形成至少一条所述第二聚合物溶液的喷射流；
(c)将各个步骤(a)和(b)中产生的至少一条喷射流聚集到靶上以形成聚合物支架；
(d)从所述支架中提取由第二聚合物溶液形成的纤维。
在本发明的某些实施方式中，将第一和第二聚合物溶液同时分配到所述靶上，这导致第一组和第二组聚合物纤维在整个支架中基本均匀分布。
在本发明另外的可选择实施方式中，将第一和第二聚合物溶液单独分配，例如脉冲调制，例如，这可导致第一组和第二组聚合物纤维在支架内更局限性的或集中的分布。
该方法可进一步包括在提取由第二聚合物溶液所形成的纤维之前将支架干燥的步骤，由此在提取步骤之前将支架内保留的残余溶剂量减至最少。
在本发明进一步的实施方式中，支架是通过热诱导的相分离法(TIPS)而形成的。在该方法中，各种参数例如聚合物类型、聚合物浓度、溶剂/非溶剂比和淬火温度可影响所形成的微孔或大孔结构的类型。例如，已经将TIPS用于形成组织工程支架，其中热处理引起聚合物颗粒(例如聚L-乳酸)熔化并形成在球相中含有夹带的颗粒或致孔剂(例如NaCl)的连续纤维基质(Lee，2004)。该后一种相是牺牲相。通过除去该球相而产生的孔的直径典型地为几百微米，它比实际纤维的直径大几倍。能够采用TIPS在两相，特别是牺牲相中产生纤维结构，使所得孔径得到更有效的控制并且还能够产生更小的孔。例如，能够产生约为20-50μm的孔径是有利的，因为这更密切地模拟了天然细胞环境。
在本发明中采用的聚合物可以是天然的、合成的、生物适合的和/或生物可降解的。
术语“天然聚合物”是指天然存在的任何聚合物，例如丝绸、基于胶原的材料、壳聚糖、透明质酸和藻酸盐。
术语“合成聚合物”是指自然界中不存在的任何聚合物，即使该聚合物是由天然存在的生物材料制得的。其例子包括(但不限于)：脂族聚酯、聚(氨基酸)、共聚(醚酯)、聚烯类、草酸盐、聚酰胺、酪氨酸衍生的聚碳酸酯、聚(亚氨基碳酸酯)、聚原酸酯、聚氧杂酯(polyoxaesters)、聚酰胺酯、含氨基的聚氧杂酯、聚(酐)、聚磷腈及其组合。
适用于本发明的合成聚合物还可包括基于存在于胶原蛋白、弹性蛋白、凝血酶、纤连蛋白、淀粉、聚(氨基酸)、聚(富马酸丙二醇酯)、明胶、藻酸盐、果胶、纤维蛋白、氧化的纤维素、壳素、壳聚糖、弹性蛋白原、透明质酸、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚(四氟乙烯)、聚碳酸酯、聚丙烯和聚(乙烯醇)、核糖核酸、脱氧核糖核酸、多肽、蛋白质、多糖、聚核苷酸及其组合中的序列的生物合成聚合物。
在本发明的实施方式中，生物合成聚合物可以是天然聚合物的官能化的或修饰的变型，例如羧甲基纤维素。
术语“生物适合的聚合物”是指当与生物体的细胞、组织或体液接触时不诱导副作用例如免疫反应和/或排斥等的任何聚合物。
术语“生物可降解的聚合物”是指在生理环境中能够被降解，例如被蛋白酶降解的任何聚合物。生物可降解的聚合物的例子包括胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己酸内酯(PCL)、聚二氧杂环己酮(PDO)、碳酸三亚甲基酯(TMC)、聚乙二醇(PEG)、藻酸盐、壳聚糖或其混合物。
在本发明的一种实施方式中，第一聚合物溶液包括至少一种生物适合的聚合物和/或生物可降解的聚合物。在本发明的特定实施方式中，第一聚合物溶液包括乙交酯，并且特别是包括超过85％乙交酯、超过85％乙交酯、超过90％乙交酯、超过95％乙交酯或包括100％乙交酯。
聚乙醇酸(PGA)，也被称为聚乙交酯，是生物可降解的热塑性聚合物，并且是最简单的线性脂族聚酯。其可由乙醇酸开始，通过乙交酯的缩聚或开环聚合来制备。PGA的特征在于其水解不稳定性：这是由于在其骨架中存在酯键并因此在其处于生理条件时，PGA因随机水解而降解。降解产物乙醇酸是无毒性的，并且其可进入三羧酸循环，在该循环后其作为水和二氧化碳被排泄出来。已经显示该聚合物在4-6个月的时间框架内被生物体完全吸收。
在本发明的一种特定实施方式中，第一聚合物溶液包括浓度为约5-15％w/w，特别是浓度为约5-10％w/w，更特别是浓度为约8％w/w的PGA。
在本发明进一步的实施方式中，第一聚合物溶液包括(共)聚合物的共聚物或混合物。这可赋予所形成的纤维除了由单一聚合物形成的纤维表现出的那些性能之外的物理和/或化学性能。
共聚物的合适例子包括乙交酯和/或丙交酯和/或其它适当羟基酸的共聚物。其例子包括聚(乳酸-羟乙酸)(PLGA)，一种与乳酸的共聚物；聚(乙交酯-己内酯)(PGACL)，一种与ε-己内酯的共聚物以及聚(乙交酯-碳酸三亚甲基酯)(PGATMC)，一种与碳酸三亚甲基酯的共聚物。
在本发明的实施方式中，该共聚物是聚(丙交酯-乙交酯)(PLGA)，其中PGA∶PLA之比为约85∶15，或约85.25∶14.75，或约85.50∶14.50，或约85.75∶14.25；或约90∶10，或约90.25∶9.75；或约90.50∶9.50；或约90.75∶9.25；或约91∶9；或约92∶8；或约93∶7；或约94∶6；或约95∶5；或约96∶4；或约97∶3；或约98∶2；或约99∶1。
本发明还覆盖PGA和聚酯的混合物。合适的混合物例子包括聚乙醇酸(PGA)与聚乳酸的共混物(PGA/PLA)，以及还有聚二氧杂环己酮与聚乙醇酸的共混物(PDO/PGA)。可以设想该共混物可以由至少一种共聚物组成。
可以设想该聚合物的所有立体异构形式。
由第一聚合物溶液形成的纤维的优点是其平均直径为小于10μm，更特别是为约10nm-10μm，或为约500nm-5μm，或为约1μm-5μm。已经发现包括具有该直径的纤维的支架示范了用于细胞附连和增殖的最佳结构。
第二聚合物溶液的聚合物是生物适合/或生物可降解的，不是一个必要的条件，因为这些是牺牲纤维，在支架被植入体内之前将其提取。为达到可提取纤维而不改变第一聚合物的结构的目的，例如，溶解于一种溶剂(第一聚合物不溶解于该溶剂中)中，或在显著低于第一聚合物的温度熔化，或在不降解第一聚合物的酶下降解的任何聚合物是合适的。
适当的溶剂包括(但不限于)卤代溶剂，例如氯代或氟代溶剂、水溶液或离子液体。
在本发明的一种实施方式中，第二聚合物溶液包括聚己内酯(PCL)，其浓度为约10-20％w/w，并且更特别是浓度为约15％w/w。
作为本发明的该实施方式中的一个例子，第一组聚合物纤维包括PGA，而第二组聚合物纤维包括PCL。PGA的熔点为约225-230℃，而PCL的熔点为约58-63℃。为提取第二组纤维同时保持第一组纤维完整无缺，可采用这种熔点显著不同的两组纤维。
在提取第二聚合物溶液所形成的纤维之后，该支架有利地具有为约10-20μm，并且更有利地为约15μm的平均孔径。已经发现具有该孔径的支架示范了用于细胞移行的最佳体系结构。
还可设想第一组纤维是多孔的，由此使得细胞移行以及氧和营养物渗透通过该纤维成为可能。该孔可以是微米或纳米尺度的。
本领域技术人员可以理解，在纤维形成期间，通过改变例如静电纺丝条件可得到该孔。
可替代地，可在纤维形成后达到多孔性。例如，通过纤维的机械穿孔。可替代地，第一组纤维在形成后可包括共聚物、几种聚合物的共混物、或致孔添加剂(致孔剂)，在纤维形成后提取这些组分，形成多孔纤维，提取步骤可基于例如溶剂溶解或温度差异。
在本发明的一种实施方式中，可以设想第一组纤维包括聚合物X和聚合物Y的共混物，而第二组纤维由聚合物Y构成。从支架中提取聚合物Y，产生(i)第一组纤维之间的多孔体系结构，以及(ii)第一组纤维内的多孔性。
例如，第一组纤维包括PGA和PCL的共混物(PGA/PCL)，而第二组纤维由PCL构成。使用例如二氯甲烷溶剂提取PCL，导致第二组纤维被除去并且还形成了有孔的第一组纤维。
虽然在第一组纤维和第二组纤维内的可提取的聚合物可以是相同的聚合物，但是在本发明的更多的实施方式中，可提取的聚合物可以是不同的聚合物。例如，第一组纤维包括聚合物X和聚合物Y的共混物，而第二组纤维由聚合物Z构成。从支架中提取聚合物Y，产生多孔的第一组纤维，而从支架中提取聚合物Z产生布置在第一组纤维之间的大孔。
为了增大对增殖的和/或通过静电纺丝支架移行的细胞的生物亲和性和识别度和/或增加支架的治疗潜力，可以设想使至少一种用于促进细胞定居、分化、外渗和/或移行的试剂与由第一聚合物溶液所形成的纤维缔合。该至少一种试剂可以是生物的、化学的或无机的试剂，其可以被附连到该纤维上、植入其中或浸渗在其内。该试剂可被提供在第一聚合物溶液内，以使在静电纺丝期间，该试剂变得与该纤维缔合。加之或二者择一地，该至少一种试剂可以与静电纺丝后的纤维缔合。
在纤维形成期间或之后，该支架可包括可以与该支架缔合的细胞。合适的细胞的例子包括纤维原细胞、表皮细胞、真皮细胞、上皮细胞和角化细胞。
根据本发明的第二方面，提供了一种根据本发明第一方面制造的支架。
根据本发明此外的更多方面，提供了包括根据本发明第一方面制造的支架或由其构成的医用敷料。
在本发明的这个方面的一种实施方式中，医用敷料是创伤敷料。
根据本发明进一步的方面，提供了在活体外诱导组织形成的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供根据本发明的第一方面制造的支架；
(b)将给该支架接种细胞由此诱导组织的形成，该细胞处在适用于所述细胞增殖、分化和/或移行的所选择介质中。
根据本发明进一步的方面，提供了在受治疗者中在活体内诱导组织形成的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供根据本发明的第一方面制造的支架；
(b)将该支架植入受治疗者中，由此诱导组织形成。
在本发明的实施方式中，将支架植入真皮创面床以促进在创伤部位组织的形成。
根据本发明甚至进一步的方面，提供了治疗具有以组织损伤或缺失为特征的病状的受治疗者的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供根据本发明的第一方面制造的支架；
(b)将该支架植入受治疗者中，由此诱导组织形成并治疗受治疗者。
本发明详细说明
方法
溶液制备
制备8％w/w的聚乙醇(PGA，Mw＝116,000g.mol^-1)和15％w/w的聚己内酯(PCL，37,000g.mol^-1)在六氟异丙醇(HFIP)中的溶液。
静电纺丝
将两种聚合物溶液分别加料到单独的10ml注射器中并置于设定为以0.03毫升/分钟分配溶液的注射泵中。采用柔性塑料管(内径1.5mm)将注射器出口连接到金属18号针，其被向下锉以除去锥尖。将一根针垂直夹紧在靶上，工作距离(从针尖到靶)为15cm，另一根水平地位于靶的前面，工作距离为10cm。两根针都被连接到高压发电机的有电端口。
所述靶是一个连接到马达的圆柱形铝心轴(直径5cm×长10cm)。该马达使该靶能够以50rpm旋转以聚集一层均匀的纳米纤维材料层。将该靶埋入土中，并被覆盖于可替代的烘焙纸下以使所形成的纳米纤维材料易于被除去。
利用Glassman测速发电机将～10kV电压施加到针来引发静电纺丝过程，同时将靶埋入土中。当施加到针的电压足以防止聚合物溶液滴下并能够将它们向旋转靶引导作为喷射流时开始静电纺丝，然后将这些聚合物喷射流以两组纤维的混合物形式聚集到烘焙纸上。通常采用引发静电纺丝过程所需的最小电压，并且该过程进行的时间量取决于所需的支架深度。
将制得的支架真空干燥以将残余溶剂量减至最少。
清洗步骤
干燥后，将包含两组聚合物纤维的支架在二氯甲烷(DCM)中清洗以除去全部PCL纤维。通过单个地将支架在含有DCM(约200ml)的烧杯中浸没5分钟来进行清洗步骤。重复该步骤确保完全除去PCL纤维(如通过DSC或其它任何适用的分析方法观察到的)所需的次数。在清洗之后，将支架再次真空干燥以除去任何痕量溶剂。
测量纤维直径和孔径
在清洗之前和之后，利用扫描电子显微镜(SEM)来使静电纺丝的支架成像。
由所得SEM图像确定纤维的直径和孔径。利用直尺和比例尺用手进行测量或利用Image ProPlus软件进行测量。对于每个样品，每张SEM图像随机地测量30根纤维和30个孔，并且计算这些测量值的平均值和标准偏差。
将孔径定义为每个孔的最长尺寸(通常为对角线)，并且将孔定义为由相交的纤维所产生的多边形。
结果
所得的尺寸
测量了两种静电纺丝垫的尺寸。
表1：标准和组合静电纺丝结构的尺寸对比