山莓叶中具抗肿瘤作用的两个新化合物、 制备方法及其用 途 技术领域 本发明涉及山莓叶中提取分离出的两个新化合物、 制备方法以及其抗肿瘤药物方 面的用途。
背景技术 山莓 (Rubus corchorifolius L.f) 属蔷薇科悬钩子属中一种落叶灌木。多生长 于向阳山坡、 溪边、 山谷、 荒地和灌丛中， 海拔 300 ～ 1500m。除东北、 内蒙古、 青海、 新疆、 西 藏外， 全国均有分布。福建全省各地均有山莓分布， 野生资源蕴藏量相当大。我国利用山莓 的历史悠久， 在 《本草拾遗》 、 《本草纲目》 、 《名医别录》 、 《食疗本草》 中就有山莓药用价值的详 细记载， 其药用已有上千年历史。山莓果、 根及叶均可入药。地上部分 ( 叶、 幼果和茎 ) 所 含的香豆素化合物， 如东茛菪内酯具有一定的镇痛、 抗炎、 祛痰和平喘的作用。 在湘西、 鄂西 北山莓作为常用的苗族药， 用于医治常见的多发病， 如腹泻、 目赤、 酒精中毒等， 疗效确切。
目前有关山莓的研究主要是集中在资源的开发利用方面， 陈炳华利用其聚合果， 用于食品加工 ； 利用其鞣质作为化工原料， 近年来又关山莓的化学成分研究不断增多， 陈 炳华等首次从山莓茎叶中分离到了一种香豆素， 经理化试验和多种波谱分析鉴定为 6- 甲 氧基 -7- 羟基香豆素， 即东莨菪内酯 (Scopletin) ； 同时报道山莓全株含鞣质、 黄酮类化 合物， 地上部分 ( 叶、 茎、 幼果 ) 含香豆素化合物， 根中含酚性成分和皂甙。张敏测得山莓 叶中总黄酮含量为 1.18mg/g。张琰等报道了莓果实的营养成分为保礼等人从山莓叶中 提取出得到茶多酚， 含量达 5.15 ％。毕金峰等报道山莓果实中含有大量的鞣化酸。陈雪 香等报道山莓叶醇提物中的成分主要含有有机酸、 糖类、 黄酮及其甙类、 鞣质、 酚类、 强心 甙、 香豆素、 甾体、 萜类。张敏等对山莓乙酸乙酯萃取部位的化学成分进行了研究， 从中分 离得到了 2 个贝壳杉烷二萜新化合物 ： 3α， 16α， 17， 19- 对映 - 贝壳杉烷 - 四醇和 2 羰 基 -16α- 羟基 - 对映 - 贝壳杉烷 -17-β-D- 葡糖苷。陈雪香等从山莓乙酸乙酯萃取部 位分离得到四个新化合物化合物 ： 分别为 9β， 16α， 17 三羟基 - 对映贝壳杉 -2 酮 (9β， 16α， 17-trihydroxy-ent-kaur-2-one)， 16α， 17， 19 三羟基 - 对映贝壳杉 -2 酮 (16α， 17， 19-trihydroxyl-ent-kaur-2-one)， 2β， 3α， 16α， 17- 四 羟 基 - 对 映 - 贝 壳 杉 醇 (2β， 3α， 16α， 17-tetrahydroxyl-ent-kauranol)， 且均具有抗肿瘤的作用。
发明内容 本发明的目的是提供从山莓中分离出的两个新化合物， 由山莓叶粗提取经过反复 硅胶柱层析、 薄层层析和结晶的方法所得， 活性实验证明该组化合物具有抗肿瘤作用。
本发明所提供的一组两个新化合物是从山莓叶的粗提物中经过反复硅胶柱层 析、 薄层层析和结晶的方法所得， 化学名称分别为 ： 化合物 1(ZM-1)3β， 16α， 17， 19- 四 羟基 - 对映贝壳杉 -19- 乙酸酯， 化合物 2(99-106)3β， 16α， 17， 19- 四羟基 - 对映贝壳 杉 -19- 乙酸酯 -17- 氧 -β-D- 葡萄糖苷。经波谱解析和化学方法确定了化合物 1、 化合物
2 的结构， 分别为 ：
化合物 1 化合物 2
上述两个化合物由包括以下步骤的制备方法所得 ：
(1) 称取粉碎的山莓叶， 加入 10 倍体积 80％的乙醇， 搅匀， 于 50℃下浸提 48h， 过 滤， 滤渣再重复提取一次， 合并滤液， 浓缩冻干备用 ；
(2) 将浓缩冻干所得浸膏液依次用石油醚， 氯仿、 乙酸乙酯、 正丁醇反复多次萃取， 将萃取液分别浓缩， 冷冻干燥， 分别得石油醚， 氯仿、 乙酸乙酯、 正丁醇萃取物 ；
(3) 将氯仿萃取物进行硅胶柱色谱分离， 用三氯甲烷与甲醇进行梯度洗脱， 合并相 同组份， 浓缩冻干 ；
(4) 取浓缩冻干后呈现结晶的一个组分， 用甲醇完全溶解， 25℃下静置 24 小时， 得 到结晶， 过滤， 将晶体再用甲醇溶解， 重结晶一次， 即得到化合物 1 ；
(5) 将浓缩冻干后总重量最大， 显灰白色粉末状的一个组份， 用甲醇溶解并取适量 硅胶拌匀， 挥干溶剂， 干法上样， 再进行硅胶柱层析分离， 用氯仿和甲醇进行梯度洗脱， 收集 洗脱液， 经合并相同组份， 浓缩冻干 ；
(6) 取检测纯度高的一个组分， 用甲醇溶解， 25℃下静置 24 小时， 得到结晶， 过滤， 将晶体再用甲醇溶解， 重结晶一次， 即得到化合物 2。
步 骤 (3) 中， 进 行 梯 度 洗 脱 时， 三氯甲烷与甲醇的体积比依次为 ： 500 ∶ 0， 500 ∶ 1， 300 ∶ 1， 100 ∶ 1， 90 ∶ 1， 70 ∶ 1， 50 ∶ 1， ， 30 ∶ 1， 10 ∶ 1， 5 ∶ 1， 甲醇与水的体 积比为 4 ∶ 1。
步骤 (5) 中， 进行梯度洗脱时， 氯仿和甲醇的体积比依次为 100 ∶ 0， 80 ∶ 1， 40 ∶ 1， 10 ∶ 1， 5 ∶ 1， 1 ∶ 1， 0 ∶ 1。
活性实验证明上述两个新化合物均具有很好的抗肿瘤作用。因此， 本发明的化合 物 1 和化合物 2 可用于制备抗肿瘤药物， 也可用于制备具有相应功效的保健品。
本发明两个化合物的结构测定 ：
( 一 ) 化合物 1(ZM-1)3β， 16α， 17， 19- 四羟基 - 对映贝壳杉 -19- 乙酸酯的结构 测定
1、 理化与光谱数据
(1) 该化合物为无色针状晶体， M.p.140-141℃， 旋光度 ： -17.3， 全波段扫描 λmax ＝ 207nm( 甲醇 )， 三氯甲烷∶甲醇＝ 20 ∶ 1， Rf ＝ 0.68， 1％香草醛硫酸溶液显为单一桃红 色斑点。
(2) 化 合 物 13C-NMR 信 号 为 (CD3OD， 400MHZ) ： 173.1(s)， 82.8(s)， 71.4(d)，
68.9(t) ， 66.8(t) ， 58.0(d) ， 53.9(t) ， 50.4(d) ， 46.4(d) ， 45.7(s) ， 43.4(t) ， 42.7(s) ， 40.1(s) ， 38.0(t) ， 34.4(t) ， 27.2(t) ， 26.3(t) ， 23.1(q) ， 21.3(t) ， 20.7(q) ， 19.3(t) ， 18.5(q)
(3) 化合物 1H-NMR 信号为 (CD3OD， 100MHZ) ： 1.017(s， 3h) ； 1.070(s， 3h) ； 1.130(m， 1h) ； 1.301(m， 1h) ； 1.35-1.47(m， 3h) ； 1.48-1.67(m， 11h) ； 1.89-1.99(m， 2h) ； 2.029(s， 3h) ； 2.030(m， 1h) ； 3.59(d， J ＝ 11.4Hz， 1h) ； 3.613(t， J ＝ 3.0Hz， 1h) ； 3.69(d， J ＝ 11.4Hz， 1h) ； 3.93(d， J ＝ 11.4Hz， 1h) ； 4.22(d， J ＝ 10.8Hz， 1h) ； 4.583(s， 1h， OH)。
(4)APCI-MS ： 267.3， 285.2， 345.1(100)， 363.1， 381.0 -1
(5)IR(KBr)Vmax cm ： 3505， 3430(OH)， 2940， 2850(C-H)， 1715(C ＝ O).
2、 结构推导
(1) 分子式的确定 ： APCI-MS 中给出准分子离子峰 381([M+H]+)， 363([M+H-H2O]+)， 345([M+H-2H2O]+) 推出该化合物分子量为 380amu。综上可推出化合物分子式为 C22H36O5， Ω 等于 5， 分子中含有 3 个羟基。
(2) 结构式的确定
化合物平面结构的确定 ： 分析 HSQC、 HMBC、 H-HCOSY 谱， 发现有以下结构片段 ：
片段 I片段 II
片段 III
片段 IV 片段 V 至此 22 个碳原子都已找到相关， 前述不饱和度为 5， 所以其平面结构为一贝壳杉烷型四环二萜类成分， 通过查阅文献， 与大量类似物比较， 其 NMR 数据与 ent-kaurane 型一 致， 且原植物已经分到一系列该类型化合物， 故确定化合物结构式如下 ： 命名为 3β， 16α， 17， 19- 四羟基 - 对映贝壳杉 -19- 乙酸酯。
( 二 ) 化 合 物 2(99-106)3β， 16α， 17， 19- 四 羟 基 - 对 映 贝 壳 杉 -19- 乙 酸 酯 -17- 氧 -β-D- 葡萄糖苷结构测定
1、 理化与光谱数据
(1) 白色粉末， M.p.139-141 ℃， 旋光度 ： -25.8， 全波段扫描 λmax ＝ 205nm( 甲 醇 )， 三氯甲烷∶甲醇＝ 3 ∶ 1， Rf ＝ 0.7， 1％香草醛硫酸溶液显为单一灰色斑点。 13
(2) 化 合 物 C-NMR 信 号 为 (CD3OD， 400MHZ)173.1(s)， 105.3(d)， 82.0(s)， 78.0(d) ， 77.9(d) ， 75.3(d) ， 75.0(t) ， 71.7(d) ， 71.4(d) ， 68.9(t) ， 62.8(t) ， 58.0(d) ， 53.6(t) ， 50.4(d) ， 46.8(d) ， 45.7(s) ， 43.3(t) ， 42.7(s) ， 40.1(s) ， 37.9(t) ， 34.4(t) ， 27.1(t)， 26.3(t)， 23.1(q)， 21.3(t)， 20.8(q)， 19.3(t)， 18.5(q) 1
(3) 化合物 H-NMR 信号为 (CD3OD， 100MHZ) ：
1.017(s， 3h) ； 1.068(s， 3h) ； 1.133(brs， 1h) ； 1.297(m， 1h) ； 1.36-1.68(m， 14h) ； 1.721(brd， 1h) ； 1.88-2.00(m， 2h) ； 2.029(s， 3h) ； 2.081(brs， 1h) ； 3.22(dd， J ＝ 7.6， 9.4Hz， 1h) ； 3.26-3.30(m， 2h) ； 3.372(m， 1h) ； 3.51(d， J ＝ 10.4Hz， 1h) ； 3.611(brs， 1h) ； 3.679(m， 1h) ； 3.87(dd， J ＝ 1.2， 12Hz， 1h) ； 3.93(d， J ＝ 11.2Hz， 1h) ； 4.15-4.25(t， 2h) ； 4.285(d， J ＝ 8.0Hz， 1h)。
(4)APCI-MS ： 560， 565， 1107
(5)IR(KBr) ： FTIR V max cm-1 ： 3515， 3480(OH)， 2940， 2860(C-H)， 1730(C ＝ O).
2、 结构推导
(1) 分子式的确定 ： APCI-MS 中给出准分子离子峰 560([M+H2O]+)， 565([M+Na]+)， 1107([2M+Na]+) 推出该化合物分子量为 542amu。可推出化合物分子式为 C28H46O10， 计算不 饱和度为 6，
(2) 平面结构的确定
由 HHCOSY， HMQC， HMBC 图谱， 发现有以下结构片段 ：
片段 III 片段 IV
至此 28 个碳原子都已找到相关， 前述不饱和度为 6， 所以其平面结构为一贝壳杉 烷型四环二萜类成分 ： 通过查阅文献， 与大量类似物比较， 其 NMR 数据与 ent-kaurane 型一 致， 且原植物已经分到一系列该类型化合物， 故确定化合物结构式如下 ： 命名为 3β， 16α， 17， 19- 四羟基 - 对映贝壳杉 -19- 乙酸酯 -17- 氧 -β-D- 葡萄糖苷。
具体实施方式
实施例 (1) 山莓叶乙醇粗提物的制备 ： 称取粉碎的山莓叶 3000.0g， 加入 10 倍体积 80％ 的乙醇， 搅匀， 于 50℃下浸提 48h， 过滤， 滤渣再重复提取一次， 合并滤液， 浓缩冷冻干备用。
(2)、 山莓活性成分液液萃取分离纯化 ： 将浸膏液用依次用石油醚， 氯仿、 乙酸乙 酯、 正丁醇反复多次萃取， 将萃取液分别浓缩， 冷冻干燥。 分别得石油醚， 氯仿、 乙酸乙酯、 正 丁醇萃取物。
(3)、 氯仿萃取物柱层析的分离纯化 ： 将氯仿萃取物进行硅胶柱色谱分离， 用三氯 甲烷与甲醇进行梯度洗脱， 每瓶收集 500mL， 共收集 173 瓶， 经 TLC 检测， 采用硫酸香草醛显 色， 合并相同组份， 共得 11 个组份， 分别表示为 ： Fr.1， Fr.2， Fr.3， Fr.4， Fr.5， Fr.6， Fr.7， Fr.8， Fr.9， Fr.10， Fr.11 浓缩冻干用于进一步分离纯化。
(4)、 柱层析 I 组份 Fr.7 进行重结晶， 结晶后得化合物 1 ： 3β， 16α， 17， 19- 四羟
基 - 对映贝壳杉 -19- 乙酸酯。 Fr.11 进行第二次硅胶柱层析分离纯化用氯仿与甲醇进行梯 度洗脱， 每 10mL 收集一瓶， 共收集 122 瓶， 经 TLC 检测合并相同组份， 共得 15 组份， 分别为 ： 分别表示为 ： Fr.11.1， Fr.11.2， Fr.11.3， Fr.11.4， Fr.11.5， Fr.11.6， Fr.11.7， Fr.11.8， Fr.11.9， Fr.11.10， Fr.11.11， Fr.11.12， Fr.11.13， Fr.11.14， Fr.11.15， 浓缩冻干用于进 一步分离纯化。Fr.11.15 样进行重结晶， 结晶后得化合物 2 ： 3β， 16α， 17， 19- 四羟基 - 对 映贝壳杉 -19- 乙酸酯 -17- 氧 -β-D- 葡萄糖苷。
本发明中两个新化合物抗肿瘤活性的测定
1、 实验材料
1.1 药品 ：
上述分离的化合物 ：
1.2 细胞 ： 人肝癌细胞株 HepG2 由广州泰禾生物医药公司提供。
1.3 试剂 ： PRMI1640， 胎牛血清， 96 孔板， 胰酶， DMSO， MTT， 5-FU， 青霉素， 链霉素。
2、 方法
将肝癌 HepG2 细胞培养于含 10％胎牛血清、 1x105U/L 青霉素、 链霉素的 RPMI1640 4 培养液中， 37℃， 5％ CO2 培养箱内常规传代培养。细胞以 1x10 个 / 孔的浓度接种于 96 孔 培养板， 于含 10％的胎牛血清的 RPMI-1640 培养液中培养 24h， 细胞贴壁后， 实验组给药量 为 100μg/mL、 200μg/mL、 400μg/mL、 ， 阴性对照组加等量 RPMI(DMSO 含量为 1％ )， 阳性对 照组加入 5-Fu 的浓度为 100μg/mL、 200μg/mL、 400μg/mL、 800μg/mL、 1600μg/mL。空白 对照组只加等量 RPMI。药物作用 24h 后， 于每孔中加入配制的 5％ MTT20μL 继续培养 4h， 弃上清， 加入 150μL DMSO， 在混合振荡仪上振药约 10min， 使结晶物充分溶解后， 于酶联检 测仪上 492nm 波长测定各孔吸光值。
计算细胞毒性值 (CT％ )， CT％＝ (1-OD 处理 /OD 对照 )×100％。
3、 实验结果
表 1 化合物对肝癌 HepG2 细胞的抑制作用
表 2 化合物 2 对肝癌 HepG2 细胞的抑制作用上述实验结果表明 ： 对映 -9β， 16α， 17 三羟基 - 贝壳杉 -2 酮和对映 -16α， 17， 19 三羟基 - 贝壳杉 -2 酮对肝癌 HepG2 细胞均具有明显的抑制作用， 且具有良好的量效关系。 因此， 上述两种化合物可单独或混合用于制备抗肿瘤药物， 也可用于制备抗肿瘤保健品。
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