LAK细胞的增殖方法.pdf

本发明提供花费可以适用于非人类动物程度的费用，对各种癌、免疫缺陷病、感染症有效的治疗方法、其相关的细胞增殖、活化方法等。本发明的增殖、活化方法为，在培养细胞时向培养基中添加伴刀豆球蛋白A等植物凝集素和具有白细胞介素-2(Interleukin-2)样活性的增殖因子。从而，可以优先将与癌、免疫缺陷病、感染症的细胞性免疫相关的αβ型T细胞增殖、活化。

1.  LAK细胞的增殖方法，其依次包括：(1)从动物采取包含αβ型T细胞的起始试样的采取工序；(2)用至少包含植物凝集素和具有白细胞介素-2样活性的增殖因子的培养基对采取好的起始试样中的细胞进行增殖、活化的增殖活化工序。

2.  根据权利要求1记载的LAK细胞的增殖方法，其中，包含αβ型T细胞的起始试样选自末梢血、骨髓、淋巴组织、上皮、胸腺、肝脏、脾脏、癌组织、感染组织、淋巴节组织、胎儿组织及它们的提取物中的至少一种。

3.  根据权利要求2记载的LAK细胞的增殖方法，其中，起始试样选自抹消血及其提取物中的至少一种。

4.  根据权利要求1～3的任一项记载的LAK细胞的增殖方法，其中，植物凝集素选自伴刀豆球蛋白A、植物血细胞凝集素和美洲商陆有丝分裂原中的至少一种。

5.  根据权利要求4记载的LAK细胞的增殖方法，其中，植物凝集素为伴刀豆球蛋白A。

6.  根据权利要求1～5的任一项记载的LAK细胞的增殖方法，其中，具有白细胞介素-2样活性的增殖因子是白细胞介素-2。

7.  根据权利要求1～6的任一项记载的LAK细胞的增殖方法，其中，依次包含：
(3)增殖活化工序结束后，去除培养基，洗涤细胞的除去工序；
(4)将洗涤后的细胞悬浮于适当的溶液的制备工序。

8.  细胞悬浊液，其通过权利要求1～6的任一项记载的增殖方法富集有αβ型T细胞。

9.  细胞制剂，其通过权利要求7记载的增殖方法富集有αβ型T细胞。

10.  非人动物的治疗方法，其为患有癌、免疫缺陷病或感染症的非人动物的治疗方法，包括：将有效量的由来源于所述非人动物的起始试样制备的权利要求9记载的细胞制剂投予所述非人动物的投予工序。

11.  LAK细胞的增殖用试剂盒，其至少包含具有白细胞介素-2样活性的增殖因子和植物凝集素。

12.  根据权利要求11记载的LAK细胞的增殖用试剂盒，其中，包含细胞培养容器。

13.  根据权利要求11或12记载的LAK细胞的增殖用试剂盒，其中，植物凝集素被固层化于细胞培养容器中。

14.  根据权利要求11～13的任一项记载的LAK细胞的增殖用试剂盒，其中，植物凝集素为选自伴刀豆球蛋白A、植物血细胞凝集素、美洲商陆有丝分裂原中的至少任一种。

15.  根据权利要求14记载的LAK细胞的增殖用试剂盒，其中，植物凝集素为伴刀豆球蛋白A。

16.  根据权利要求11～15的任一项记载的LAK细胞的增殖用试剂盒，其中，具有白细胞介素-2样活性的增殖因子为白细胞介素-2。

LAK细胞的增殖方法
技术领域
本发明涉及LAK细胞的增殖方法，包含经过增殖的细胞的细胞制剂，利用细胞制剂的非人动物的癌、免疫疾病、感染症等的治疗方法以及LAK细胞的增殖所使用的培养试剂盒。
背景技术
作为癌和肿瘤的治疗方法，通常方法有切除病变部位的外科治疗方法、给药抗癌剂的化学治疗方法、向病变部位照射放射线的放射线疗法等。
但是，这些治疗方法，对于患者来说，存在身体上的负担很大，化学药品和放射线带来副作用等缺点。因此，从1980年左右开始，对作为第4治疗方法的LAK(lymphokine-activated killer，淋巴因子激活的杀伤细胞)疗法和CTL(cytotoxic T lymphocyte，细胞毒性T淋巴细胞)疗法等活化自身淋巴球疗法进行了研究，用于人的癌的治疗等(参照非专利文献1)。
这里，所谓LAK疗法，是指利用体外增殖并活化的患者自身的淋巴球具有的免疫力来治疗患者的癌的方法。具体来说，是通过(1)从患癌的患者取血，分离含有淋巴球的提取物；(2)将该提取物用含有白细胞介素-2和抗CD3抗体的培养基培养2周左右，从而使淋巴球细胞的数量增加，进行活化；(3)洗涤含有很多培养得到的淋巴球的细胞悬浊液，除去白细胞介素-2、抗CD3抗体、培养基，将淋巴球悬浮于适当的溶液例如含有白蛋白的输液用生理盐水等中，制备细胞制剂；(4)静脉滴注该细胞制剂，使活化的淋巴球返回患者的体内；从而来治疗患者的方法。另外，所谓CTL疗法，是指使细胞毒性T淋巴球增殖活化来使用的方法。
活化自身淋巴球疗法也与其他治疗方法同样地被进行了各种各样的改良。例如，还开发了通过代替抗CD3抗体将伴刀豆球蛋白A等T细胞有丝分裂原和白细胞介素-7等添加到培养基中来培养，不必增殖并活化淋巴球整体，只特异性地增殖并活化与细胞性免疫直接相关的γδ型T细胞，更高效地治疗癌症的方法(参照专利文献1和2)。
LAK疗法和CTL疗法等活化自身淋巴球疗法，如上述专利文献记载的那样，也尝试了应用于癌以外的疾病例如免疫疾病、感染症。
但是，这些存在以下说明的问题。首先，抗CD3抗体存在的问题是：作为抗原的CD3蛋白质根据作为其来源的种类例如狗、猫、家畜、人等而有所不同，因此必须针对每个作为治疗对象的种类来准备抗CD3抗体。另外，该抗CD3抗体，特别是现在通常使用的人用抗CD3抗体的价格昂贵。因此，LAK疗法和CTL疗法等活化自身淋巴球疗法产生的问题是：对于人姑且不论，从经济方面考虑，对于非人的动物是很难应用的。
另外，即使仅增殖γδ型T细胞，γδ型T细胞也不显示如上所述的抗原特异性、MHC约束性，因此，LAK疗法和CTL疗法等活化自身淋巴球疗法存在不太有效的问题。
专利文献1：日本特表2002-528115号公报
专利文献2：日本特表2003-529363号公报
非专利文献1：(平成18年6月27日检索)因特网<URL:http://www.j-immunother.com/treatment/02Treatment.html>
发明内容
发明要解决的问题
因此，本发明的目的在于，提供用可以适用于非人类动物程度的费用，对癌、免疫缺陷病、感染症等有效的治疗方法、与其相关的细胞增殖并活化方法等。
解决问题的手段
本发明最主要的特征是，培养从起始试样得到的细胞时，向培养基添加伴刀豆球蛋白A等植物凝集素和具有白细胞介素-2样活性的增殖因子。
附图说明
图1是表示对培养基中伴刀豆球蛋白A浓度的差异对αβ型T细胞增殖给予的影响进行调查的结果图。
图2是表示对培养基中伴刀豆球蛋白的有无对狗末梢淋巴球表面的白细胞介素-2受体的表达给予的影响进行调查的结果图。
图3是表示对培养基中血清浓度的差异对αβ型T细胞增殖给予的影响进行调查的结果图。
图4是表示对培养基中白细胞介素-2浓度的差异对αβ型T细胞增殖给予的影响进行调查的结果图。
图5是表示将从不同的狗采取的αβ型T细胞用各自的自身血清培养的结果图。
图6是表示将从不同的狗采取的αβ型T细胞用胎牛血清培养的结果图。
图7是表示将从不同的狗采取的αβ型T细胞用各自的自身血清或胎牛血清培养的结果图。
图8是增殖开始前和增殖后测定的流式细胞仪的柱状图。
图9是表示对用含伴刀豆球蛋白A和白细胞介素-2的培养基培养的狗末梢淋巴球对人黑色素瘤细胞给予的细胞毒活性进行调查的结果图。
图10是表示对用含伴刀豆球蛋白A和白细胞介素-2的培养基培养狗末梢淋巴球对粒酶B(Granzyme B)的mRNA转录活性给予的影响进行调查的结果的电泳照片。
图11是表示将用含伴刀豆球蛋白A和白细胞介素-2的培养基培养的狗末梢淋巴球移入其采取源即狗后，从移入的狗采取末梢淋巴球，该末梢淋巴球对人黑色素瘤细胞给予的细胞毒活性进行调查的结果图。
图12是表示通过对患癌的狗实施本发明的治疗方法，其患部产生的变化的照片。其中，图12(a)是治疗前的患部的照片，图12(b)是治疗后的患部的照片。
图13是表示通过对患犬毛囊虫症的狗实施本发明的治疗方法，其患部产生的变化的照片。其中，图13(a)是治疗前的患部的照片，图13(b)是治疗后的患部的照片。
图14是表示图13的狗的其他患部产生的变化的照片。其中，图14(a)是治疗前的患部的照片，图14(b)是治疗后的患部的照片。
符号说明
1     肿瘤
2、3  患部
具体实施方式
1、LAK细胞的增殖方法
本发明的LAK细胞的增殖方法包括：(1)从动物采取包含αβ型T细胞的起始试样的采取工序；(2)用至少包含植物凝集素和具有白细胞介素-2样活性的增殖因子的培养基对采取的起始试样中的细胞进行培养的增殖、活化工序等。这里，详细说明本发明的以下各工序。
(1)采取工序
是从动物采取包含αβ型T细胞的起始试样的工序。
(a)动物
所谓动物，意思是包括狗、猫、牛、马等家畜和人的哺乳动物，所谓非人动物，意思是上述动物中除人以外的哺乳动物。
(b)起始试样
起始试样，只要是含有作为增殖源的αβ型T细胞或其前体细胞的体液、组织就可以使用，没有特别限定。具体来说，可以举出末梢血、脐带血、骨髓、淋巴组织、上皮、胸腺、肝脏、脾脏、癌组织、感染组织、淋巴节组织、胎儿组织或其提取物等。这些之中，考虑到αβ型T细胞的浓度高则采取容易等，优选末梢血的提取物。
(c)采取
起始试样的采取，可以使用公知的方法，没有特别限定。具体来说，例如，起始试样是体液时，可以通过注射将抽取的体液层叠于适当的比重液后，通过密度梯度离心法分取适当的级分来采取。含有很多比重与αβ型T细胞相近的红血球的起始试样，具体来说为末梢血的情况下，如果利用NH₄Cl缓冲液等事先破坏红血球，则可以进一步提高αβ型T细胞的浓度。另外，利用末梢血时，为了防止凝固，也可以加入肝素或柠檬酸等。
另外，起始试样是组织时，可以将通过外科手术摘出的组织片通过胰蛋白酶处理等消化细胞间粘着物，使细胞分散在培养基中，制成细胞悬浊液后，将该细胞悬浊液层叠于适当的比重液，进行密度梯度离心分取适当的级分，从而来采取。
(d)其他
通过离心分离法等采取的起始试样，如果通过公知的方法将αβ型T细胞事先浓缩，则可以更有效地将αβ型T细胞优先增殖。作为公知的方法，可以例示通过将细胞悬浊液流过固定有抗体的亲和色谱(affinity chromatography)，仅浓缩αβ型T细胞或相对地仅除去γδ型等。
(2)增殖、活化工序
将采取的起始试样中的细胞用至少包含植物凝集素和具有白细胞介素-2样活性的增殖因子的培养基进行增殖并活化的工序。
这里所谓“增殖”，意思是体外培养。另外，所谓“培养”，意思是将细胞放入包含其生长必需的营养源等的培养基中，使细胞量增加。进而，所谓“活化”，意思是通过刺激细胞，控制使细胞具有的功能活跃发挥，更具体来说，使抗肿瘤性、抗免疫疾病性、抗感染症性等产生、提高。
(a)植物凝集素
所谓植物凝集素，是指来源于植物的糖结合性蛋白质，具体可以举出伴刀豆球蛋白A、植物血细胞凝集素、美洲商陆有丝分裂原(pokeweed mitogen)等，但不限于这些。这些之中，从价格便宜、容易获得等方面考虑，优选伴刀豆球蛋白A。另外，培养基中的伴刀豆球蛋白A的浓度优选为1μg/ml～15μg/ml，更优选为5μg/ml～10μg/ml。
(b)具有白细胞介素-2样活性的增殖因子
所谓具有白细胞介素-2样活性的增殖因子，是指针对αβ型T细胞的增殖能力，具有与白细胞介素-2相同活性的所有化合物。具体可以举出白细胞介素-2本身、白细胞介素-2的氨基酸取代物、白细胞介素-2的部分消化物、白细胞介素-2的类似物等功能性等同物，但不限于这些。另外，只要满足上述条件，则不特别限定白细胞介素-2等的来源，例如可以使用来源于人、狗、猫、家畜的物质。这些之中，从容易获得的角度考虑，优选来源于人的白细胞介素-2。另外，培养基中的具有白细胞介素-2样活性的增殖因子的浓度，优选为1U/ml～1000U/ml，更优选为500U/ml～750U/ml。
(c)增殖、活化
(c1)培养基
培养基，只要添加有植物凝集素和具有白细胞介素-2样活性的增殖因子，则没有特别限定，可以是公知的培养基，例如可以使用市售的培养基(日水制药制造的RPM I 1640培养基等，但不限于此)。另外，培养基也可以是无血清培养基，但为了促进增殖，优选含有血清。作为血清，可以使用市售的血清，例如胎牛血清等，也可以使用与采取起始试样的动物同种的血清或其自身血清。添加血清时，其添加量，优选为培养基的1重量％～20重量％，更优选为2重量％～5重量％。
(c2)培养方法
培养，可以通过动物细胞的一般培养方法即将装有培养基的培养容器配置在CO₂恒温箱内来进行。作为培养容器，可以使用例如培养皿、培养板、烧瓶、转瓶、透气性培养袋等公知的培养容器。
另外，CO₂恒温箱内的CO₂浓度，优选在1～10％的范围，更优选在3～7％的范围。CO₂恒温箱内的温度优选在30～40℃的范围，更有效35～38℃的范围。
进而，培养时间，与通常的动物细胞的培养相同，没有特别限定，但为了细胞的增殖和活化，优选为2天～20天左右，更优选为7天～14天左右。培养期间，在显微镜下观察细胞状态数出细胞个数，或者根据培养状况追加培养基或其特定成分，根据情况，可以更换培养基或将细胞在放入其他容器中的培养基中传代。
2.细胞悬浊液和细胞制剂
通过上述1的增殖方法，对起始试样中的αβ型T细胞进行增殖、活化了(富集)的细胞悬浊液，可以作为细胞悬浊液用于各种实验。另外，可以从该细胞悬浊液中除去培养基、其所含的植物凝集素、具有白细胞介素-2样活性的增殖因子(除去工序)后，以适当的细胞密度再悬浮于适当的溶液(制备工序)，制成细胞制剂。以下对除去工序和制备工序进行详细说明。
细胞制剂，只要是包含通过本发明的LAK细胞的增殖方法增殖的细胞、可用于疾病治疗的药剂即可，对于其形态、起始试样、采取起始试样的动物的种类、再悬浊的溶液的种类等没有限定。
(3)除去工序
增殖、活化工序结束后，为了防止培养基、植物凝集素等引起的不需要且有害的免疫反应，只要仅收集培养基所含的细胞，洗涤细胞表面附着的培养基即可，没有特别限定，可以使用公知的方法。
具体来说，可以举出反复进行将培养容器放入离心分离器使细胞沉淀后，通过倾析法废弃培养基使细胞悬浮于缓冲液等的方法、使用离心柱(SpinColumn)的方法等。另外，可以举出使用固定有针对αβ型T细胞的抗体的磁珠或亲和层析的方法、使用针对αβ型T细胞的荧光抗体和流式细胞仪来仅分离细胞的方法等。
(4)制备工序
除去培养基后，只要以适当的细胞浓度悬浮于适当的溶液中即可，没有特别限定，可以使用公知的方法，例如将适当的溶液加入装有细胞的培养烧瓶中，通过涡流将其溶解的方法等。
作为悬浊细胞的溶液，只要是可以维持LAK细胞的活性并且投予含该溶液的细胞制剂的非人动物不被引起排斥反应等免疫反应，就可以使用，没有特别限定。具体来说，可以举出例如含白蛋白、维生素、葡萄糖等的输液等通常的输液以及含自身血清的培养液等。溶液中的细胞密度根据起始试样、采取的动物的种类、溶液的种类等而有所不同，优选为1×10⁵细胞/ml～1×10⁷细胞/ml，更优选为1×10⁶细胞/ml～6×10⁶细胞/ml。
3.治疗方法
该方法是：细胞制剂中，将来源于非人动物的起始试样的细胞制剂的有效量投予采取起始试样的非人动物(投予工序)，从而对患癌、肿瘤、免疫缺陷病或感染症的非人动物进行治疗的方法。这里，所谓所述的有效量，是指期望的结果例如疾病的完全治愈所必需的细胞制剂的合计量，例如可以通过一次投予的细胞数、每天投予的次数、每月投予天数等来规定。
(5)投予工序
(a)投予的详细情况
投予，只要通过公知的方法具体有静脉滴注、注射等，进入非人动物的体内，特别是血管内即可，其方法没有特别限定，为了将大量LAK细胞送入体内，优选静脉滴注。
进行静脉滴注时的投予量，虽然根据作为对象的动物的种类、疾病的种类等有所不同，但体重每1kg，优选为1×10⁶细胞～5×10⁷细胞，更优选为5×10⁶细胞～1×10⁷细胞。另外，投予频率，虽然也根据作为对象的动物的种类、疾病的种类等有所不同，但优选1次/10天～1次/14天或2次/月～3次/月，更优选1次/7天～1次/8天或4次/月～5次/月。
(b)作为治疗对象的疾病
作为该治疗方法的对象的癌或肿瘤，可以举出肺癌、胃癌、肝癌、胰脏癌、大肠癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫癌、膀胱癌、白血病、骨肉瘤、脑肿瘤等癌或肿瘤等，但不限于此。
作为该治疗方法的对象的免疫缺陷病，可以举出慢性风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、干燥(Sjogren)综合症、重症肌无力、恶性贫血、桥本病、AIDS等，但不限于此。
作为该治疗方法的对象的感染症，可以举出犬瘟热病毒、狂犬病病毒、细小病毒(Parvovirus)、猫艾滋病等病毒感染症，细菌感染症，丝虫、弓浆虫等原虫感染症，犬毛囊虫症、耳螨等螨引起的感染症等，但不限于此。
4.增殖试剂盒
本发明的LAK细胞的增殖法中使用的植物凝集素、具有白细胞介素-2样活性的增殖因子、培养基、细胞培养容器等增殖所必需的各构成要素可以分别购入使用。但是，如果将这些组合，事先制成增殖试剂盒，则可以省去分别购入各构成要素的工夫，可以更容易地进行细胞的增殖。
该增殖试剂盒，因为是包含例如必需的植物凝集素、具有白细胞介素-2样活性的增殖因子的简易试剂盒，所以是包括至在其中包含培养基、细胞培养容器或此外的构成要素例如其他增殖因子的物质在内的广义概念。另外，该增殖试剂盒，不仅组合有上述构成要素，而且还可以增加各种各样的设置。
例如，也可以将植物凝集素在培养容器中固相化。从而，不仅可以省略植物凝集素的计量，更容易地进行细胞培养操作，而且可以使植物凝集素和LAK细胞充分接触，促进其增殖。植物凝集素的固相化，可以通过将含有植物凝集素的溶液加入细胞培养容器，直接静置，从而固相化来进行。
另外，也可以将具有白细胞介素-2样活性的增殖因子溶解于例如水、生理盐水、磷酸缓冲液、培养基等，一次量地分注、冷冻于小型容器，其使用时进行解冻来使用。从而，可以省略具有白细胞介素-2样活性的增殖因子的计量。
进而，也可以将包含培养基、植物凝集素和具有白细胞介素-2样活性的增殖因子的培养基等分注、冷冻于培养容器，其使用时进行解冻来使用。从而，可以省略细胞增殖、活化所相关的几乎所有操作。
以下，通过实施例更详细地说明本发明，但本发明的权利要求的范围从任何意义上都不限于以下的实施例。
实施例
使用伴刀豆球蛋白A作为植物凝集素，使用人白细胞介素-2作为具有白细胞介素-2样活性的增殖因子，调查LAK细胞的最适的增殖条件等。
1.伴刀豆球蛋白A浓度的优化
(1)起始试样的采取
用注射器从宠物犬(doggy)(6岁)的颈静脉取30ml全血(用肝素防止凝固)。之后离心，加入得到的末梢血颗粒的10倍量的(a)NH₄Cl缓冲液(NH₄Cl：0.83g/100ml蒸馏水)、(b)Tris base(20.6g/1000ml蒸馏水、pH7.2)、(c)所述的(a)和(b)以9∶1混合的过滤灭菌的溶液，在冰中放置5分钟(时常搅拌)、使血液中所含的红血球破裂。
将3ml的比重液(犬淋巴球分离用，Cedarlane公司制造的淋巴细胞(Lympholyte))平均地装入2根离心管中，并将进行了破裂处理的血液以不打乱液面的方式缓慢层叠于其上。将该离心管放入离心分离机，在室温以800×g进行20分钟离心分离，用注射器或灭菌巴斯德氏吸管采取含淋巴球的提取物。
采取的提取物悬浮于培养基，制成细胞悬浊液，将该细胞悬浊液在室温以300×g进行5分钟离心分离，通过倾析除去上清，对细胞进行洗涤。进行3次细胞洗涤后，将洗涤后的细胞悬浮于5ml的培养基(细胞密度：4.76×10⁷细胞/ml)。培养基使用RPM I 1640培养基(日水制药制造，以下简称为培养基)。
(2)细胞的增殖
将离心管中的细胞悬浊液移入试验管，加入培养基，将细胞数调整为1×10⁶细胞/ml，添加在56℃进行了30分钟失活处理(inactivation)的狗血清(从输血用犬采取)和胎牛血清(JRH Biosciences公司制造的胎牛血清(Fetal BovineSerum))，使各自的终浓度为2％、10％，将其接种在2片6孔板上，使每孔2ml(2×10⁶细胞/孔)。接着，在各孔添加伴刀豆球蛋白A(Elastin products公司制造伴刀豆球蛋白A)，使其终浓度为1、5、10、15μg/ml，制成伴刀豆球蛋白A的终浓度不同的4个组。
然后，将各板配置于37℃、二氧化碳气体浓度5％的CO₂恒温箱中，开始细胞的增殖。另外，测定从细胞增殖开始到第14天为止的细胞数的增减，求出各组的平均值。这里，细胞数是，混合细胞悬浊液20μl和台盼蓝染色液20μl，用血球计算板(ERMA公司制造的Burker-turk血球计算板)和显微镜测定其中1μl所含的细胞数，基于测定结果算出的。
(3)实验结果
如此测定的细胞数变化如表1和其图线化的图1所示。从表1和图1明确可知，伴刀豆球蛋白A的浓度为5μg/ml是最适当的。
表1