一种鱼软骨提取物的制备方法及所得的产品 【技术领域】
本发明涉及一种鱼软骨提取物的制备方法及所得的产品。
背景技术
胶原蛋白肽是人体结缔组织中的主要成分，是人体的皮肤、骨骼、肌腱、软骨、血管的构成材料，占体内蛋白质总量的三分之一。胶原蛋白肽的蛋白质消化吸收率几乎达100％，据文献报道胶原蛋白肽具有保护胃粘膜、促进皮肤胶原代谢、抑制血压上升、促进钙吸收和降低血清中胆固醇含量等多种功效，因此胶原蛋白肽被广泛应用于医药、食品、美容、饲料生产、化工等各领域，是市场紧缺型物资。
硫酸软骨素一般是从动物软骨组织中提取的天然酸性粘多糖，具有高度保水和保持关节的粘弹性、润滑作用。近年来，随着研究的不断深入，发现硫酸软骨素还具有抗炎、抗病毒和抗肿瘤等活性，来自鱼软骨的硫酸软骨素远远优于猪、牛软骨来源的硫酸软骨素。特别是鲨鱼本身经多次检验，无一例癌细胞存在。用鲨鱼软骨生产的硫酸软骨素，临床上显示有强烈的抗癌、治癌作用。硫酸软骨素对心血管疾病的治疗有一定疗效，更是一些保健品和化妆品的重要原料。硫酸软骨素还具有多种生物活性，在许多领域广泛使用。
生产胶原蛋白肽的原料主要来源于牛、猪及鸡等陆产动物。但随着近年来，疯牛病、口蹄疫、禽流感等家畜家禽类疫病问题接连发生，加上一些消费者使用此类胶原蛋白肽有过敏的倾向，陆产胶原蛋白肽的安全性受到质疑。人们开始对从水产动物的皮、软骨、鳍、鳞等中提取安全性更高、无病毒污染和卫生无害的胶原蛋白肽有了更多的关注。硫酸软骨素可从鲨鱼软骨、鳍中提取，但成本较高，而鱼鳞原料难以得到。我国鱼类产量居世界首位，年产量近4000万吨，在一般的水产品加工过程中，鱼软骨、废弃鱼头常作为下脚料，或加工成鱼骨粉添加于家禽饲料中，但更多的鱼软骨、鱼头被丢弃，造成环境污染和资源浪费。
目前，在一些相关专利中一般都展示了从鱼骨中酶法制取鱼胶原肽的工业生产方法或从动物软骨提取硫酸软骨素的方法。但是，都只能提取其中一种成分，常常会将另一成分忽视，造成巨大的浪费。并且操作步骤繁多复杂。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题是克服现有的生产硫酸软骨素和/或胶原蛋白肽的方法对原料利用不充分，产品有效成分较低，且原料有污染威胁或步骤繁杂等缺陷，提供了一种鱼软骨提取物的制备方法及所得产品。本发明不仅能解决市场紧缺胶原蛋白肽和硫酸软骨素的问题，真正的化废为宝，合理充分利用自然资源，做到物尽其用，减少环境污染；而且原料成本低廉，产品安全性能高，有效成分含量高。
本发明的鱼软骨提取物的制备方法包括如下步骤：将鱼软骨进行碱性蛋白酶酶解，得到酶解液，之后再进行风味蛋白酶酶解，然后灭酶、去杂，即得鱼软骨提取物。所述的鱼软骨提取物含有硫酸软骨素、鱼胶原蛋白肽和水。
下面，进一步的对本发明的鱼软骨提取物的制备方法进行详细介绍：
(1)原料预处理：所述的鱼软骨可由下述方法制得：将洗净的鱼软骨原料，加热处理去杂、取软骨。其中，所述的鱼软骨原料为本领域常规使用的水产品的含软骨部位，较佳的为鲑鱼(Oncorhynchnchus Spp.)、孔鳐鱼(Rajaporosa)和鲨鱼(prionace glauca(Linnaeus))中的一种或多种的含软骨部位；所述的加热处理的加热温度较佳的为70℃～100℃，加热时间较佳的为10～30min；所述的加热处理所使用的设备为本领域常规使用的设备，较佳的为反应罐、水浴锅或压力锅。所述的软骨还可以进一步机械粉碎，有助于鱼软骨提取物的提取，所述的机械粉碎所使用的设备为本领域常规使用的设备，较佳的为具有物理破坏粉碎功能的均质机、超声波或果汁机。
(2)蛋白酶酶解
碱性蛋白酶酶解：所述地碱性蛋白酶酶解的条件为本领域常规步骤条件，较佳的是向鱼软骨中加水，调pH碱性后，添加碱性蛋白酶酶解。其中，所述的加水的水的用量较佳的为鱼软骨重量的0.8～2倍；所述的pH较佳的为7.5～9.0；所述的调pH用本领域常规使用的碱调节，较佳的为氢氧化钠；所述的碱性蛋白酶的用量较佳的为鱼软骨重量的0.05～0.25％；所述的碱性蛋白酶酶解的温度较佳的为50～65℃，碱性蛋白酶酶解的时间较佳的为0.5～3h；所述的碱性蛋白酶为本领域常规使用的碱性蛋白酶，较佳的为Alcalase3.0T或Alcalase2.4L碱性蛋白酶。
风味蛋白酶酶解：所述的风味蛋白酶酶解的步骤为本领域常规步骤条件，较佳的是将酶解液调为pH酸性，添加风味蛋白酶酶解。其中，所述的pH较佳的为6.0～7.0；所述的调pH用本领域常规使用的酸调节，较佳的为盐酸；所述的风味蛋白酶的用量较佳的为鱼软骨重量的0.03％～0.25％；所述的风味蛋白酶酶解的温度较佳的为50～65℃，风味蛋白酶酶解的时间较佳的为0.5～3h；所述的风味蛋白酶为本领域常规使用的风味蛋白酶，较佳的为Novo风味蛋白酶。
本发明中，蛋白酶酶解是先碱性蛋白酶酶解，然后再风味蛋白酶酶解。所述的碱性蛋白酶的酶解作用是切断鱼软骨中粘多糖与蛋白的结合，将硫酸软骨素从蛋白上酶解下来，使硫酸软骨素与蛋白分离，实现粘多糖与胶原蛋白初步分离；所述的风味蛋白酶的作用是将鱼软骨中大分子的胶原蛋白酶解成小分子的胶原蛋白肽，溶于酶解液中。这两种蛋白酶的复合使用为分离获得硫酸软骨素和/或胶原蛋白肽做好准备。
(3)灭酶、去杂：所述的灭酶、去杂步骤为本领域常规步骤条件，优选的条件包括如下：升温到一定温度后停止加热，降温，离心，过滤去杂，即得鱼软骨提取物。其中，所述的升温的温度较佳的为80～100℃；所述的降温较佳的为降温至75℃以下；所述的离心的较佳条件为：2000～6000r/min离心15～40min；所述的过滤的过程较佳的可以添加适量助滤剂白陶土或硅藻土助滤。
本发明所制得的鱼软骨提取物含有硫酸软骨素、鱼胶原蛋白肽和水。其中，所述的鱼胶原蛋白肽是一种羟脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸含量占35％以上，分子量为206～400道尔顿的小分子胶原蛋白肽；所述的硫酸软骨素为糖基是葡萄糖醛酸和乙酰氨基半乳糖，分子量为5000～15000道尔顿的硫酸软骨素。
本发明还可以将上述制得的鱼软骨提取物过膜分子筛进行分子量切割，进一步分离制得鱼胶原蛋白肽和/或硫酸软骨素。
本发明一较佳实施例：将上述制得的鱼软骨提取物过膜分子筛进行分子量切割，膜透过液经干燥，即制得鱼胶原蛋白肽。
本发明另一较佳实施例：将上述制得的鱼软骨提取物过膜分子筛进行分子量切割，膜浓缩液经干燥，即制得硫酸软骨素。
本发明又一较佳实施例：将上述制得的鱼软骨提取物过膜分子筛进行分子量切割，膜透过液经干燥，即制得鱼胶原蛋白肽；膜浓缩液经干燥，即制得硫酸软骨素(工艺流程如图1)。
下面，进一步的对上述的较佳实施例的步骤进行详细介绍：
(1)膜分子筛分离：将滤液加水稀释至1.5～2.5倍滤液质量，过生物膜分子筛进行分子量切割，得到膜透过液和膜浓缩液。其中，所述的分子量切割的操作条件较佳的为温度范围为30～70℃，压力范围较佳的为1.5～7公斤/平方厘米的条件下进行分子量切割，循环分离0.5～2h。所述的膜分子筛选用本领域使用的生物膜分子筛，较佳的截留分子量为5000～15000道尔顿的卷式膜、管状膜或中空纤维膜。
(2)将所得的膜透过液干燥成小分子鱼胶原蛋白肽粉末；将所得膜浓缩液干燥制得硫酸软骨素粉末。其中，所述的干燥方式为本领域常规使用的干燥方式，较佳的为喷雾干燥或冷冻干燥。
本发明的上述的各技术特征可以任意组合，得到较佳的技术方案用于由鱼软骨制备鱼胶原蛋白肽和/或硫酸软骨素。
本发明所制得的产物鱼胶原蛋白肽经氨基酸分析法分析，为一种羟脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸含量占35％以上，胶原蛋白肽含量达72％以上，分子量约为206～400道尔顿的小分子胶原蛋白肽；制得的硫酸软骨素经三氟乙酸水解法测得糖基为葡萄糖醛酸和乙酰氨基半乳糖，硫酸-咔唑法检测硫酸软骨素纯度达40％～90％，其分子量在5000～15000道尔顿；百分比为质量百分比。其中，硫酸-咔唑法的原理是根据硫酸软骨素的分子量为503.3，葡萄糖醛酸的分子量为194.1，以503.3/194.1＝2.593为系数，于530nm处测得吸光值，计算出葡萄糖醛酸的含量，再乘以系数2.593，即得硫酸软骨素的含量。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
1.本发明通过将鱼软骨经复合酶解法的酶解作用制得鱼软骨提取物，同时几个较佳的实施例充分利用膜分子筛分子量切割技术，制备了胶原蛋白肽和/或硫酸软骨素。本发明克服了现有的生产胶原蛋白肽和/或硫酸软骨素的原料利用不充分，产品有效成分较低，且避免了利用猪、牛软骨等陆产动物软骨原料有流行疫病造成不安全因素的威胁，使用大量有机试剂污染环境或步骤繁杂等缺陷，利用两种蛋白酶酶解，进一步提高了原料利用价值，从一个简单的工艺流程，获得市场紧缺产品，解决市场紧缺胶原蛋白肽和硫酸软骨素的问题。同时本发明所使用的原料为废弃鱼软骨，是真正的化废为宝，合理充分利用自然资源，做到物尽其用，减少环境污染，而且原料成本低廉。
2.本发明所制得的鱼胶原蛋白肽是一种高回收率、高渗透率的小分子鱼胶原蛋白肽，相较于陆产动物胶原，分子量小，韧性也较好；本发明制得的硫酸软骨素可应用于医药原料、保健食品、一般食品、化妆品等各个方面。
【附图说明】
图1为本发明的一较佳实施例的制备硫酸软骨素和鱼胶原蛋白的工艺流程图。
【具体实施方式】
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
下述实施例中，所制得的鱼胶原蛋白肽通过氨基酸分析法检测胶原蛋白肽纯度(总氨基酸含量)及羟脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸的含量(质量百分比)；所制得的硫酸软骨素通过三氟乙酸水解法检测糖基，咔唑-硫酸法测得其纯度，乌氏粘度法测分子量。
实施例1
取洗净的鲑鱼(Oncorhynchnchus Spp.)头适量，于反应罐中100℃加热10min，分离软骨500g以均质机粉碎，加500g水，用10％氢氧化钠调pH为8.5，加入原料重量0.1％的Alcalase 3.0T碱性蛋白酶于65℃酶解1h，用1％盐酸调pH为6.5，添加原料重量0.05％的Novo风味蛋白酶于65℃酶解2h。升温至95℃灭酶，降温至70℃，4000r/min离心30min，过滤去杂，加入80g白色粗硅藻土助滤，滤液加水稀释至2倍滤液质量，过截留分子量为5000的卷式膜分子筛，在50℃、压力为2公斤/平方厘米的条件下进行分子量切割，循环分离1h，收集膜透过液减压浓缩喷雾干燥为鱼胶原蛋白肽粉末；收集膜内浓缩液喷雾干燥为硫酸软骨素粉末。
制得鱼胶原蛋白肽羟脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸的含量为35.3％，胶原蛋白肽含量为72％，分子量为206道尔顿；硫酸软骨素经检测糖基为葡萄糖醛酸和乙酰氨基半乳糖，分子量为1.5万道尔顿，纯度为40％。
实施例2
取洗净的孔鳐鱼(Raja porosa)适量，于反应罐中85℃加热20min去杂，分离软骨500g以均质机粉碎，加500g水，用10％氢氧化钠调pH为7.5，加入软骨重量0.2％的Alcalase 3.0T碱性蛋白酶于55℃酶解0.5h，用1％盐酸调pH为6.0，添加软骨重量0.2％的Novo风味蛋白酶于55℃酶解1h。升温至85℃灭酶，降温至50℃，4000r/min离心30min，并过滤去杂，加80g白陶土助滤。滤液加水稀释2倍滤液质量，过截留分子量为5000的管式膜分子筛在70℃、压力为2公斤/平方厘米的条件下进行分子量切割，循环分离1.5h，收集膜透过液减压浓缩喷雾干燥为鱼胶原蛋白肽粉末；收集膜浓缩液，喷雾干燥为硫酸软骨素粉末。
制得鱼胶原蛋白肽羟脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸的含量为36.2％，胶原蛋白肽含量为85％，分子量为350道尔顿；制得的硫酸软骨素经检测糖基为葡萄糖醛酸和乙酰氨基半乳糖，分子量为1.1万道尔顿，纯度为70％。
实施例3
取洗净的鲨鱼(prionace glauca(Linnaeus))骨适量，于水浴锅中75℃加热30min去杂，分离500g软骨以均质机粉碎，加600g水，用10％氢氧化钠调pH为9，加入原料重量0.25％的Alcalase 2.4L碱性蛋白酶于50℃酶解0.5h，用1％盐酸调pH为6.8，添加原料重量0.25％的Novo风味蛋白酶于50℃酶解0.5h。升温至80℃灭酶，降温至45℃，2000r/min离心40min离心，过滤去杂，并加80g硅藻土助滤，滤液加水稀释2倍滤液质量，过截留分子量为15000的中空纤维膜分子筛在低于50℃、压力为1.5公斤/平方厘米的条件下进行分子量切割，循环分离2h，收集膜透过液减压浓缩喷雾干燥为鱼胶原蛋白肽粉末；收集膜浓缩液，喷雾干燥为硫酸软骨素粉末。
制得鱼胶原蛋白肽羟脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸的含量在35％，胶原蛋白肽含量为83％，分子量为315道尔顿；硫酸软骨素经检测糖基为葡萄糖醛酸和乙酰氨基半乳糖，分子量为1.2万道尔顿，纯度为90％。
实施例4
取洗净的鲑鱼(Oncorhynchnchus Spp.)头适量，于反应罐中70℃加热30min，分离软骨500g以均质机粉碎，加400g水，用10％氢氧化钠调pH为8.5，加入原料重量0.05％的Alcalase 3.0T碱性蛋白酶于50℃酶解3h，用1％盐酸调pH为7.0，添加原料重量0.03％的Novo风味蛋白酶于55℃酶解3h。升温至100℃灭酶，降温至75℃，6000r/min离心15min，过滤去杂，加入80g白色粗硅藻土助滤，得到鱼软骨提取物。制得的鱼软骨提取物含有鱼胶原蛋白肽、硫酸软骨素和水。鱼胶原蛋白肽的分子量为306道尔顿，羟脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸的含量在35％以上；硫酸软骨素的糖基为葡萄糖醛酸和乙酰氨基半乳糖，分子量为5000道尔顿；百分比为质量百分比。
实施例5
取洗净的鲑鱼头(Oncorhynchnchus Spp.)和鲨鱼(prionaceglauca(Linnaeus))骨适量，于反应罐中100℃加热10min，分离软骨500g以均质机粉碎，加1000g水，用10％氢氧化钠调pH为8.5，加入原料重量0.15％的Alcalase 3.0T碱性蛋白酶于65℃酶解2h，用1％盐酸调pH为6.5，添加原料重量0.15％的Novo风味蛋白酶于65℃酶解1.5h。升温至95℃灭酶，降温至70℃，4000r/min离心30min，过滤去杂，滤液加水稀释1.5倍滤液质量，过截留分子量为8000的卷式膜分子筛，在30℃、压力为7公斤/平方厘米的条件下进行分子量切割，循环分离0.5h，收集膜透过液减压浓缩冷冻干燥为鱼胶原蛋白肽粉末。
制得鱼胶原蛋白肽羟脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸的含量为35％，胶原蛋白肽含量为75％，分子量为400道尔顿。
实施例6
取洗净的孔鳐鱼(Raja porosa)适量，于反应罐中85℃加热20min去杂，分离软骨500g，加750g水，用10％氢氧化钠调pH为7.5，加入软骨重量0.2％的Alcalase 3.0T碱性蛋白酶于55℃酶解0.5h，用1％盐酸调pH为6.0，添加软骨重量0.2％的Novo风味蛋白酶于55℃酶解2.5h。升温至85℃灭酶，降温至50℃，4000r/min离心30min，并过滤去杂，加80g白陶土助滤。滤液加水稀释2.5倍滤液质量，过截留分子量为5000的管状膜分子筛在低于70℃、压力为7.0公斤/平方厘米的条件下进行分子量切割，循环分离0.5h，收集膜浓缩液，喷雾干燥为硫酸软骨素粉末。
制得的硫酸软骨素经检测糖基为葡萄糖醛酸和乙酰氨基半乳糖，分子量为9000道尔顿，纯度为80％。
综上所述，本发明方法制得的鱼软骨小分子胶原蛋白肽和硫酸软骨素，在无大量有机试剂污染的同时节省了企业在处理废液排放的负担；本发明方法工艺流程制得的胶原蛋白肽和硫酸软骨素纯度高，质量安全，并且提高了废弃鱼软骨的利用价值。