黄芩中黄芩苷及黄芩总苷元同时提取分离工艺 【技术领域】
本发明涉及一种黄芩中黄芩苷及黄芩总苷元同时提取分离工艺。
背景技术
黄芩是一种常用中药，为中国药典历版所收载品种，具清热燥湿、泻火解毒、止血安胎之功效。用于湿温，暑温，胸闷呕恶，湿热痞满，泻痢，黄疸，肺热，咳嗽，高热，烦咳，血热吐衄，痈肿疮毒，胎动不安。文献报道，黄芩的有效成分是黄芩苷、汉黄芩苷及其苷元等黄酮类化合物。而且黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A等黄芩苷元类具有非常强的抗菌、消炎、解热、镇痛等生物活性，远较其苷类的生物活性强，在人体内的吸收是苷类的数倍至数十倍，且毒副作用更低。虽然黄芩苷元类具有上述诸多生物活性及吸收特点，但由于其制备技术的难度所限，很难进行规模化大生产，因此影响了该有效部位的新药开发与临床应用。目前虽已有不少黄芩中黄芩苷与黄芩总苷元提取工艺的专利问世，但都是黄芩苷与黄芩总苷元分别单独提取工艺，造成原药材资源不能充分利用，因为提取黄芩苷时，其总苷元会丢失；提取黄芩总苷元时，其苷类会丢失；原因是单独提取依据的原理不同，黄芩苷易溶于水，采用水提取，酸沉淀，碱溶解，水、醇精制的工艺；而黄芩苷元类，属脂溶性成分，不溶于水，可溶于乙醇、易溶于乙酸乙酯、石油醚、三氯甲烷等脂溶性溶剂，所以提取工艺：先酶解数小时到数十小时后，弃去酶解溶液，分取残渣，烘干后，加乙醇或乙酸乙酯、石油醚、三氯甲烷等有机溶剂，提取残渣2～3次，每次数小时，合并有机溶剂提取液，回收有机溶剂，得到黄芩总苷元类。完成一批药材提取至少要花费4～5天时间。提取周期长，不但造成了黄芩苷元类的破坏、损失、提取率低，而且成本高、安全系数低、要求设备要耐压、密封。至今未查阅到黄芩苷与黄芩总苷元同时提取分离的工艺报道。在自然资源日益减少的今天，开发简便、快捷、高收率、低成本、充分利用药材资源的黄芩苷与黄芩总苷元同时提取分离工艺无疑是一件很有意义的工作。首先对目前已公布的黄芩中黄酮总苷元提取工艺，进行一下分析、汇总：
专利1“黄芩中总黄酮苷元的制备方法”(专利公开号：CN 1583775A)，具体提取步骤是：取黄芩药材粗粉，加水1～3倍，在37℃保温酶解1～4小时，60℃以下干燥6小时，用有机溶剂(甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷、乙醚、石油醚)回流提取1～3次，回收有机溶剂得黄芩总黄酮苷元提取物，其收率为5～8％，总黄酮苷元含量为45～65％。
本专利看似简单，但存在3点不足之处：其1药材原粉加水酶解后，药粉60℃干燥6小时，酚类成分损失破坏多，原药材利用率低。其2所采用的有机溶剂，易燃易暴，生产安全系数低，导致产物中毒害溶剂残留，除乙醇外，采用其他有机溶剂都必须测定产物中的溶剂残留。其3酶解不完全，总黄酮苷元中还含多量的黄芩苷类，提取率低，成本高，污染环境，危害健康。
专利2“黄芩总黄酮苷元提取工艺”(专利公开号：CN 1359903A)，具体提取步骤是：取黄芩粉碎为粗粉，加入1～10倍生药量水，煮沸后冷却，搅拌均匀，加盖密封，静置、取出、烘干，照流浸膏和浸膏剂项下的渗漉法，加入0.2～2倍量乙醇，搅拌均匀，湿润装入渗漉筒，加入0.2～2倍量乙醇密封浸泡，继续加至5～20倍量的乙醇渗漉，渗漉液减压回收乙醇至相对密度1.01～1.04，烘干，即得。
本专利存在的弊端是：1.多处无参数，如烘干温度，加盖密封静置时间，密封浸泡等，尤其是烘干温度的高低直接影响黄酮苷元的质量。2.加水煮沸程序，严重影响苷元的提取率，因为各种酶在80℃以上是不能生存的，酶被杀死，酶解率降低，苷元的收率自然低，产品中会含有大量未酶解的黄芩苷类。3.大量乙醇渗漉提取，花费溶剂、耗费时间，提取效率远低于回流提取。4.总黄酮苷元只报道得率，无科学分析结果，难以判断产物中苷类与苷元类比例，无法评判总黄酮苷元的质量。
专利3“黄芩苷元的提取方法及其在抗炎、镇痛中的应用”(专利公开号：CN1566107A)，具体提取步骤是：以黄芩为原料，粉碎后加入5～8倍甲醇，混匀后在200Mpa和600Mpa的压力下，分别持续作用5分钟，除去沉渣，再通过旋转蒸发除去甲醇，收集析出物，烘干后即得黄芩提取物。
本专利采用的是加压水解黄芩苷元，虽然工艺简单，但对设备有特殊要求，要能耐受200Mpa和600Mpa的高压，还要配备大型的旋转蒸发设备。在车间大量生产时，能否采用，还必须与设备专家配合进行再研究。本工艺的提取率太低，仅3.5～3.8％，其中黄芩苷元含量在50％以上(无科学分析数据)。
专利4“一种黄芩总黄酮苷元提取物、黄芩单体黄酮苷元及其制备方法与应用”(专利授权公告号：CN 1313459C)，具体制备步骤是：将黄芩粉碎，过4号筛，称取粉末100g，加入41～46℃蒸馏水110～120ml，在41～46℃保温4.1～4.8小时后，取出，于80℃热风干燥。将干粉置索氏提取器中，加无水乙醇加热回流提取，减压回收溶剂，得黄芩总黄酮苷元提取物12.6～13.2g，其中黄芩素为7.7～8.0g。
本工艺虽是比较简便的一条工艺，提取量和提取率也较理想，但仍需要先酶解，再干燥，最后无水乙醇索氏提取，带来了溶剂的无法套用，成本的提高。实验室的索氏提取，在大生产中是无法达到其提取量和提取率的，另外药材粉末在大生产中提取后，过滤也是一件困难的问题。
专利5“一种黄芩黄酮总苷元提取物的制备方法”(专利公开号：CN 101008022A)，具体制备步骤是：取黄芩药材粉碎，过6～40目筛，加水4～10倍，加热至40～70℃并保温5～24小时，进行酶解反应，反应完全后过滤，弃去滤液，药渣加3～12倍量的不同浓度的乙醇回流提取2～4次，每次0.5～2.5小时，过滤，合并乙醇提取液，减压回收乙醇至无醇味，放冷，析出沉淀，过滤，干燥，得黄芩黄酮总苷元提取物，其黄芩素含量为33.0～37.1％，总黄酮含量为74.2～77.8％。
本专利与专利4基本大同小异，先酶解，然后用含水乙醇提取，因药材粉末细，酶解后的药粉混旋液不易过滤，若投料数百公斤的大生产，过滤问题就更难解决。生产过程中黄酮酚类成分损失多，收率低，黄芩素含量仅为33.0～37.1％。总黄酮含量应包括苷类和苷元类，且多是紫外分光光度法测定的含量，这样，会比用HPLC法，以对照品为对照，测定的含量要高的多。
综上所述，各发明专利都存在一个共同的缺点，即只有投药药材重量和黄芩总苷元的重量，以黄芩总苷元的重量除以药材重量得出提取率。实际这种提取率是无任何意义的，因为既没报道所用药材的含量，也没报道黄芩总苷元的含量。即便是相同的提取率，因药材的含量不同，提取的黄芩苷元量会相差很大，而且苷元含量也是高低不一，所以无法计算各工艺的提取率，也就无法对各工艺做出科学评价。
【发明内容】
本发明就是针对上述各专利的不足之处，发明了一种不需任何有机溶剂，只用常水和少量无机酸类，先酶解、悬浮、分离脂溶性黄芩总苷元，再酸沉淀、分离水中溶解的黄芩苷的综合提取分离工艺。该工艺能最大限度地将药材中的苷与苷元类同时提取分离至尽，所得产物用HPLC法测定，黄芩苷含量在65％以上，黄芩素含量在60％以上，三种黄酮苷元含量之和在75％以上，黄芩素收率在70％以上。该工艺的特点是：药材中的有效成分提取充分，苷与苷元类收率高，纯度高；工艺简便，快捷，设备简单，周期短、成本低、无污染，适用于大生产。
本发明解决其技术问题所采用的方案为：
1.净选黄芩饮片或药材个子货，破碎为0.5cm以下地碎块。
2.按药材重量比，加5～12倍量的37～68℃常水，在同一温度下酶解提取两次，每次2～4小时，滤取悬浮液，静置，沉淀。药渣继续加3～6倍量的37～68℃常水，酶解提取1～2小时后，煮沸提取1～2小时，滤取悬浮液，静置，沉淀，药渣弃去。
3.分取三次静置的上清溶液，备用；沉淀物减压滤过，60℃干燥或加适量水喷雾干燥，得黄芩总苷元。
4.取备用的上清液，用盐酸调PH值为2～3，70～80℃保温1～3小时，静置沉淀，弃去上部悬浮液或上清液，水洗，分取沉淀，60℃干燥或加适量水喷雾干燥，得黄芩苷。
5.以对照品黄芩苷、黄芩素、汉黄芩、千层纸素A为对照，采用高效液相法测定黄芩苷和黄芩总苷元中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩、千层纸素A的含量，黄芩苷含量在65％以上，黄芩素含量在60％以上，三种黄酮苷元含量之和在75％以上，黄芩素收率在70％以上。
本发明的原理：
在黄芩生药中黄芩苷类与黄芩酶是同时共存的，黄芩苷类易溶于热水，黄芩苷元类不溶于热水。黄芩酶在适宜的温度下，可以不断地将黄芩苷类酶解为黄芩苷元类，并随即被悬浮析出。利用悬浮的苷元类黄白细腻，很易通过60目筛网，而黄芩碎块和溶解的黄芩苷不被滤出的粒度和溶解度之差，及时地将析出的苷元类分离获得。最后将溶解在水中的未被酶解的部分黄芩苷，加酸，沉淀，分离得到。
本发明的创新点及有益效果如下：
1.在提取原理上有了新的发现，突破了多年来相似相溶的提取原则，以水为溶剂，采用非相似相溶的固-液-固提取方法。即固体原料、水溶解提取、酶解悬浮、随即滤取固体总苷元的方法。使提取、酶解能不断地进行，黄芩总苷元在不断地被悬浮，分离。不但酶解、提取完全，而且酶解析出的苷元类尽快得到分离，解决了热分解破坏的难题。苷元类产量大、纯度高。
2.本发明采用的原料是饮片或药材个子货破碎为0.5cm以下的碎块，酶解提取之后，不会形成难于过滤的稀粥样溶液，从源头保证了过滤速度。
3.本工艺与已报道的工艺相比，无单纯的酶解保温、滤过、丢弃酶解溶液和烘干酶解药渣以及大量有机溶剂回流提取、回收等操作步骤。只用常水，采用固-液-固提取方法，先酶解、悬浮、分离脂溶性黄芩总苷元，再酸沉淀、分离水中溶解的黄芩苷，一举两得，最大限度地利用了药材资源。工艺简便、提取周期短、黄芩苷和黄芩苷元收率高、纯度高、成本低、生产安全系数大、无污染、设备简单，适用于连续化大生产。
4.本发明在中药有效成分苷与苷元类的同时提取分离技术上，具表帅与示范作用。提示通过酶解作用进行苷元类提取的中药材，都可考虑试用本发明思路，达到节约资源、提高产量、减少污染、降低成本的目的。
5.本发明为临床开发高效、低毒、生物利用度高的抗菌、消炎、解热、镇痛新药提供了优质、价廉的黄芩苷及黄芩总苷元原料。
【附图说明】
图1为黄芩苷对照品HPLC色谱图。
图2为黄芩素对照品HPLC色谱图。
图3为汉黄芩素对照品HPLC色谱图。
图4为千层纸素A对照品HPLC色谱图。
图5为黄芩药材的HPLC色谱图。
图6实验室提取的黄芩总苷元HPLC色谱图。
图7实验室提取的黄芩苷HPLC色谱图。
图8中试车间提取的黄芩总苷元HPLC色谱图。
图9中试车间提取的黄芩苷HPLC色谱图。
图1中，1为黄芩苷对照品色谱峰。
图2中，2为黄芩素对照品色谱峰。
图3中，3为汉黄芩素对照品色谱峰。
图4中，4为千层纸素A对照品色谱峰。
图5、图6、图7、图8、图9中，
1.为黄芩苷色谱峰 2.为黄芩素色谱峰
3.为汉黄芩素色谱峰 4.为千层纸素A色谱峰
本发明具体实施方式如下：
1.净选黄芩饮片或药材个子货，破碎为0.5cm以下的碎块。
2.按药材重量比，加5～12倍量的37～68℃常水，在同一温度下酶解提取两次，每次2～4小时，滤取悬浮液，静置，沉淀。药渣继续加3～6倍量的37～68℃常水，酶解提取1～2小时后，煮沸提取1～2小时，滤取悬浮液，静置，沉淀，药渣弃去。
3.分取三次静置的上清溶液，备用；沉淀物减压滤过，60℃干燥或加适量水喷雾干燥，得黄芩总苷元。
4.取备用的上清液，用盐酸调PH值为2～3，70～80℃保温1～3小时，静置沉淀，弃去上部悬浮液或上清液，水洗，分取沉淀，60℃干燥或加适量水喷雾干燥，得黄芩苷。
5.以对照品黄芩苷、黄芩素、汉黄芩、千层纸素A为对照，采用高效液相法测定黄芩苷和黄芩总苷元中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩、千层纸素A的含量，黄芩苷含量在65％以上，黄芩素含量在60％以上，三种黄酮苷元含量之和在75％以上(见图1～8)，黄芩素收率在70％以上。
按上述提取分离程序，提取了4批样品，采用HPLC法测定的结果见附表。
附表 黄芩苷和黄芩总苷元含量测定(HPLC法)结果
注：*为实验室提取、分离，60℃干燥的样品。#：为中试车间提取、分离，喷雾干燥的样品。
公式中：270为黄芩素分子量
446为黄芩苷分子量。