铜绿假单胞菌水解弹性蛋白能力相关基因PA5022及其应用 【技术领域】：
本发明属于微生物生物技术领域，特别涉及一种铜绿假单胞菌水解弹性蛋白能力相关基因PA5022及其应用。
【背景技术】：
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)，属于假单胞菌科(Familypseudomonas)假单胞菌属(Pseudomonas)，又称为绿脓杆菌。革兰氏阴性菌，广泛分布于自然界中(如土壤、水和空气)，正常人体的皮肤、肠道和上呼吸道中，是一种重要的条件致病菌。在一些慢性疾病、某些导致宿主免疫功能受损的因素中，易引起支气管-肺部的原发性铜绿假单胞菌感染。同时也是严重烧伤、创伤感染病人，囊性纤维变病人及晚期肿瘤患者死亡的重要原因，常引起菌血症、肺炎、泌尿系统感染、烧伤感染和支气管扩张、慢性支气管炎及囊性纤维化继发感染等疾病，严重危害着人类的健康和生命。
铜绿假单胞菌弹性蛋白酶是一种重要的毒力因子，由lasB基因编码。该酶的合成受到群体密度感应系统(quorum sensing)的调控。群体密度感应系统是细菌之间相互交流以感知外界环境从而协调特定基因表达的一种方式。最近，已经发现越来越多的调节子能够调控群体密度感应系统，进而在转录及转录后水平上调控着弹性蛋白酶的表达。弹性蛋白酶是一种胞外蛋白酶，通过II型分泌系统分泌到胞外。目前已经发现II型分泌系统由12-16个组分组成。
对弹性蛋白水解能力相关基因的研究可以进一步完善群体密度感应系统对弹性蛋白酶的调控网络，揭示弹性蛋白酶的分泌调节过程。研究新基因的功能，探索铜绿假单胞菌的致病机制，为药物设计提供新的靶位点，为预防和抑制铜绿假单胞菌的感染提供理论依据。
【发明内容】：
本发明目的是提供与菌株水解弹性蛋白能力相关的新基因，研究其在弹性蛋白水解能力中的作用，以此为靶位点，设计新的抗菌药物，预防和治疗铜绿假单胞菌引起的感染。
本发明提供的铜绿假单胞菌水解弹性蛋白能力相关基因PA5022，是如序列表序列1所示核苷酸序列。
上述的铜绿假单胞菌水解弹性蛋白能力相关基因PA5022可以用于以该基因为新药靶点设计并制备抑制菌体水解弹性蛋白能力的药物，以降低其毒力及致病性，增强抗生素的药效。
本发明基因PA5022的获得方法：利用Mu转座重组技术，构建转座子插入突变文库，筛选弹性蛋白水解能力降低的突变子，提取突变菌株的基因组DNA，用Kpn I酶切基因组DNA，酶切片段与pUC18载体连接，通过电转化将连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂在含氨苄青霉素和卡那霉素双抗的LB平板上，经过PCR和酶切鉴定，筛选阳性转化子，测序确定转化子中Mu所插入片段的核苷酸序列，经NCBI中Blast比对确定Mu所插入的基因位置。
本发明的有益效果：
PA5022基因Mu转座子插入失活的突变株水解弹性蛋白能力降低，说明此基因与铜绿假单胞菌弹性蛋白酶的合成调控或分泌过程有关，而此前该基因是一个功能完全未知的新基因，本实验首次发现其与弹性蛋白水解能力相关。新基因功能的发现对揭示弹性蛋白酶的合成调控网络、分泌过程、提供药物设计的靶位点，预防和治疗铜绿假单胞菌的感染都有指导意义。
【附图说明】：
图1是菌株水解弹性蛋白能力示意图；
1、野生型PA68作为阳性对照 2、PA5022::Mu PA68突变株。
图2Mu克隆子酶切产物电泳图；
M：DL15000 3、克隆子质粒 4、克隆子质粒用KpnI酶切。
图3.Mu转座子PCR产物电泳图(用PCR方法检测转化子的Mu转座子)；
1、DL2000 2、Mu克隆子PCR产物。
表1.野生型菌株与突变株中lasB、lasI、vqsR基因转录表达水平的测定结果。
【具体实施方式】：
实施例1：使用Mu转座重组技术进行突变子文库的建立
1.从于37℃培养16～20h的新鲜LB固体平板上挑取一个单菌落，转到含有5mL LB液体培养基的试管中，37℃，200rpm，过夜振荡培养14～18h。
2.次日按1∶100转接到含有100mL LB液体培养基的三角瓶中，37℃，200rpm，振荡培养约3-5h，使用752分光光度计测定细菌培养物在540nm处的吸光度，在OD540＝0.5～0.6时，停止培养。
3.在无菌条件下将第2步培养的菌体转移到一个无菌的预冷的50mL离心管中，在冰上放置10min，使培养物冷却至0℃。
4.于4℃，6000rpm，离心10min，收集菌体。
5.倒出培养液，用等体积的预冷的300mM蔗糖重悬菌体，4℃，6000rpm，离心10min。
6.重复(5)，依次用1/2体积、1/5体积预冷的300mM蔗糖溶液重悬、洗涤菌体。
7.最后将细胞溶于1mL 300mM蔗糖溶液中，按100μL/管分装在1.5mL的无菌离心管中，冰浴保存备用。
8.取1μL Mu转座复合物，加入到100μL制备好的PA68感受态细胞中，混匀，吸取混合物加入到预冷的0.2cm电转化杯中，用Bio-Rad电穿孔仪，设置电压2.6kv，进行电击，记录下电击所用的电压和时间。
9.在电击后的转化体系中加入预先37℃温浴的900μL SOC培养基中，37℃，200rpm，复苏1h。
10.取适量复苏后的转化体系涂布在含50μg/mL卡那霉素的LB平板上。37℃培养16-18h，阴性对照不加Mu转座复合物。如果在阴性对照平板上无菌落长出，在抗性LB平板上长出的转化子进行进一步筛选。
11.取2μl转化子培养菌液做模板，以人工Mu转座子上的特异序列Mu1(5’-GCAACTGTCCATACTCTGA-3’)和Mu2(5’-CGCTGGGTTTATCGTCGA-3’)做引物，用PCR方法扩增Mu转座子片段。同时分别以铜绿假单胞菌菌株及质粒pHTH2做阴性及阳性对照。扩增条件为，先在94℃预变性15min，然后，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环，再在72℃延伸10min。
12.PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶中电泳检测，EB染色后紫外灯下观察结果并留照片，具有700bp卡那霉素抗性基因的转化子即为Mu转座突变转化子。
实施例2：水解弹性蛋白能力改变的突变子的筛选
1.在无菌培养皿内铺上一薄层LB培养基，待其凝固后再铺上一薄层弹性蛋白选择培养基(配方如下：每升培养基含：弹性蛋白4g，葡萄糖1g，酵母粉1g，K2HPO41g，KH2PO40.5g，MgSO4·7H2O 0.1g，琼脂粉20g，pH7.0)。从Mu转座子突变文库中活化突变子菌株，用灭菌的牙签挑取菌落点种到培养基表面，37℃培养24-48h。细菌由于水解弹性蛋白地能力不同，在培养基上形成大小不一的透明水解圈，以野生型菌株PA68为对照，筛选弹性蛋白水解能力发生变化的菌株(图1)。
实施例3：铜绿假单胞菌水解弹性蛋白能力相关基因的克隆
第一步、野生型和缺陷株基因组DNA的提取
1.从新鲜划线培养的LB固体平板上挑取野生株或缺陷株单菌落，接种到5mL L-broth液体培养基中，37℃，200rpm，过夜培养；
2.次日按1∶100的比例转接到10mL L-broth液体培养基中，37℃，200rpm，培养14-16h；
3.将菌液转移至一11mL离心管中，4℃，12000rpm，离心1min。弃去上清，收集菌体；
4.在离心管中加入1.1mL裂解缓冲液(20mM Tris·HCl pH8.0，10mM EDTA，10mM NaCl，20％蔗糖)重新悬浮菌体，再加入50μL RNase(10mg/ml)，37℃水浴1h；
5.加入1.1mL的2％SDS，充分振荡至溶液澄清，再加11μL蛋白酶K(20mg/ml)，37℃水浴过夜，其间经常摇动一下离心管，使蛋白酶K能充分水解蛋白；
6.加入2.2mL等体积的Tris饱和苯酚/氯仿混合液，剧烈振荡，12000rpm，离心20min；
7.吸取上层上水相转移至另一新离心管中，重复用酚/氯仿抽提3次，操作步骤同6，至蛋白抽提干净为止；
8.吸取上清，加入2倍体积(约4ml)无水乙醇，用玻璃棒或枪头搅出沉淀，置于一个新的11mL离心管中，70％乙醇洗一次，尽量少带出液体，真空干燥；
9.在抽干后的DNA中加入1.5ml TES溶液(500mM Tris·HCl，pH8.0，5mM EDTA，50mM NaCl)重溶DNA，之后加入15μl RNase(10mg/ml)，37℃水浴1h；
10.加入1.5ml Tris饱和苯酚/氯仿抽提蛋白，12000rpm，离心15min，取上清；重复抽提一次，取上清；加入1.5ml氯仿再抽提一次，取上清；
11.加入2倍体积无水乙醇(约4ml)，-20℃放置0.5h，4℃，12000rpm，离心10min；
12.弃去上清，沉淀用1mL 70％乙醇洗涤2次，真空干燥后重溶于适量的TE中。0.8％的琼脂糖凝胶电泳大致检测DNA的质量及浓度。
第二步、质粒的小量提取，参照《Molecular Cloning》(Sambrook et al.，1989[78])的方法并加以改进。
1.挑取转化子单菌落接种于5mL LB液体培养基中，37℃，180rpm，过夜振荡培养；
2.取1-1.5mL菌液转移至一1.5mL离心管中，12000rpm，1min，离心收集菌体；
3.弃去上清，菌体尽量控干，置于冰上，加入100μL预冷的溶液I(参见《Molecular Cloning》)，重悬沉淀，冰浴5min；
4.加入200μL溶液II(1％SDS，0.2mol/L NaOH)，轻轻的混合均匀至溶液变的清亮且粘稠，冰浴5min，注意溶液II要现用现配；
5.加入150μL溶液III，轻轻的混匀，冰浴5min；
6.4℃，12000rpm，离心10min，吸取上清转移至另一新管中；
7.新管中加入8μL Rnase(10mg/mL)，放置37℃水浴中45min；
8.加入等体积(约400μL)的Tris饱和苯酚/氯仿/异戊醇混合液(25∶24∶1)抽提，4℃，12000rpm，离心10min，吸取上清转移至另一新管中；
9.新管中加入2倍体积(约1mL)预冷的无水乙醇，混合均匀，-20℃，放置20min；
10.4℃，12000rpm，离心10min，弃去上清；
11.用1mL 70％乙醇洗涤沉淀一次，真空干燥，沉淀溶于适量的(10-50μL)TE(pH＝8.0)或无菌水中。
12.0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测提取的质粒的量，以DL15000为DNA分子量标准。
第三步、载体pUC18质粒的酶切及去磷酸化处理
用限制性内切酶Kpn I酶切处理pUC18质粒，酶切的方法参见TaKaRa公司产品说明书。此酶切产物可以直接用电泳检测酶切结果，若酶切完全，则终止反应，采用加热处理(60℃15min)使限制性内切酶失活。
酶切反应体系的处理：
(1)用等体积的Tris饱和苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，4℃，12000rpm，离心10min，转移上清至另一新离心管中；
(2)加入1/10体积的3M NaAC(pH4.8)，2倍体积预冷的无水乙醇，混和均匀后，于-20℃中放置30min；
(3)4℃，12000rpm离心10min，DNA沉淀用70％乙醇洗涤两次，真空干燥。沉淀溶于适量的TE(10mM Tris.HCl，1mM EDTA，pH8.0)缓冲液或无菌水中。
为防止载体自身连接反应，降低转化时的背景，提高连接效率，用小肠碱性磷酸单酯酶(CIAP)除去线形化的pUC18分子5’末端磷酸。具体方法按照说明书进行。
第四步、连接、转化及筛选
1.连接反应体系(总体积为20μl)：
基因组DNA和质粒pUC18的连接(15μl体系)：
DNA 1μL
ddH2O 10μL
pUC18 1μL
混匀，45℃水浴5分钟后，迅速冰浴，再加T4连接酶1.5μL，10×buffer 1.5μL，14-16℃水浴过夜。
2.连接产物的处理：
(1)TE补足至200μL。
(2)加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3mol/L NaAc(pH4.8)，-20℃放置20min沉淀DNA。
(3)4℃12000rpm离心10min，弃上清。
(5)加入1mL70％的冷乙醇洗DNA沉淀两次，真空干燥。
(5)沉淀溶于5μL ddH2O中。14μl ddH2O，1μl酶切处理后的基因组DNA，1μl酶切处理后的载体pUC18片段，混和均匀，45℃水浴保温5min。
(6)取出后立即置于冰上，加入2μl 10×T4 DNALigase Buffer，2μl T4 DNALigase，混匀，16℃反应16-24h；
3.大肠杆菌感受态细胞的制备
(1)挑取新鲜划线培养的大肠杆菌单菌落接种于5mL LB液体培养基中，37℃，180rpm，过夜振荡培养；
(2)按1∶100的比例转接至200mL LB液体培养基中，37℃，180rpm，振荡培养至OD600＝0.5-0.6，约3-5h；
(3)将菌液转移至无菌的250mL离心管中，4℃，6000rpm，离心10min，收集菌体；
(4)弃去上清，加入等体积(200mL)的无菌去离子水(预冷)，重悬沉淀，4℃，6000rpm，离心10min；
(5)弃去上清，加入1/2体积(100mL)的无菌去离子水(预冷)，重复步骤(4)的操作；
(6)加入1/2体积(100mL)的无菌10％甘油(预冷)，重复步骤4)的操作；
(7)加入1/100体积的无菌10％甘油(预冷)，重悬沉淀，分装至1.5ml无菌离心管中，95μL/管，-70℃保存。
4.大肠杆菌DH5α的电转化方法：
(1)5μL DNA连接产物与95μL大肠杆菌感受态细胞混匀，冰浴5-10min。
(2)混合物转移至预冷的0.2cm电转化杯中(阴性对照不加混合物，只加感受态细胞)，在Bio-Rad电转化仪上设置2.50kv，进行电击。
(3)从电转化杯中吸出电转化体系，并用1mL 37℃预热的SOC液体培养基(20g/L胰蛋白胨，5g/L酵母粉，0.5g/L NaCl 20mM葡萄糖，10mM氯化镁)稀释后，37℃，150转/分钟培养1h。
(4)菌液全部涂布于含20mmol/L MgSO4 50μg/mL卡那霉素和100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃倒置过夜培养。
5.克隆子的筛选、鉴定：
(1)从过夜培养的双抗平板上挑取转化子，小量提取质粒，用限制性内切酶KpnI酶切
(2)以DL15000为DNA标准，在0.8％琼脂糖凝胶中电泳检测鉴定，挑选同时具有pUC18载体带和外源目的基因带的克隆子(图2)。
(3)同时以从转化子中提取的质粒为模板，用Mu转座子DNA片段的Mu转座子检测引物Mu-kam P1和Mu-kam P2进行PCR(具体方法同实施例1中所述)。电泳检测PCR产物，以DL2000为DNA标准，以质粒pHTH2为正对照，若能扩增出700bp的特异性带，则说明转化子质粒中含有人工Mu转座子DNA片段，克隆成功(图3)。
(4)对成功克隆的转化子质粒进行测序。
6.阳性转化子质粒的DNA测序：
以Mu转座子两端的反向序列为依据设计的AM42P1作为引物进行测序。委托上海英俊公司进行DNA测序。
7.基因定位：
测序结果在铜绿假单胞菌的基因组数据库(http//www.pseudomonas.com)或GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中BLAST进行序列比对找到Mu所插入基因在铜绿假单胞菌基因组中的位置。
其中一个转化子Mu转座所突变的基因是PA5022。
实施例4：相关基因启动子活性的测定
1.启动子-lacZ融合质粒的构建：
应用预测软件，寻找lasB、lasI、vqsR三个基因上游可能的启动子序列。使用软件由http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html网站提供，1999NNPP version 2.2(March1999)of thepromoter predictor。以PA68基因组DNA为模板，将待研究的三个基因各自上游的一段序列进行扩增，所有的序列均应包括预测的启动子区和调控基因编码区的头部，且反应产物内部不含EcoRI位点和BamHI位点。正向引物加EcoRI位点，反向引物加BamHI位点，便于将来与报告基因的正向融合。扩增并经过EcoRI和BamHI酶切的DNA片段与经过同样双酶切的pBluescript-SK连接构建完成中间质粒pSKPLI，pSKPB，pSKPV(具体操作同实施例3)。经过测序分析的中间质粒用EcoRI和BamHI酶切得到外源外段与同样双酶切的pDN19lacΩ连接构建完成启动子-lacZ融合质粒pDN19PLI，pDN19PB，pDN19PV(具体操作同实施例3)。
2.将构建好的融合质粒分别电转化入感受态细胞PA68及PA5022突变株中(具体操作同实施例1)。分别挑取PA68，PA5022突变株含有融合质粒的转化子的新鲜单菌落，接种于含50μg/ml四环素的液体LB中过夜培养。次日转接到20ml LB液体培养基中，调整初始菌液OD600为0.02，37℃200rpm通气震荡培养18h，参考Miller的方法测定β-半乳糖苷酶活性(Miller，1972)，比较每对PA68和PA5022突变株中融合质粒转化子的酶活差异。结果见表1。
β-半乳糖苷酶活性的测定方法如下：
(1)取新鲜菌液于冰水混合物中冰浴20min；
(2)取1ml菌液，以培养基为参比，测定600nm吸光度；
(3)取100μl菌液，加入900μl Z Buffer；
(4)加入氯仿10μl，0.1％SDS 15μl，震荡10s；
(5)28℃水浴5min；
(6)经过处理的菌液中加入0.2ml ONPG，28℃水浴中摇动使反应开始，精确计时到反应液呈现黄色；
(7)待转黄后，加入0.5ml 1mol/L Na2CO3使反应中止；
(8)12000rpm离心2min，取上清，以Z Buffer为参比，测定420nm的吸光度。
注)：Z Buffer的配制，每升含：
16.1g Na2HPO4·H2O，5.5g NaH2PO4·H2O，0.75g KCl，
0.246g MgSO4·7H2O，2.7ml巯基乙醇，调节pH至7.0ONPG的配制：
精确称量ONPG，用A Buffer溶解，配制成4mg/ml浓度ABuffer的配制：
0.1M Na2HPO4，0.1M NaH2PO4
表1野生型菌株与突变株中lasB、lasI、vqsR基因转录水平的测定
lasI、vqsR、lasB启动子-lacZ融合质粒在野生型菌株、PA5022突变株中测定的酶活结果，结果为三次单独测定酶活的平均值±标准差，单位为Miller Units
【序列表】
<110>南开大学
<120>铜绿假单胞菌水解弹性蛋白能力相关基因PA5022及其应用
<160>1
<210>1
<211>3357
<212>DNA
<213>铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)
<400>1
atgcctgccc ttcgctccct gatcgctatt cttttcctcg gcctctgcct tgccagtccg 60
ccgctcctcg cccagtccga gccgccctcg gccgaggccg tccagcaaag cctcgacaag 120
ctggccgagc gcaagctcgc cgaagccgac cagaaggtcg ccaaggccag cctcgaacag 180
accctcaagt tcctcgccgc gcgcgacgaa gcgctgcaga gcctggagga cctgaaaaag 240
cgcctgagcg acgcgccccg gcagatcgag gaaaaccagc gcgaactgga gcgcctgaag 300
aagaccaaag aacgtccggt cagcgaacgc tacagcggcg agagcgcggc ccgcctggaa 360
atgctgctca acgaccgcac cacccagcag gccgagtggc agaaagccct gggcgaggcc 420
aacagcctgt cgatcaccgc cgagacccgt ccggaacgag cccaggccgg catcagcagc 480
atgcaggcac ggatcctgga aatcggctcg ctgctcaagg ccggcaagga aagcggcaag 540
acgatcaacg ccgaccgtcg cggcgagctg ctcgccgagc aggccgcatt gaccgtgcag 600
agccagctgt tgcgccagga gctggccggc aacaacctgc tgcaggacct cggcaagagc 660
cagcacgatc tgctcaccga gaagatctcg cgcctggaaa aggaaaccct cgacctgcag 720
gcgctgatca gcgagaagcg ccgcgagcag tcggaaaaga ccgtcgccga gctgtccaag 780
gaaggcgccc agggggccgg caccgacagc ctgctgagcc aggagaacgc caagaacctg 840
cgtctctccg actacctgct gcgcgccacc gaccgcctca acgtgctcac ccggcgcaac 900
ctcgagacca agcagcaact ggacaacctg acccagtcca accaggccct cgaggaacag 960
atcaacgtcc tgcgcggcag cctgctgctg tcgcgcatcc tctacaagca gaaacaggcg 1020
ctgcccaaga tcaaggccga ccagagcctg gccgacgaga tcgccgacct gcgcctcggc 1080
cagttcgaac tgaaccagga acgcgacaag ctggcgaccc cgcagcaata cctggacgac 1140
ctgctcgccc agcagcccag cgagcaggtc acgccggaac tgcgcaagga tctcgacacc 1200
ctgttggcaa cccgttccga gttgctcgaa cggctcaacc acgaactcaa cgcgctgctc 1260
aacgaagcga tcaccttgca gttgaaccag aaacagttgc tttccaccag cgagagcctg 1320
cgcaccaccc tcgacgagca gatgttctgg attcccagca accagccgct cgacctgtcc 1380
tggttcaaga tgaccccgac cctgctgaag aaccagctca ccgagatccc ctggggctcc 1440
ggggtgcgtg aactgggcga aggcctggtc gatcggccgc tgctgttcct gccgctgttc 1500
ctgctgatcg ccgcgctgct gtggaaacgc cgctacctgt acgacaagct ggcggagctg 1560
aacgacgaca tcggccactt caagcgcgac agccagttgc ataccccgct ggcgatcctg 1620
atcaccatcc tcctcgccct gcccggcacc ctgaccttcg ccgtcgccgg gctggccctg 1680
ctgctggacg cccgcggcca gaacgccacc ctcggcagcg ccctgctgga aatggcccag 1740
gtctggctgc tgttctacac cgcccatcgc atcctcaccc cgggcggcat cgccgagcgg 1800
catttccact ggagccgcga acaggtcggc ttcctcgacc ggcacctggt ccgcctcggc 1860
gttgtggtcc tggcgctggt cggcgtggtg acggtggccg agcaccagcc ggcgagtctg 1920
gccgacgacg tgatcggcat cgccgtggtc ctgctcggct acgcggccat ggcctggctg 1980
ctcagccgcc tgctgttcag cagccccggc gacgaacgtc cgtcgctgat caagatgatc 2040
gtcggcatcc tcttcaccgc gctgccgctg gtgctcttcg tcgcggtctg cttcggctac 2100
tactacacct cgctgaagct caccgaccgt ctcatcgata ccctttacct gctgctgctc 2160
tggttcgtca tcgaagccgc cttcgtccgc ggcctgggcg tggcggcccg gcgcctggcc 2220
tacgcccggg ccctggcgaa acggcagaac gcggcgaagg aaggcgtcga cggcgagacc 2280
aacgtcgagg agccgaccct cggcatcgag cagatcaacc agcaatcgct gcggctgatc 2340
cgcctggctc tgctgatcgg cttcatcgtc tgcctgtact gggtctgggc cgacctgatc 2400
agcgtgatct cctacctcga caacgtcacc ctgtaccagt acaccgccgg caccggcgaa 2460
gcggccacca gcgtgccgat cagcctgcgc gacttcctcg cggcgctggc catcgcggtg 2520
gtcaccgtgg ccctggcgcg caacctgccc ggcctgctgg aagtcctggt actgcagcgc 2580
ctgaccctgg cccagggcag cgcctacgcc accaccaccc tgctttccta cgccatcagc 2640
ggcatcggca tcgtcagcgc cctgtccacc ctcggggtca gctgggacaa gctgcaatgg 2700
ctggtggcgg cgctctcggt aggcctcggt ttcggcctgc aggcgatctt ctccaacttc 2760
gtctccggcc tgatcatcct cttcgagcgt ccggtacgaa tcggcgacgt ggtgaccatc 2820
ggcaacctgt ccggcacggt cagccggatc cgcatccgcg ccaccaccat caccgatttc 2880
gaccgcaagg agatcatcgt cccgaaccag accttcatca ccgggcaact ggtgaactgg 2940
tcgctgagcg ataccgtgac ccgggtcacc atcaagatcg gcctggccta cgagaccgac 3000
ctgccgctgg cgcgcaagct gatgatgcag gcggtcaagg aaaacccgcg ggtactgcgc 3060
gacccggagc cgctgctgta cttcctgacc atcagcgcca gtaccttcga ctacgagctg 3120
cgcttccacg tccgcgaact gggcgaccgc aacccctcta ccgacgagat cctgacgaag 3180
atcgccacca gcttccgcga acacaagatc gacatggctt tcaaccaggt cgatgtgttc 3240
gtcaagaacc tccagggcca gcaggtccag ctgttcgtcg gcgagccgca gcacagcggc 3300
gtcggcaatc cgcccgcgct caagggccag gacggtcccg ccgaaccgac ccgctga 3357