一种活体组织电穿孔用的波形及波形发生器 本发明涉及的是活体组织电穿孔用方波形以及新的波形的发生器，属于医学治疗领域。
把基因、药物或者其他小分子转移入活体组织在基因治疗以及其他各种临床应用中具有重要的意义。
诞生于二十世纪70年代的电穿孔方法，通过高压脉冲在细胞膜上产生微小的孔洞(电穿孔因此得名)，孔洞主要位于电极附近的细胞表面，这些微孔的开启使细胞外界基质中的各种成分如DNA、蛋白质、药物可以穿过微孔进入细胞的内部。这个效应是短暂的，如果电场脉冲的参数准确，被电击地细胞可以恢复(孔洞自动封闭)细胞会继续生长并表达其遗传物质。在80年代，电穿孔技术的体外应用十分普遍，因为发现这是一个把药物、遗传物质(如DNA)或其他分子导入细胞的非常有效方法。为此，研究人员在80年代末开始对活体组织使用电穿孔将分子转导入细胞内。
电穿孔法在体外转移DNA进入各种类型的细胞方面已被广泛使用。体内电穿孔法基因转移DNA入小鼠皮肤、鸡胚、大鼠肝脏以及鼠黑色素瘤中已初显成效，在DNA肌内注射中电穿孔法能显著改善基因转染效率。AiharaH等检测了体内IL-5基因通过电穿孔法转移入肌肉的有效性，质粒注射入肌肉后电穿孔(一对电极间隔5mm插入DNA注射部位肌肉，以每秒一次的速率给3次电脉冲，每个脉冲50V，时间50ms，然后电极反向给相同的3次脉冲)能增加血清IL-5水平，与仅仅肌肉内质粒注射相比增加了10倍。
电穿孔对细胞的作用有两方面：既要用高于某个较低阈限的高压脉冲在细胞膜上“打孔”，同时该高压脉冲又要低于某个较高阈以使对细胞的损伤减小到能自我修复。同时还要考虑到细胞之间对电场敏感和耐受的差异性。由于目前对电穿孔的原理还不清楚，因此对细胞或组织某一特殊应用的方案，通常通过经验性地调整诸如脉冲幅度、宽度、数量、脉冲间距离等脉冲参数来获得理想结果。
电穿孔采用的波形主要有两种：指数衰减脉冲和方波脉冲，还没有直接的证据表明哪一种波形更占优势。指数衰减脉冲是由电容放电脉冲发生器产生，较为简单，但可供操作者对脉冲控制的参数甚少。只能视电容量自然放电而很难做到因不同对象而不同，而方波脉冲发生器能使操作者对脉冲参数可视不同要求而有更多的选择。因此有利于操作者根据经验调整参数。通常体外细胞实验选择指数衰减脉冲发生器，而为了临床应用如基因治疗、药物输送等目的，需要精确控制脉冲，因此通常选择方波脉冲发生器。
然而，方波有两个关键的变量：电场的强度和脉冲宽度，通过改变这两个参数，可以使细胞的损伤减少到最小，同时提高电穿孔的效率。
目前所使用的方法：(1)对活体组织的电穿孔只给多次相同宽度和幅度的脉冲(Suzuki et al.FEBS Letters 1988；425：436-440)。如图1所示，脉冲100有6级，101、103、105为三个相同电压、相同时间的正脉冲，102、104、106没有脉冲。(2)给3-4次相同幅度和宽度的脉冲后，手动改变电场方向，再给3-4次同上的脉冲(Mir et al.Proc Natl Acad Sci USA 1999；96：4262-4267；Aihara et al.Nature Biotechnology 1998；16：867-870)。如图2所示，脉冲200有12级，201、203、205是三个相同电压幅度、相同时间的正脉冲，207、209、211是三个同正脉冲电压幅度相同、时间相同而方向相反的负脉冲，202、204、206、208、210、212没有脉冲。后一种正、负脉冲能提高裸DNA转导入细胞的效率。
虽然这些已知的电穿孔方法对某些应用是适宜的，但在更多情况下这样的电场会在细胞壁上产生永久的孔洞而损伤细胞，甚至会彻底损伤细胞。对活体组织，尤其是在人体上应用电穿孔方法进行基因治疗或其他临床目的，在维持DNA等物质有效转导入细胞的同时，尽可能减少对细胞、组织的损伤十分重要。所以，显然采用现有的二种方波对于活体组织的电穿孔不是十分理想的，为提高电穿孔进行基因治疗、药物输送效率，必须构思出新的方波形和相应的发生器。
本发明的目之一在于提供一类新的方波形，活体组织电穿孔用的新的方波形，更有利于DNA等物质进入细胞并减少对细胞的损伤。
本发明的另一目的是提供一种发生器，它能有效地产生新的方波形，满足发明的第一个目的。
本发明提供的一类新的方波形之一为双极电压波形，其特点是在一个脉冲后紧接一个反向脉冲，经过一个时间间隔，再一个脉冲接一个反向脉冲，这种波形更有助于DNA等物质进入细胞并减少对细胞的损伤，如图3所示，在一个脉冲301后紧接一个反向的脉冲302，经过一个时间间隔303，再一个脉冲304接一个反向脉冲305，再一个时间间隔306，以次类推。在本发明中，脉冲至少有9级(301-309)，301、304、307为正脉冲，302、305、308为负脉冲，303、306、309没有脉冲(即脉冲之间的时间间隔)；至少有3个或3个以上的正脉冲和负脉冲。
考虑到高压脉冲在细胞膜上产生的微孔数量和大小与第一个脉冲场强最有关，而以后的脉冲主要起维持微孔以及促使细胞外DNA等进入细胞的作用，因此后面脉冲的场强，即脉冲电压幅度，脉冲宽度均应逐渐递减，这样，既有利于DNA导入细胞的效率而又能尽可能减少对细胞的损伤。为此，本发明提供的一类新的方形波不仅仅只是图3所示的一种而可以是递减双极电压波形，或者是脉冲幅度递减波形；或者是脉冲宽度递减波形；或者是双脉冲宽度和脉冲幅度同时递减的波形。这种脉冲宽度和幅度的递减幅度可以根据研究人员的经验，依基因治疗、药物输送效率而加以调整，图4是典型的双极电压幅度递减波形，其基本波形如前所述，是指一个脉冲401后紧接一个反向的脉冲402，经过一个时间间隔403，再一个脉冲404接一个反向脉冲405，再一个时间间隔406，以次类推。在本发明中，脉冲至少有9级(401-409)。其中401、404、407为正脉冲，402、405、408为负脉冲，电压幅度绝对值依次递减(401＝402＞404＝405＞407＝408)，403、406、409没有脉冲(即脉冲之间的时间间隔)；至少有3个或3个以上的正脉冲和负脉冲。电压幅度依次递减的电压值可以根据研究人员的经验调整。
本发明提供的新方波可以包含3个或更多正/负脉冲的脉冲幅度、脉冲宽度以及脉冲之间的时间间隔是相同的一串脉冲；或者3个或更多正/负脉冲中至少有2个正/负脉冲的脉冲幅度不相同和/或脉冲宽度不相同和/或时间间隔不相同的一串脉冲。
本发明提供的双极电压或递减双极电压与先前使用的恒电压波形不同，它可以在细胞孔洞产生后使用低电压电场减少细胞在高电压场的暴露，可使对细胞的损伤减到最小。
遗憾的是目前市场上虽有各种类型的电穿孔仪器，但大部分是用于体外各种类型细胞的电穿孔。由于电极间场强与细胞直径成反比，越小的细胞需要更大的电压，因此，这些仪器的输出电压都较高，至少高于100伏特以上。而仅有的一些可以用于体内电穿孔的仪器，例如当前使用最广的是Genetronics公司BTX分公司生产的ElectroSquarePorator T820。这些方波脉冲发生器有一些可调的参数(电压、脉冲宽度、总脉冲数以及脉冲频率)。然而，这些参数一旦设置好，一串脉冲中每个脉冲都相同。例如选择：电压为1000伏特/厘米，脉冲宽度为20ms，脉冲数为10，脉冲频率为1Hz，那么一串10个脉冲将固定在1000伏/厘米，20ms。所以目前市场上尚无仪器能产生如上面所述的特殊类型的方波。
本发明提供了能实现这些双极电压波形和递减双极电压波形的方波发生器，该发生器专为活体组织电穿孔设计，能根据操作者的预先设定改变电场方向产生双极电压，能预先设定一串脉冲中每个脉冲的宽度和幅度，最大输出电压±254伏。解决了目前仪器存在的问题：只能产生相同宽度和幅度的脉冲，且不能自动转换电场极性，操作时必须在给予几个脉冲后，再改变方向给予另几个脉冲，不方便，且影响DNA的转导。
本发明方波发生器是以单片机为核心和相应硬件电路以专门应用程序所组成的数字化智能仪器，能使使用者按需要和经验预先设定一串方波脉冲中各个脉冲的宽度和幅度，并能根据使用者的预先设定转换电场方向，以产生双极电压。
如图5所示，操作键盘502和液晶显示器501两个部件构成人一一机对话界面。操作键盘502由4×4矩阵开关电路构成，有10根信号线与单片机503 PB端口相连。可以手动复位。液晶显示器501采用I2C串行总线显示模块与单片机503相连。表征特殊波形的参数设定值，由操作键盘502的数字键输入，用液晶显示器501显示，按压操作键盘502相应的功能键，实现不同功能的操作，如ENTER键把波形数据存储到单片机503的随机数据存储器中，可供随时查阅和修改。波形数据存储器504是由I2C总线的E2pROM构成的，它可以存储4组波形数据，断电不会丢失数据。从中可以随意调出一组波形发出。单片机503的PC端口外接R-2R电阻网络完成数/模转换功能505，输出0-5V的单极性电压，经电压跟随器506和高电压脉冲输出电路508，接输出电极509可以进行电穿孔。506包括电压跟随器和放大器，放大器完成双极性转换功能，接波形显示器507，可以模拟显示所设定的波形。
电源部分510-512：本仪器采用220V交流电源512，经稳压电源510模块，输出+5V给单片机503及外围电路供电，输出±12V给双级性输出模块506供电；高压隔离电源发生器511输出280V高压，供高压电脉冲输出电路508，从而达到高压脉冲输出。
本发明提供的方波发生器的主要参数如下：
1、一组波形最多可设计成15级(附图3所示301-309为9级)；
2、每一级由脉冲宽度和脉冲幅度两个参数表征；
(1)脉冲宽度L＝0.1～999.9毫秒
(2)脉冲幅度P＝±2伏～254伏(幅度增量为2伏)
3、波形组数：1～9999组
4、可以产生双极性脉冲，也可以产生单极性脉冲。为满足特殊需要可以产生不同波形，输出电极间产生的电压为0～±254V。
本发明的方波发生器的特点是：(1)首先按治疗的需要，设计好特定的波形，表征波形的参数值。由操作键盘输入，用液晶显示器显示，存储到单片机中，可随时查阅修改。波形数据存储器，可存储4组波形数据，断电不会丢失数据，可随意调出一组波形发出。(2)方便地按操作键盘上启动键O，将所设计或调出的波形数据，经过D/A变换极性转换电路，由高压电脉冲输出电路输出，同时送到波形显示器上，可直接观看到波形的形状，可修改参数直到满意为止。
(3)为保证安全，电源部分采取特殊设计，双重隔离和输出功率限定措施。
该发生器基本操作过程详见实施例1
下面结合附图和实施例对本发明的实质性特点和显著的进步作进一步详细说明，但决不仅限于此。
图1是目前电穿孔使用的方波波形之一。
图2是目前电穿孔使用的方波波形之二。
图3是本发明提供的用于活体组织电穿孔的方波波形之一。
图4是本发明提供的用于活体组织电穿孔的方波波形之二。
图5是本发明提供的产生新的方波的发生器的主要组成部分框图。
图6是图5中操作键盘502示意图。
图7是图5中液晶显示器501在操作过程中的显示。
图中，501-液晶显示器，502-操作键盘，503-单片机，504-波形数据存储器，505-数/模转换电路，506-电路实现双极性输出功能，507-波形显示器，508-高压电脉冲输电路，509-输出电极，510-稳压电源，511-高压隔离电源发生器，512-220V交流电源，601-ENTER(确认)，602-DOWN(向下)，603-UP(向上)，604-CLEAR(清除)，605-RESET(复位)其余数字及符号即为操作键盘上的数字及符号。
701、702、703、704、705、706均是液晶显示器501在操作过程中的显示。701为开机显示，∞ L--×××702表示该组波形的级数，∞P--××××703表示一串波形的组数。704、705、706中P为脉冲幅度，L为脉冲宽度，数字01、02…表示一组波形是级数的序号。
实施例1使用双极电压波形使活性组织电穿孔
将一对电板插入大鼠胫骨前肌内，在DNA注射部位相距5mm间隙，用本发明提供的方波发生器给予电脉冲。
其波形如图3所示，在一个脉冲301后紧接一个反向的脉冲302，经过一个时间间隔303，再一个脉冲304接一个反向脉冲305，再一个时间间隔306，以次类推。在本发明中，脉冲至少有9级301-309，301、304、307为正脉冲，302、305、308为负脉冲，303、306、309没有脉冲(即脉冲之间的时间间隔)；至少有3个或3个以上的正脉冲和负脉冲。本发明的特点是实现双极电压，本发明可以包括：3个或更多正/负脉冲的脉冲幅度、脉冲宽度以及脉冲之间的时间间隔是相同的一串脉冲；或者3个或更多正/负脉冲中至少有2个正/负脉冲的脉冲幅度不相同和/或脉冲宽度不相同和/或时间间隔不相同的一串脉冲。
方波发生器可方便地产生所需的波形，具体操作过程如下(参见附图5、6、7)。
1、接通电源，液晶显示器501显示主菜单701。
2、按操作键盘上的“9”键，进行波形设计，液晶显示器显示菜单702。
(1)702表示波形的级数，可用键盘数字键进行修改××××，数字限定的有效范围围为0001～0015。按ENTER键601表示确认，液晶显示器显示下一个菜单703。
(2)703表示波形组数，可用操作键盘上数字键修改××××，数字限定的有限范围1～9999。按ENTER键601表示确认，液晶显示器显示下一个菜单704。
(3)704表示第一级脉冲的宽度，可用操作键盘上数字键修改××××，数字限定的有效范围1～9999。按ENTER键601表示确认，液晶显示器显示下一个菜单705。
(4)705表示第一级脉冲的幅度，可用操作键盘上数字键修改××××，数字限定的有限范围1000～1254，表示+0～+254伏特；0000～0254，表示-0～－254伏特。按ENTER键601表示确认，液晶显示器显示下一个菜单706。
(5)706表示第二级脉冲的宽度，重复步骤(3)、(4)的操作方法，可以设定第二级到第十五级的数值。
3、按操作键盘上DOWN键602或UP键603，可以向下或向上查阅所设定的参数值。
4、按操作键盘上CLEAR键604，可以清除液晶显示器末四位显示值变成0000，然后可按数字键进行重新设定，最后按ENTER键601确认。
5、按操作键盘上#键，结束当前操作。返回主菜单。在任何操作过程中，只要按RESET键605，仪器立刻复位到初始上电状态，显示主菜单。
6、在主菜单情况下，分别按操作键盘上1、2、3或4键，可将当前设计好的波形数据，按1、2、3或4编号存储到波形数据存储器指定位置。
7、在主菜单情况下，分别按操作键盘上5、6、7或8键，可将所存储的编号为1、2、3或4的波形数据分别调出。
实施例2使用双极电压幅度递减波形使活性组织电穿孔
将一对电板插入大鼠胫骨前肌内，在DNA注射部位相距5mm间隙，用本发明提供的方波发生器给予电脉冲。
其波形如图4所示，在一个脉冲401后紧接一个反向的脉冲402，经过一个时间间隔403，再一个脉冲404接一个反向脉冲405，再一个时间间隔406，以次类推。在本发明中，脉冲至少有9级401-409，其中401、404、407为正脉冲，402、405、408为负脉冲，电压幅度绝对值依次递减(401＝402＞404＝405＞407＝408)，403、406、409没有脉冲(即脉冲之间的时间间隔)；至少有3个或3个以上的正脉冲和负脉冲。电压幅度依次递减的电压值可以根据研究人员的经验调整，方便地输入方波发生器，在键盘数字健上进行修改，从而可有效地输出所需的电压幅度递减波形，其操作过程同实施例1。
实施例3使用双极脉冲宽度递减波形使活性组织电穿孔
根据图4所示，401、404、407为正脉冲，402、405、408为负脉冲，脉冲宽度依次递减(401＝402＞404＝405＞407＝408)，403、406、409没有脉冲(即脉冲之间的时间间隔)；至少有3个或3个以上的正脉冲和负脉冲。脉冲宽度依次递减的值可以根据研究人员的经验调整，并可方便地输入方波发生器键盘数字健进行修改，其余同实施例1。
实施例4使用双极脉冲宽度和电压幅度递减波形对活性组织电穿孔
根据图4所示，401、404、407为正脉冲，402、405、408为负脉冲，脉冲宽度和电压幅度依次递减(401＝402＞404＝405＞407＝408)，403、406、409没有脉冲(即脉冲之间的时间间隔)；至少有3个或3个以上的正脉冲和负脉冲。脉冲宽度和电压幅度依次递减的值可以根据研究人员的经验调整，其余同实施例1。