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阳离子表面活性剂的抗病毒用途
本发明申请涉及阳离子表面活性剂的新用途。
阳离子表面活性剂在现有技术中公知具有多种不同的用途。
由月桂酸和精氨酸衍生得到的阳离子表面活性剂，特别是精氨酸单盐酸盐的月桂酰胺的乙基酯，后文命名为LAE，可用于对抗微生物生长的保护。LAE的化学结构示于下式(1)：

该产物的制备已经描述于西班牙专利申请ES-A-512643。
已经研究了上式(1)的阳离子表面活性剂在大鼠中的代谢，这些研究显示出快速吸收和代谢成天然存在的氨基酸和脂肪酸月桂酸，这些最终作为二氧化碳和尿素被排泌。毒理学研究表明，LAE对动物和人类完全无害。
因此，LAE和相关化合物特别适合被用于保存所有易于腐烂的食物产品。LAE和相关化合物同样适用于化妆品中。
该化合物对不同微生物的增殖有显著抑制作用，例如细菌、真菌和酵母菌。LAE的最小抑制浓度示于下表1。
表1
 

种类微生物M.I.C.(ppm)  革兰氏阳性菌        氧化节杆菌(Arthrobacter oxydans)ATCC 8010                 腊状芽孢杆菌蕈状变种(Bacillus cereus var mycoide)ATCC 11778枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 6633                    产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)ATCC 77454                                                                    单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)ATCC 7644    金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 6538            藤黄微球菌(Micrococcus luteus)ATCC 9631                   德氏乳酸杆菌乳酸亚种(Lactobacillus delbruec kii ssp lactis)CECT  372                                                      肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)CETC 912          64 32 16 16    10 32 12816    32           革兰     氏   阴        性        菌                  粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)ATCC 8750                支气管博德特菌(Bordetella bronchiseptica)ATCC 4617    弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)ATCC 22636      产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)CECT 689          大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 8739                  大肠杆菌0157H7                                                                                          肺炎克雷伯菌肺炎变种(Klebsiella pneumoniae var pneumoniae)CECT 178                                            奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)CECT 170              绿脓杆菌(Pseudomon asaeruginosa)ATCC 9027           鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)ATCC16028        粘质沙雷氏菌(Serratia marcenses)CECT 274            草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)ATCC 41423            64 12864 32 32 20    32    32 64 32 32 2  种类微生物M.I.C.(ppm)    真菌  黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC14604        短梗霉(Aureobasidium pullulans)ATCC9348    绿粘帚霉(Gliocadium virens)ATCC 4645     球毛壳菌(Chaetonium globosum)ATCC 6205   产黄青霉(Penicillium chrysogenum)CECT 2802绳状青霉(Penicillium funiculosum)CECT 2914 32 16 32 16 12816 酵母菌白色念珠菌(Candida albicans)ATCC 10231     深红酵母(Rhodotorula rubra)CECT 1158       酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ATCC 9763161632
本发明的用途涉及下式(2)的阳离子表面活性剂，所述表面活性剂由脂肪酸和酯化的氨基二羧酸缩合得到：

其中：X^-是Br^-、Cl^-、HSO₄^-、从有机或无机酸得到的相反离子、或者以酚类化合物为基础的阴离子；
R₁：是线性烷基链，来自通过酰胺键(amidic bond)与α-氨基酸基团键合的8至14个碳原子饱和脂肪或羟基酸；
R₂是1至18个碳原子的直链或支链的烷基链或者是芳香基；
R₃：是
—NH₃

或

和n可以是从0到4。
可以是相反离子X^-的来源的有机酸是柠檬酸、乳酸、乙酸、富马酸、马来酸、葡萄糖酸、丙酸、山梨酸、苯甲酸、碳酸、谷氨酸或其他氨基酸、月桂酸和脂肪酸例如油酸和亚油酸，而无机酸是磷酸、硝酸和硫氰酸。
可以是阴离子X^-的基础的酚类化合物是例如丁基化羟基茴香醚(BHA)和相关的丁基化羟基甲苯，叔丁基氢醌和对羟基苯甲酸酯例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯。
以上化合物类别中最优选的化合物是LAE。
优选在化合物使用前将其直接溶解在以下优选的食品级溶剂之一：水、乙醇、丙二醇、异丙醇、其他二醇、二醇的混合物以及二醇和水的混合物。如果治疗应该在特定pH值下进行，则可推荐使用相应的缓冲溶液。在另一方面，该化合物容易作为固体使用。应由固体制剂保护的表面是，例如，食品或化妆品的表面。
对上式(2)的阳离子表面活性剂而言，对其他微生物例如真菌和酵母菌的抗菌活性和生物活性已被明确记录。阳离子防腐剂的抗病毒活性尚无记载。
治疗病毒感染的安全和有效的产品是急切并持久需要的。病毒感染的全球爆发显示出了有效治疗的复杂性。近期，禽流感的爆发导致迫切寻求最优的工具来限制疾病的传播。
禽类流行性感冒(Avian influenza)，目前也称为禽流感(avianflu)，是一种流感A病毒导致的鸟类疾病，基本上是凝血素亚型H5或H7，其属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)。在相同的病毒组内，发现了导致被称为流行性感冒或流感的呼吸疾病的病毒。
副流感病毒，属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)的副粘病毒科亚科，包括影响人和动物的病毒。病毒粒子直径为150nm，多形性，具有从宿主细胞的细胞膜衍生出的脂质被膜，并具有长度为10-14nm的凸出。它的基因组含有7-8个片段的线性、负义、单链RNA，导致基因组大小为10,000至14,600个核苷酸。
此外，副粘病毒科和正粘病毒科就被膜糖蛋白的生物性质而言享有特殊的关系。如下表2所见，副粘病毒科和正粘病毒科在他们的糖蛋白、脂质和碳水化合物含量上没有显示出重大差异。
表2
副粘病毒科和正粘病毒科族成员的蛋白质、脂质和碳水化合物含量。
 含量(％)副粘病毒科正粘病毒科蛋白质70—7470-77脂质20—2518—17碳水化合物65—8
最初选定术语副流感是因为某些疾病症状和流感高度类似，并且这两种病毒类型均显示出血凝作用和神经氨酸酶活性。
流感病毒和副流感病毒对外部影响，例如热，显示出相同的敏感性。
在现有技术中相信，副流感病毒是很好的实验模型，用来确定试验化合物的生物活性。
本发明人所作的研究得到意想不到的结果，即上式(2)的阳离子表面活性剂显示出令人惊奇的、显著的强抗病毒活性。迄今为止，这类化合物已知其抗微生物作用，但没有预料到抗病毒作用。
能够观察到针对牛痘、单纯性疱疹和牛副流感病毒类型的抗病毒活性。对疱疹和牛副流感病毒类型的作用特别强，在这些类型中，很短的5分钟接触时间就足以实现最大的效应。这可以被认为是本发明特别出人意料的方面，即这样短的时间之后就达到抗病毒的效应。
在病毒类型之间具有相似性，所述病毒类型显示出对阳离子表面活性剂的抗病毒活性最为敏感，例如牛痘、单纯性疱疹和牛副流感病毒类型和病毒诸如AIDS的导致因素——腺病毒。本发明人所研究过的阳离子表面活性剂被发现也对人类免疫缺陷病毒I有效。
本发明涉及式(2)的阳离子表面活性剂在处理任何种类受病毒污染影响的产品中的用途。这些产品可以是例如温热的盘子或者温热的液体。待处理的产品可以是任何种类的用于处理病毒感染动物的设备。在更广的含义上，待处理的产品可以是容纳动物的设施，或者自然环境的一部分，例如地表或者水库。
本发明还涉及将式(2)的阳离子表面活性剂直接施用于动物或人类，用于预防性或治疗性处理病毒疾病。
式(2)的阳离子表面活性剂可以作为溶液使用。这是一种处理地面、车辆和人的表面的合适方式。对于其他的用途，更合适的是将阳离子表面活性剂作为固体应用，该固体可以同样有效。
处理产品以避免任何种类的病毒感染，包括式(2)阳离子表面活性剂的存在浓度，更具体的是根据优选的LAE的实施方案，是待保护产品的约2至20,000ppm，优选浓度为100至10,000ppm，和更优选200至2,000ppm。这个浓度与已经描述过的实现微生物作用的浓度相类似。将以上述范围浓度的阳离子表面活性剂处理的产品是例如食品或化妆品。
处理被病毒感染的表面，例如食物制品品的表面、化妆品的表面、地表、任何种类车辆的表面、和用于处理感染了病毒的动物的任何设备的表面，所需要存在的式(2)的阳离子表面活性剂，更具体是根据优选的LAE实施方案，处于足以在所述表面实现所需抗病毒作用的浓度水平。这样的浓度水平将预期是在2至20,000ppm的范围内，更优选为100至10,000ppm，和更加优选200至2,000ppm，含有要求权利的阳离子表面活性剂，根据优选的实施方案含有LAE。这些浓度根据含有阳离子表面活性剂的溶液浓度来给出，所述溶液应用于被处理的表面。如果以式(2)的阳离子表面活性剂的固体制剂来处理表面，使用量应当使得式(2)的阳离子表面活性剂的量应在0.01至100mg/dm²的范围内，优选的量是0.5至50mg/dm²，和更优选的量是1至10mg/dm²。
处理液体制剂例如是饮用流体或天然水源例如湖泊或池塘，所需要存在的式(2)的阳离子表面活性剂，更具体是根据优选的LAE实施方案，其浓度水平足以在饮用流体或水中实现所需的抗病毒作用。这样的浓度水平将预期是在0.2至20,000ppm范围内，更优选2至15,000ppm，更加优选100至10,000ppm，和最优选200至2,000ppm，含有式(2)的阳离子表面活性剂，根据优选的实施方案含有LAE。这些浓度根据在代处理的液体或水中的阳离子表面活性剂的浓度来提供。
治疗动物或人意味着以适合于吸收根据本发明使用的化合物的方法来施用阳离子表面活性剂。化合物可以口服、胃肠外(包括腹膜内、皮下和肌肉注射)或外用(局部、例如直肠、经皮、通过滴注和经鼻)给药。所施用的制剂可以具有常规药物制剂的形式，例如，胶囊、微胶囊、片剂、肠衣药剂、颗粒剂、粉末剂、丸剂、软膏、栓剂、混悬剂、糖浆、乳剂、液体、喷剂、吸入剂、滴眼剂和滴鼻剂。
上述药物制剂可以根据常规方法来生产，使用常规用于制剂的药物配方的各种有机或无机载体，例如赋形剂(例如蔗糖、淀粉、甘露醇(mannit)、山梨醇、乳糖、葡萄糖、纤维素、滑石粉、磷酸钙、碳酸钙)、粘合剂(例如纤维素、甲基纤维素、羟甲基纤维素、聚丙基吡咯烷酮、明胶、阿拉伯胶、聚乙二醇，蔗糖、淀粉)、崩解剂(例如淀粉、羧甲基纤维素、羟丙基淀粉、碳酸氢钠、磷酸钙、柠檬酸钙)、润滑剂(例如硬脂酸镁、aerosyl、滑石粉、十二烷基硫酸钠)、矫味剂(例如柠檬酸、薄荷醇、甘氨酸、橘子粉)、防腐剂(苯甲酸钠、亚硫酸氢钠、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、稳定剂(例如柠檬酸、柠檬酸钠、乙酸)、悬浮剂(甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸铝)、分散剂(例如羟丙甲基纤维素)、稀释剂(例如水)、基础蜡(例如可可脂、白矿脂、聚乙二醇)和其他合适者。
根据本发明的用途，阳离子表面活性剂的剂量应该以实现所需的预防或治疗效果需要的剂量来确定。对口服或胃肠外施用而言，常用剂量应该是0.1mg/kg至10mg/kg。人类常用剂量可以是每个个体的单位剂量为0.1至1000mg，更优选每个个体0.5至500mg。该剂量可以根据症状的严重度，每天施用1至4次。在动物中的常用剂量可以是每剂0.1至100mg，优选每剂0.5至50mg。
本发明的应用效果通过下面的实施例来阐明。
在下面的试验中，计算了减少因数(reduction factor)。
减少因数根据下式来计算
10 R ′ = v ′ · 10 a ′ V ′ ′ · 10 a ′ ′ ]]>
在该方程中：
R’代表减少因数，
v’代表试验化合物样品的体积，
a’是在所加样品中的病毒浓度(¹⁰log值)，
v”是最终样品的体积，
a”是处理后的病毒浓度(¹⁰log值)。
在以下的实验中，计算了清除因数。
清除因数根据下式来计算：
10 CL = 10 q ′ 10 q ′ ′ ]]>
在该式中：
CL是消除因数(清除因数)，
q’是病毒的起始浓度(¹⁰log值)，
q”是病毒的最终浓度(¹⁰log值)。
实施例1.
研究LAE对病毒牛副流感3病毒的活性。
细胞培养的培养基
从Earle(ICN flow，Rf.11-100-24)获得Eagle最低必需培养基(EMEM)，补充有10％的胎牛血清(Biowhittaker，参考号D14-810F)，
2nM谷氨酰胺(Biowhittaker，参考号17-605E)，
非必需氨基酸(Biowhittaker，参考号13-114E)，
100单位青霉素，
100μg链霉素/ml和
1mM的丙酮酸钠。
批号10234的LAE(CAS 60372-77-2)具有的LAE含量为88.7％。
所研究的3型牛副流感株是SF-4(ATCC VR-281)。
实验条件
LAE的研究浓度为200ppm。
所有实验在室温下进行。
8ml去离子水与1ml病毒混悬液混合。加入1ml的LAE溶液(含有2000ppm的LAE)，产生LAE终浓度为200ppm。
5和60分钟后，取出测定用样品。实验的设计允许在接触时间为5至60分钟后得出LAE有效性的结论。
结果示于下表3。
表3
 病毒浓度加入LAE之前8.09±0.33加入LAE60之后分钟≤1.63减少因数≥6.46±0.32清除因数≥6.29±0.32
在LAE处理60分钟之后，没有检测到残留的病毒生物体。类似的结果在5分钟后也达到了。
在试验中病毒颗粒的数目通过定量分析TCID50来确定(培养组织的感染剂量)。
实施例2
LAE对1型疱疹病毒的活性。
所研究的病毒是疱疹病毒科中α疱疹病毒亚科的单纯型病毒。
测定条件的选择类似于实施例1的条件。
LAE的研究浓度为200ppm。
结果示于下表4。
表4
 病毒浓度加入LAE之前7.94±0.37加入之后LAE 60分钟≤1.70减少因数 ≥6.18±0.36清除因数≥6.24±0.37
以LAE处理60分钟之后，没有检测到残留的病毒生物体。类似的结果在5分钟后也达到了。
实施例3
LAE对牛痘病毒的活性。
所研究的病毒是痘病毒科的正痘病毒类型。
痘病毒科覆盖了具有复杂结构的复杂病毒，具有含病毒DNA的核(170—250kbp的双链)。
LAE的研究浓度为200ppm。
结果示于下表5。
表5
 病毒浓度加入LAE之前5.94±0.34加入LAE60之后分钟2.40减少因数3.92±0.36清除因数3.54±0.34
用LAE处理60分钟之后，检测到活的牛痘病毒生物体数目显著降低。处理5分钟后，也观测到活的牛痘病毒生物体数目的很大降低。