骨碎补/猪骨粉/壳聚糖复合支架材料制备方法 所属技术领域
本发明涉及一种制备带药组织工程支架材料的方法，而且该材料为全天然的组织工程支架材料，适用于骨组织损伤的修复及作为骨组织工程细胞支架。
背景技术
作为骨修复材料的同种骨有来源局限性、采骨量有限、必须开辟第2术区给病人带来一定的痛苦的缺点。异体骨有传播疾病的危险且临床供应有限。人工合成材料有较好的骨传导性与一定的机械强度，但它的骨传导性较好，诱导性较差。组织工程化骨由于一些技术问题，很大部分工作目前仍停留在试验阶段，不易开展，临床应用仍需慎重。自从1668年荷兰人Job van Meekeren报道了第一例异种骨移植术，他将狗的颅骨移植到伤员的颅骨缺损处，当后来伤员要求取出移植物时，颅骨缺损已部分修复。自此异种骨开始被人们所重视并得到广泛的研究。异种骨修复材料具有来源广泛，易操作，移植时显示出良好的骨传导性和生物相容性，不用开辟多余手术，病人损伤小等优点，但是异种骨同时又存在免疫排斥、疾病交叉传染等问题，使异种骨的应用受到限制。经过衍生化(脱钙、深低温冷冻、煮沸、γ射线辐照、化学脱蛋白)的异种骨可以消除抗原性，也能较好地保持原有的骨传导甚至骨诱导性，是较好扩大的骨源，但衍生骨加工成型困难，有时强度会受到影响。
基于合成的羟基磷灰石生产原料价格高及需要高温、高压生产条件，目前造价很高，而天然羟基磷灰石是利用猪骨头提取的，生产成本低，原材料来源丰富，价格低廉，生产工艺简单，不需特殊的设备，绿色环保，无“三废“排放。由于牛和猪的骨骼结构与人的较为相似，是理想的骨替代材料。但牛骨有疯牛病等交叉感染的危险，所以选用猪骨型羟基磷灰石作为支架材料的研究对象。
壳聚糖[(1，4)-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖]是由甲壳素经化学改性得到的有广泛应用价值的天然生物多糖高分子材料。由于壳聚糖具有众多优点无毒性、生物可降解、生物活性、生物相容性和抗菌性等，另外，有研究表明壳聚糖能促进凝血，促进生长因子TGF-β1的释放，从而加快伤口愈合的作用，因此广泛应用于生物医学中。壳聚糖作为生物医用材料吸水性强，形成的纤维或膜材料的湿态机械强度差，提高其机械性能，对其在生物医药领域的应用有重要意义。研究壳聚糖复合材料目的就是保持壳聚糖所特有的优异性能，而且能得到壳聚糖单纯使用时所没有的综合性能。
中药骨碎补为水龙骨科多年生蕨类植物槲蕨Dr.ynaria fortunei(Kunze)J.Sm的干燥根茎。始载于唐《本草拾遗》，味苦，温，归肝经、肾经，具有补肾，活血，止血，续伤之功效，主治肾虚腰痛、脚弱、耳鸣耳聋、牙痛、久泻、跌仆闪挫或金疮、损伤筋骨，为历代常用药物。骨碎补具有补肝肾强筋骨的传统功效，而且经过实验证明了骨碎补的提取液的确能促进成骨细胞的增殖。
因此，本发明将骨碎补/猪骨粉(猪骨型羟基磷灰石)/壳聚糖通过真空冷冻干燥法复合制备理想的骨组织工程支架材料。
【发明内容】
本发明提供一种能提高组织工程支架材料力学性能、降解过程pH值稳定、生产成本低且骨修复性能更好的骨碎补/猪骨粉(猪骨型羟基磷灰石)/壳聚糖复合组织工程支架材料的制备方法。
本发明的目的是鉴于复合材料中各个组分虽然保持其相对独立性，但其性质却不是各个组分性能的简单加和，而是在保持各个组分材料的某些特点的基础上，具有组分间协同作用产生的综合性能。可弥补单一材料的缺点，可产生单一材料所不具备的新特性。所以为了克服异种骨的的缺点并得到生物活性更优异的支架材料，现制备出中药骨碎补/猪骨粉(猪骨型羟基磷灰石)/壳聚糖复合支架材料。该支架材料孔隙率和抗压强度相匹配，在降解过程pH值稳定，生物活性优异，生产成本低且骨修复性能更好。因此，该复合支架材料在具有以上特点后，可作为骨组织缺损修复材料和骨组织工程细胞支架材料，以满足新一代生物材料发展的需要。
本发明解决技术问题所采用的方案是：以壳聚糖为模板，复合猪骨型羟基磷灰石和中药骨碎补制备支架材料，采用真空冷冻干燥法作为成型技术。
本发明具有如下特征：
(1)该支架材料是由中药骨碎补、猪骨粉(猪骨型羟基磷灰石)和壳聚糖三种材料复合而成：
(2)该支架材料中的中药骨碎补是由骨碎补粉和提取骨碎补有效成分即骨碎补液的形式加入的；
(3)骨碎补粉地制备：粉碎方法为首先把骨碎补粉碎为小颗粒，然后用行星球磨机球磨3小时，之后用玛瑙研钵研磨，过200目筛子之后装袋备用；
(4)水提取骨碎补液的制备：将生品骨碎补于80℃干燥，加水浸泡1h，直火煎煮，保持微沸50min(注意保持提取液的体积)，用脱脂棉过滤，再加水复提2次，过滤，合并药液，在水浴上蒸发以得到5ml的浓溶液；喷雾雾制粉；
(5)猪骨型羟基磷灰石的制备步骤如下：
①前处理：异种骨除去抗原性成分前，需要先加工成一定形状和大小的骨块。用小刀刮去猪骨软组织和骨膜，锯去两端骨松质，用塑料密封，入-15℃冰箱中保持一天以上。冰冻状态下锯成20×10mm2(长边为骨轴向)的骨块，表面用蒸馏水冲洗干净，置冰箱中备用，之后将猪骨砸碎。
②脱脂：采用500ml球形Soxhlet提取器，异种(猪)骨放入提取器的萃取腔中，将适量甲醇和氯仿按体积比为1∶1加入提取器，另加约占甲醇/氯仿总体积10％的水，加足量沸石或玻璃珠等颗粒，加热形成甲醇/氯仿脱脂溶剂的回流，冷凝下来的不含脂肪的新鲜脱脂溶剂不断流过骨块，骨块中的脂肪等可溶于脱脂溶剂的成分逐步溶入溶剂中并沉积于提取器底部容器。脱脂溶剂中添加10％的水以溶出一些非脂成分，底部烧瓶保持65～70℃以维持溶剂回流。猪股骨密质骨块经前处理、脱脂一定时间后取出，于空气中吹干脱脂溶剂，再入放有硅胶的真空干燥器中真空放置24小时以上以除去残余的溶剂。
③脱钙：将脱脂后除去残余溶剂的猪骨用0.3mol/L的HCl脱钙5分钟，再用蒸馏水冲洗干净后干燥。
④煅烧处理：取出脱脂脱钙后的异种骨将其置于热处理炉里，按条件进行煅烧，获得850℃煅烧2小时的骨条。将煅烧后的异种骨粉碎，选用研钵进行手工研磨并通过200目筛子，再用行星球磨机进行球磨3个小时，以得到煅烧的异种骨粉。
(6)该支架材料中的壳聚糖是以壳聚糖溶液的形式加入的，由于壳聚糖不溶于水，一般采用1％～2％的醋酸溶液使其溶解。
(7)为提高支架材料的力学性能分别对猪骨型羟基磷灰石和壳聚糖进行改性，其具体内容如下：
①采用硅烷偶联剂(KH-570)对猪骨型羟基磷灰石进行改性，硅烷偶联剂(KH-570)的用量为猪骨型羟基磷灰石的1wt％。
②用螯合型焦磷酸钛酸酯偶联剂(NDZ-311)对壳聚糖进行改性，螯合型焦磷酸钛酸酯偶联剂(NDZ-311)的用量为壳聚糖的1wt％。
(8)制备该支架材料采用真空冷冻干燥法成型，其制备方法如下：
首先用螯合型焦磷酸钛酸酯偶联剂(NDZ-311)对壳聚糖进行改性，磁力搅拌两小时后，将猪骨型羟基磷灰石和骨碎补(粉体或溶剂)倒入壳聚糖溶液中，再磁力搅拌四小时后，用玻璃棒搅拌均匀，使其达到均匀分散，得到粘稠溶液。将溶液倒入模具里，然后放到冰箱中-85℃预冷24小时左右，再取出后立即放入真空冷冻干燥箱中，在真空状态下低温干燥48个小时。然后取出即得到复合多孔支架材料；
(9)支架材料的孔隙率在45％～91％之间、孔径在40μm～500μm范围内可调，而且孔连通性较好；
(10)该支架材料的抗压强度可达0.1MPa～5.6MPa；
(11)该支架在降解过程中pH值稳定，中药骨碎补(粉)/猪骨粉(猪骨型羟基磷灰石)/壳聚糖复合支架材料周围体液的pH值在6.77～7.50之间，中药骨碎补(溶剂)/猪骨粉(猪骨型羟基磷灰石)/壳聚糖复合支架材料周围体液的pH值在6.82～7.42之间；
(12)本材料中加入了骨碎补，在植入前期具有很好促进骨细胞形成能力和骨结合程度高特点；
(13)结合猪骨型羟基磷灰石和壳聚糖的各自的优点-即同时拥有羟基磷灰石良好生物相容性，引导骨形成、骨融合的特性和和壳聚糖的体内降解吸收，高强度、抗菌抗癌和良好的骨整合等特殊的医用生物学特性。同时互补各自的一些自身无法克服的缺点一即羟基磷灰石不易聚居碎裂特性，多孔材料机械强度差，不可吸收和壳聚糖不能单独用于骨缺损修复等缺点；
(14)并且鉴于骨碎补总黄酮可以促进骨生成的特性，该复合材料具有良好的组织相容性，良好的机械学特性，可以渐进性吸收，长期植入体内由于壳聚糖的吸收，允许骨组织长入壳聚糖吸收后留下的位点并和羟基磷灰石交错交联骨整合在一起。
本发明由中药骨碎补、猪骨粉(猪骨型羟基磷灰石)和壳聚糖三种材料复合而成，获得一种能提高组织工程支架材料力学性能、降解过程pH值稳定、生产成本低且骨修复性能更好的骨组织缺损修复材料和骨组织工程用细胞支架材料。
本发明中所用的壳聚糖是以粉末的形式加入的。
本发明中所用的猪骨粉即天然羟基磷灰石是从猪骨头中提取的。
本发明中骨碎补粉的加入量为猪骨型羟基磷灰石和壳聚糖总质量的1/10，骨碎补剂的加入量为每1克壳聚糖加入骨碎补浓溶剂5ml。
本发明中壳聚糖的加入量为天然羟基磷灰石和壳聚糖总质量的10wt％～50wt％之间。
本发明是分别采用硅烷偶联剂(KH-570)和螯合型焦磷酸钛酸酯偶联剂(NDZ-311)对猪骨型羟基磷灰石和壳聚糖进行改性，以提高支架材料的力学性能。
本发明的中药骨碎补/猪骨粉(猪骨型羟基磷灰石)/壳聚糖复合支架材料可用于骨组织缺损修复材料和骨组织工程用细胞支架材料。
【附图说明】
下面结合附图和分析测试方法对本发明进一步说明，可以更好的理解本发明所述的支架结构和性能。
图1是中药骨碎补/猪骨型羟基磷灰石/壳聚糖复合支架材料(改变壳聚糖含量)×200断面SEM的组织和形貌观察的图片。
其中(a)壳聚糖(50wt％)，(b)壳聚糖(40wt％)，(c)壳聚糖(30wt％)，(d)壳聚糖(20wt％)，(e)壳聚糖(10wt％)。
图2是中药骨碎补/猪骨型羟基磷灰石/壳聚糖复合支架材料(改变壳聚糖含量)×2000断面SEM的组织和形貌观察的图片。
其中(a)壳聚糖(50wt％)，(b)壳聚糖(40wt％)，(c)壳聚糖(30wt％)，(d)壳聚糖(20wt％)，(e)壳聚糖(10wt％)。
图3是中药骨碎补/猪骨型羟基磷灰石/壳聚糖复合支架材料(改变壳聚糖含量)孔隙率的变化曲线。
其中横坐标为壳聚糖的含量/％，纵坐标为平均孔隙率/％。
图4是中药骨碎补/猪骨型羟基磷灰石/壳聚糖复合支架材料(改变壳聚糖含量)抗压强度的变化曲线。
其中横坐标为壳聚糖的含量/％，纵坐标为抗压强度/MPa。
图5是中药骨碎补/猪骨型羟基磷灰石/壳聚糖复合支架材料在模拟体液中降解时的pH值变化曲线。
其中横坐标为小时h，纵坐标为pH值。以及图线说明：C、D、G、F、E分别为猪骨型羟基磷灰石∶CS为5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1比例的中药骨碎补(粉)/猪骨粉(猪骨型羟基磷灰石)/壳聚糖复合支架材料的pH值变化曲线，B为猪骨型羟基磷灰石∶CS为8∶2的中药骨碎补(溶剂)/猪骨粉(猪骨型羟基磷灰石)/壳聚糖复合支架材料的pH值变化曲线。
具体分析
如图1-图2所示：随着壳聚糖含量的增加，支架材料的孔的大小和数量是逐渐增加的，也就是引导细胞逐步粘连的“桥”增加了。在断面200倍下观察到，试样孔结构以CS为模板呈板条搭错层叠状。而且随着壳聚糖含量由10wt％增加到50wt％，孔径也由40μm变化到500μm左右。在断面2000倍下可以更清晰地观察到，猪骨型HA颗粒均匀地分散在CS模板上，CS孔壁光滑，猪骨型HA颗粒尺寸在1μm以内。
如图3所示：随着壳聚糖含量的增加，骨碎补/猪骨型HA/壳聚糖复合支架的孔隙率是逐渐变大的。但是只有当壳聚糖的含量达到20wt％以上，才能达到支架材料对孔隙率的要求。
如图4所示：随着壳聚糖含量的增加，骨碎补/猪骨型HA/壳聚糖复合支架的抗压强度是逐渐降低的。而且只有当壳聚糖的含量达到20wt％以上，才能达到支架材料对抗压强度的要求。
如图5所示：该支架材料在降解过程中pH值稳定，中药骨碎补(粉)/猪骨粉(猪骨型羟基磷灰石)/壳聚糖复合支架材料周围体液的pH值在6.77～7.50之间(壳聚糖的含量为20wt％)，中药骨碎补(溶剂)/猪骨粉(猪骨型羟基磷灰石)/壳聚糖复合支架材料周围体液的pH值在6.82～7.42之间(壳聚糖的含量为20wt％)。
【具体实施方式】
由以下详尽的实施例来描述本发明的优异特点和效果，但并不是对本发明做任何限制。
实施例1：中药骨碎补(粉)/猪骨粉(猪骨型羟基磷灰石)/壳聚糖复合支架材料的制备(改变壳聚糖的含量)
首先把猪骨经过前处理、脱脂、脱钙、煅烧、球磨制得猪骨粉(猪骨型羟基磷灰石)，而且把骨碎补粉碎为小颗粒，然后用行星球磨机球磨3小时，之后用玛瑙研钵研磨，过200目筛子之后装袋备用，之后是壳聚糖的溶解，壳聚糖采用2％的醋酸溶液使其溶解。然后用螯合型焦磷酸钛酸酯偶联剂(NDZ-311)对壳聚糖进行改性，螯合型焦磷酸钛酸酯偶联剂(NDZ-311)的用量为壳聚糖的1wt％，磁力搅拌两小时后，将猪骨型羟基磷灰石和骨碎补(用量为猪骨型羟基磷灰石和CS总量的1/10)的混粉(按猪骨型羟基磷灰石∶CS为5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的比例)分别倒入壳聚糖溶液中，再磁力搅拌四小时后，用玻璃棒搅拌均匀，使其达到均匀分散，得到粘稠溶液。将溶液倒入模具里，然后放到冰箱中-85℃预冷24小时左右，再取出后立即放入低温冷冻箱中，在真空状态下低温干燥48个小时，然后取出即得到复合多孔支架材料。通过改变壳聚糖的含量得到的支架材料的孔隙率在45％～91％之间、孔径在40μm～500μm范围内可调，而且孔连通性较好。
实施例2：中药骨碎补(粉)/猪骨粉(猪骨型羟基磷灰石)/壳聚糖复合支架材料的制备
首先用螯合型焦磷酸钛酸酯偶联剂(NDZ-311)对壳聚糖进行改性，螯合型焦磷酸钛酸酯偶联剂(NDZ-311)的用量为壳聚糖的1wt％，磁力搅拌两小时后，将猪骨型羟基磷灰石和骨碎补(用量为猪骨型羟基磷灰石和CS总量的1/10)的混粉按猪骨型羟基磷灰石∶CS为8∶2的比例倒入壳聚糖溶液中，再磁力搅拌四小时后，用玻璃棒搅拌均匀，使其达到均匀分散，得到粘稠溶液。将溶液倒入模具里，然后放到冰箱中-85℃预冷24小时左右，再取出后立即放入低温冷冻箱中，在真空状态下低温干燥48个小时。然后取出即得到复合多孔支架材料。此时所制得的支架材料的孔隙率为80.8％，抗压强度为1.5MPa，其孔隙率和抗压强度相匹配。通过模拟体液试验证实该支架材料在降解过程中pH值稳定，中药骨碎补(粉)/猪骨粉(猪骨型羟基磷灰石)/壳聚糖复合支架材料周围体液的pH值在6.77～7.50之间。
实施例3：中药骨碎补(溶剂)/猪骨粉(猪骨型羟基磷灰石)/壳聚糖复合支架材料的制备
首先把猪骨经过前处理、脱脂、脱钙、煅烧、球磨制得猪骨粉(猪骨型羟基磷灰石)，而且把骨碎补粉碎为小颗粒，然后用行星球磨机球磨3小时，之后用玛瑙研钵研磨，过200目筛子之后装袋备用，之后是壳聚糖的溶解。然后用螯合型焦磷酸钛酸酯偶联剂(NDZ-311)对壳聚糖进行改性，螯合型焦磷酸钛酸酯偶联剂(NDZ-311)的用量为壳聚糖的1wt％，磁力搅拌两小时后，将猪骨型羟基磷灰石按猪骨型羟基磷灰石∶CS为8∶2的比例倒入壳聚糖溶液中，再加入骨碎补剂的浓溶液，再磁力搅拌得到粘稠溶液。将溶液倒入模具里，然后放到冰箱中-85℃预冷24小时左右，再取出后立即放入低温冷冻箱中，在真空状态下低温干燥48个小时。然后取出即得到复合多孔材料。此时所制得的支架材料的孔隙率为78.1％，抗压强度为1.1MPa，其孔隙率和抗压强度相匹配，通过模拟体液试验证实该支架材料能提高骨修复的速度，材料在降解过程中pH值稳定，中药骨碎补(溶剂)/猪骨粉(猪骨型羟基磷灰石)/壳聚糖复合支架材料周围体液的pH值在6.82～7.42之间。