miRNA-320在制备促进肿瘤细胞凋亡制剂中的应用 【技术领域】
本发明涉及生物医学材料技术领域，是一种小RNA分子miRNA-320在制备促进肿瘤细胞凋亡制剂中的应用。
背景技术
小RNA(miRNA)是一种长度大约为18～25个核苷酸的RNA小分子，自参与调控线虫时序发育的miRNA分子lin-4与let-7被发现以来，至2004年初已有700多个线虫、果蝇、人、拟南芥等真核生物miRNA被报道。目前根据国际权威miRNA数据库统计，人体中已经发现695个miRNA分子(Sanger Institute，Release 12.0)。miRNA的特点主要表现为它的保守性、基因簇集现象和特异性表达。
miRNA通过与靶mRNA的3’-UTR碱基不完全互补配对的方式来执行对靶mRNA的翻译抑制功能。有报道指出，Lin-4和let-7在线虫发育中起着时序调控的作用。这两个基因或它们的靶基因发生突变会造成线虫发育的形态突变。近来，在筛选果蝇生长缺陷突变株的过程中发现了bantam基因座，该基因座编码了果蝇幼虫抑制程序性死亡和促进细胞增殖的miRNA。Bantam miRNA的大量表达会抑制Hid mRNA的翻译。Hid是程序性死亡的主要启动因子。另外有人报导，小鼠miRNA-375的表达会抑制葡萄糖诱导的胰岛素分泌，但是并不改变葡萄糖代谢或细胞内Ca2+信号强度。通过RNA干扰技术将miRNA-375的靶分子Mtpn沉默，发现产生的效应与miRNA-375的作用效果一致。
同时，小RNA与癌症之间的关系也是目前的研究热点之一。有人通过使用Northern blot和芯片技术对基因组进行大规模的筛查发现：miRNA表达与多种癌症相关，并且这些miRNA可能起到抑制肿瘤或促进肿瘤的作用。有研究发现肺癌病人的let-7表达显著降低，导致这些病人更差的预后，非小细胞肺癌病人的let-7表达水平越低，其预后越差，术后生存期越短。体外组织培养实验表明，在人的肺癌细胞中瞬时的表达let-7可以抑制细胞的增殖，这也说明let-7在肺组织中可能是一种具有抑癌作用的miRNA[Takamizawa J，Konishi H，Yanagisawa K，Tomida S，Osada H，Endoh H，Harano T，Yatabe Y，Nagino M，Nimura Y，Mitsudomi T，Takahashi T.Cancer Res.2004 64(11)：3753-3756]。另外，有报道miRNA-21在胶质母细胞瘤中表达增加。这个基因在肿瘤组织中表达量比正常组织高5-100倍。反义核酸的研究发现这个miRNA通过抑制凋亡而并非影响细胞增殖控制细胞生长，这预示着这个miRNA具有促癌功能[Chan，J.A.，Krichevsky，A.M.，and Kosik，K.S.MicroRNA-21 is an antiapoptotic factor inhuman glioblastoma cells.Cancer Res.200565：6029-6033]。由于miRNA-21不是一个大脑特异性的miRNA，它在乳腺癌样品中表达也有增加，因此这个miRNA可能在肿瘤发生中起到广泛的作用。
但至今未见关于miRNA-320应用于制备促进肿瘤细胞凋亡制剂的任何报道。
【发明内容】
本发明的目的在于提供mir-320促进细胞凋亡的新用途。
本发明为实现上述发明目的，验证miRNA-320是否具有促进细胞凋亡的功能。首先采用荧光实时定量PCR技术检测了26例胆管癌样本和9例正常胆管上皮细胞样本中miRNA-320的表达丰度情况。结果发现所有26例胆管细胞癌样本中miRNA-320的表达丰度值明显低于9例正常胆管上皮细胞样本。
在此工作的基础上，本发明通过将miRNA-320转入胆管癌细胞系(QBC-939和RBE)中，探讨了过量表达miRNA-320对胆管癌细胞系(QBC-939和RBE)生物学特性的影响。研究结果发现，miRNA-320在胆管癌细胞系QBC-939和RBE中的高表达能显著促进上述胆管癌细胞系发生凋亡。
为了探讨过量表达miRNA-320促进胆管癌细胞凋亡可能的分子机制，本发明结合国际上通用的3种miRNA靶基因预测分析软件(Pictar，miRanda，Targetscan)对miRNA-320潜在的靶基因进行预测，从预测得到的潜在靶基因中筛选出了可能与miRNA-320促进细胞凋亡功能相关的候选靶基因——髓细胞白血病基因-1(Mcl-1)。之后本发明设计了相应的实验来验证Mcl-1是否是miRNA-320的靶基因。用表达miRNA-320的腺病毒感染QBC-939、RBE和HEK293细胞系，发现miRNA-320高表达会导致上述细胞中Mcl-1蛋白水平显著下降，说明miRNA-320通过下调Mcl-1在上述细胞中的蛋白水平促进细胞的凋亡，为今后设计抑制Mcl-1表达的药物提供了一个新的靶点。
【附图说明】
图1.实时定量PCR检测miRNA-320在胆管癌样本和正常胆管上皮细胞中的表达丰度图。
图2.高表达miRNA-320显著促进RBE细胞凋亡图。
【具体实施方式】
1.制备总RNA：
将正常肝上皮细胞和胆管上皮细胞样本，每100mg样本加入1ml RNA抽提液TriZol，根据Invitrogen公司提供的标准操作流程抽提总的RNA，并测定相应的总RNA的浓度。
2.miRNA-320表达丰度的测定：
使用Applied Biosyste公司的小RNA检测试剂盒(TaqMan MicroRNAAssay Human Panel-Early Access Kit，P/N：4365409)，根据试剂盒操作手册的标准操作流程，使用荧光实时定量PCR技术分别检测26例胆管细胞癌样本和9例正常胆管上皮细胞样本中miRNA-320的表达丰度值(Ct)，用miRNA-320地表达丰度值(Ct)减去18sRNA(一种作为内参照的RNA)的表达丰度值得到标准化的表达丰度值(ΔCt)，之后使用Excel电子表格软件绘制如图1所示的miRNA-320在胆管癌样本和正常胆管上皮细胞中的表达丰度图。
3.小RNA靶序列的预测：
结合目前国际上通用的3种生物信息学分析预测软件(miRanda、PicTar、TargetScan)对miRNA-320的潜在靶基因进行预测，综合三种软件预测得到的多种潜在靶基因，以3种软件均预测得到的共同的潜在靶基因作为候选基因，结合上述候选基因已经报导的功能从中进一步筛选出与细胞凋亡密切相关的基因作为下一步验证实验的目标。本发明中筛选得到Mcl-1作为下一步验证实验的候选基因。
4.miRNA-320表达载体构建
使用下述引物，上游：5’-ggactagttggccgacaaaacccgggaccctgatcttg-3’，下游：5’-cgcaagcttacaacctcacctgcaacgcgaccagccgcc-3’；以基因组DNA为模板进行PCR反应，扩增得到长度大约为331bp的片段，将片断回收后用限制性内切酶SpeI和HindIII双酶切片断，分别以顺向(forward)和反向(reverse)两种方式将酶切片断连接到pCDNA3.0(Invitrogen公司)载体中构建出能表达具有生物学活性的miRNA-320真核表达质粒miRNA-320(forward)和不具有生物学活性的miRNA-320真核表达质粒miRNA-320(reverse)。另外将酶切片断连接到pEZ-AV载体中构建出能表达具有生物学活性的miRNA-320腺病毒包装质粒(Ad-miRNA-320)。
5.细胞凋亡实验
用表达miRNA-320的腺病毒(Ad-miRNA-320)感染人胆管癌细胞系RBE，6小时后，加入浓度为25ng/ml的5-FU处理24小时后，使用Promega公司的TUNEL细胞凋亡检测试剂盒，根据试剂盒标准操作流程，制备样品，于荧光显微镜下观察。发现高表达miRNA-320能显著促进细胞的凋亡(见图2)
6.Mcl-1蛋白水平的检测
使用Invitrogen公司的转染试剂PEI，根据试剂使用说明书的流程，分别将表达miRNA-320的质粒miRNA-320(forward)和miRNA-320(reverse)瞬时转染入QBC939、RBE、HEK293细胞中，48小时后收集样品。变性样品进行SDS-PAGE蛋白电泳，通过电转仪将蛋白转移至硝酸纤维素膜(Schleicherand Schcell公司)，5％脱脂奶粉封闭1h，TBST洗三次，每次5min；5％BSA稀释抗Mcl-1的一抗，孵育2h，TBST洗三次，每次5min；5％脱脂奶粉稀释二抗，孵育1h，TBST洗三次，每次5-10min；化学发光法(ECL)显影检测Mcl-1的蛋白水平。发现高表达具有生物学活性的miRNA-320真核表达质粒miRNA-320(forward)能显著下调细胞中Mcl-1的蛋白水平，而高表达不具有生物学活性的miRNA-320真核表达质粒miRNA-320(reverse)不能下调细胞中Mcl-1的蛋白水平，进一步证明miRNA-320能够特异的下调Mcl-1的蛋白水平(见图3)。