黄酮类化合物或含其的植物提取物的应用.pdf

本发明公开了一类如式I所示的黄酮类化合物或含其的植物提取物在制备抗丙型肝炎病毒药物中的应用；其中，R1、R2、R4、R5和R6独立地为H、OH或OMe，R3为H、OH、OMe或β-D-葡萄糖酸基，2位和3位碳之间为单键或双键。本发明所述的黄酮类化合物具有较好的抗丙型肝炎病毒的作用，其副作用小，大多来源于中药，廉价安全有效。式I

1.  一类如式I所示的黄酮类化合物或含其的植物提取物在制备抗丙型肝炎病毒药物中的应用；

式I
其中，R₁、R₂、R₄、R₅和R₆独立地为H、OH或OMe，R₃为H、OH、OMe或β-D-葡萄糖酸基，2位和3位碳之间为单键或双键。

2.  如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的黄酮类化合物I为以下两种化合物中的任一种：
(1)

式A
其中，R₂、R₅和R₆独立地为H或OH，R₃为OH或β-D-葡萄糖酸基，R₄为氢；
(2)

式H
其中，R₁、R₂、R₃、R₄和R₅独立地为H、OH或OMe，其为外消旋化合物或手性化合物。

3.  如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的如式A所示的黄酮类化合物为下述三种化合物中的任一种：
(1)如式B所示的芹菜素，即式A化合物，其中R₃和R₅为OH，R₂和R₆为H；

式B
(2)如式C所示的木犀草素，即式A化合物，其中R₃、R₅和R₆为OH，R₂为H；

式C
(3)如式D所示的黄芩苷，即式A化合物，其中R₅和R₆为H；R₃为β-D-葡萄糖酸基，R₂为OH；

式D。

4.  如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的如式H所示的黄酮类化合物为下述化合物E：

式E
其中，R₁、R₂、R₃、R₄和R₅独立地为H、OH或OMe。

5.  如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的如式E所示的黄酮类化合物为下述两种化合物中的任一种：
(1)如式F所示的柚皮素，即式E化合物，其中R₁、R₃和R₅为OH，R₂和R₄为H；

式F
(2)如式G所示的6-甲氧基柚皮素，即式E化合物，其中R₁、R₃和R₅为OH，R₂为OMe，R₄为H；

式G。

6.  如权利要求1～5任一项所述的应用，其特征在于：所述的抗丙型肝炎病毒药物为治疗病毒性丙型肝炎的药物。

7.  如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的植物提取物为夏枯草或半枝莲提取物。

黄酮类化合物或含其的植物提取物的应用
技术领域
本发明涉及一类黄酮类化合物或含其的植物提取物在医药领域中的新应用。
背景技术
据不完全统计，目前我国丙肝抗体阳性患者有4000万人之多，其中80％会患上慢性丙肝。丙肝是经血液、性接触、母婴及日常生活接触等途径传播的一种肝脏疾病。感染HCV后，和HBV感染一样，易发生慢性肝炎、肝硬化和肝癌。
目前，主要使用长效干扰素联合利巴韦林治疗肝功正常的丙肝患者，总体持续病毒学应答率为52％。但干扰素和利巴韦林在治疗过程中，有可能出现骨髓抑制以及情感抑郁、消化道症状等不良反应。并且，长效干扰素价格昂贵，一个疗程48周需花费人民币6万元左右。因此开发抗HCV疗效好、价格低，副作用较小的天然药物是目前医药行业的一个热点。
黄酮类化合物泛指两个具有酚羟基的苯环(A-与B-环)通过中央三碳原子相互连接而成的一系列化合物(通式如下所示)。黄酮类化合物的主要结构类型有黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮类、二氢黄酮醇类、二氢异黄酮、查尔酮、花色素类等14种。(具体请见姚新生主编的《天然药物化学》，第四版，人民卫生出版社)

发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一类黄酮类化合物或含其的植物提取物在制备抗丙型肝炎病毒药物中的新应用。
本发明人经研究，发现具有如式I所示的母核结构的一类黄酮类化合物具有较佳的抗丙型肝炎病毒活性。

式I
其中，R₁、R₂、R₄、R₅和R₆独立地为H、OH或OMe，R₃为H、OH、OMe或β-D-葡萄糖酸基，2位和3位碳之间为单键或双键。
较佳的，所述的黄酮类化合物为以下两种化合物中的任一种：
(1)

式A
其中，R₂、R₅和R₆独立地为H或OH，R₃为OH或β-D-葡萄糖酸基，R₄为氢；
(2)

式H
其中，R₁、R₂、R₃、R₄和R₅独立地为H、OH或OMe，其为外消旋化合物或手性化合物。
本发明中，所述的如式A所示的黄酮类化合物优选下述三种化合物中的任一种：
(1)如式B所示的芹菜素，即式A化合物，其中R₃和R₅为OH，R₂和R₆为H，其分子式为C₁₅H₁₀O₅；分子量270.25，化学名为5，7，4’-三羟基黄酮，英文名称为Apigenin，CAS编号为520-36-5。

式B
(2)如式C所示的木犀草素，即式A化合物，其中R₃、R₅和R₆为OH，R₂为H，其分子式为C₁₅H₁₀O₆；分子量286.09，化学名为5，7，3′，4′-四羟基黄酮，英文名称为Luteolin，CAS编号为491-70-3。

式C
(3)如式D所示的黄芩苷，即式A化合物，其中R₅和R₆为H；R₃为β-D-葡萄糖酸基，R₂为OH，其分子式为C₂₁H₁₈O₁₁；分子量446.35，化学名为化学名为β-D-葡萄糖酸-5，6-二羟基-4-O-2-苯基-4H-苯并吡喃-7，英文名称为Baicalin，CAS编号为21967-41-9。

式D
本发明中，所述的如式H所示的黄酮类化合物优选下述化合物E：

式E
其中，R₁、R₂、R₃、R₄和R₅独立地为H、OH或OMe。
所述的如式E所示的黄酮类化合物优选下述两种化合物中的任一种：
(1)如式F所示的柚皮素，即式E化合物，其中R₁、R₃和R₅为OH，R₂和R₄为H，其分子式为C₁₅H₁₂O₅；分子量272，化学名为(2S)-5，7，4’-三羟基二氢黄酮，英文名称为(2S)-Naringenin。

式F
(2)如式G所示的6-甲氧基柚皮素，即式E化合物，其中R₁、R₃和R₅为OH，R₂为OMe，R₄为H，其分子式为C₁₆H₁₄O₆；分子量302，化学名为(2S)-5，7，4’-三羟基-6-甲氧基二氢黄酮，英文名称为(2S)-6-methoxynaringenin。

式G
本发明中，所述的黄酮类化合物可由天然植物中提取，较佳的为夏枯草或半枝莲。本发明所述的黄酮类化合物不仅包括市售单体纯品，也包括从天然植物中提取的粗品或纯品，还包括以这些黄酮类化合物为有效成份的植物提取物。
本发明的积极进步效果在于：本发明所述的黄酮类化合物具有较好的抗丙型肝炎病毒的作用，其副作用小，其来源于中药，廉价安全有效。
具体实施方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。
实施例中所用的芹菜素、木犀草素、黄芩苷柚皮素和6-甲氧基柚皮素购自上海中药标准化中心。HCV-E2抗体取自美国Scripps研究所。对照药物α干扰素以及其它所用试剂和原料均国内市售可得。
效果实施例体外细胞试验
1、样品制备
用100％DMSO将样品溶解成浓度为20mg/ml的母液，4℃保存。检测时，再用100％DMSO将贮存母液分别稀释为5mg/ml和2mg/ml的溶液。
2、细胞、病毒及细胞培养
本研究采用Huh7衍生细胞系和HCV病毒株(取自中国科学院上海巴斯德研究所)，该病毒株能在该细胞中产生高滴度、有感染能力的HCV病毒颗粒。
将细胞以1×10⁴个/100μl/孔接种于96孔细胞培养板中，培养过夜。用完全培养基(DMEM中含10％胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)将HCV病毒上清稀释到1×10³ffu/ml，按50ffu/孔感染细胞。
3、HCV病毒集落减少实验。
将不同浓度(5mg/ml和2mg/ml)的样品溶液分别以体积比1∶50的比例稀释于完全培养基中，使之浓度相应为100μg/ml和40μg/ml，分别吸取适量样品溶液与等体积病毒稀释液混和均匀，制备成浓度为50μg/ml和20μg/ml的样品。室温孵育1小时。弃去96孔细胞培养板中的培养基，每孔加入100μl上述混和液，置37℃、5％CO₂培养箱中培养8小时。弃去上清，用无钙镁离子的磷酸盐缓冲液(DPBS)洗1次，每孔加入150μl新鲜的完全培养基，置37℃、5％CO₂培养箱中培养64小时。每孔加入150μl 4％多聚甲醛(PFA)，室温固定15分钟。弃去上清，用DPBS洗涤3次，用抗HCV-E2人源单克隆抗体和免疫荧光素标记的抗人二抗(取自中国科学院上海巴斯德研究所)进行免疫荧光染色。荧光显微镜观察记录病毒集落数量。
4、阴性对照组设定。
阴性对照组以DMSO代替样品溶液，其余同样品检测。
5、α干扰素对照组设定。
用完全培养基将干扰素溶液分别稀释至5，50，500IU/ml。与细胞孵育1小时，加入病毒稀释液，其余同提取物检测。
抑制率＝(阴性对照组病毒集落数量-实验组的病毒集落数量)/阴性对照组病毒集落数量×100％
实验结果

其中，柚皮素即为本发明的式F化合物，6-甲氧基柚皮素即为本发明的式G化合物。
细胞毒性说明：
无细胞毒性＝实验组细胞密度/阴性对照组细胞密度≥80％
有细胞毒性＝实验组细胞密度/阴性对照组细胞密度＜80％
实验结果显示芹菜素、木犀草素、黄芩苷、柚皮素和6-甲氧基柚皮素等黄酮类化合物对丙型肝炎病毒有显著的抑制作用。
综上所述，各项实验结果表明芹菜素、木犀草素、黄芩苷、柚皮素和6-甲氧基柚皮素等黄酮类化合物具有抗丙型肝炎病毒活性。