乙型肝炎病毒（HBV）是与若干种人类肝脏疾病有关的传染因子。许多被HBV感染的人都经历一个急性的阶段，然后恢复。然而，有许多人不能根绝感染，从此成为慢性乙型肝炎病毒的携带者。HBV感染在世界的许多地方流行，有很高的感染发生率是在围产期由患慢性感染的母亲传染给她们的新生儿。全世界的慢性感染（肝炎病毒）携带者据估计超过三亿人。在这些携带者中，每年有成千上万的人死于慢性乙型肝炎引起的病变（肝硬化或肝细胞肿瘤）。 HB病毒粒子是由两组结构蛋白质组成的，即核蛋白与外壳或外表（“S”）蛋白。S蛋白除了作为病毒颗粒即Dane颗粒的主要外表蛋白外，它是澳大利亚抗原即22nm颗粒的唯一的组成要素。“S”蛋白质为一个编码389-400个氨基酸（具体数字视血法型而定）的大的开放阅读框架（ORF）的转译产物。ORF被分成三个区域其中每个区域以ATG密码子开头，具有在体外作为转译起始位点的作用。这些区域在基因上相应的从5′至3′地顺序上分别被称为pre S-1（108-119氨基酸）、pre S-2（55氨基酸）及S（226氨基酸）。从ORF中得出的六种蛋白质产物有以下的成份：
1）gp42（42，000道尔顿糖蛋白）＝
pre S-1/pre S-2/S（表示pre S-1与pre S-2相邻，再与S相邻）
2）p39（p＝蛋白质）＝pre S-1/pre S-2/S
3）gp36＝pre S-2/S（两个糖基化位点）
4）gp33＝pre S-2/S（一个糖基化位点）
5）gp27＝S（一个糖基化位点）
6）p24＝S
在HBVDane颗粒中所有六种蛋白质大约都是等克分子的范围。在22nm颗粒中，4个较少的蛋白大约是等克分子的范围，而gp42及p39在每个颗粒中最多只出现一个或几种分子。
22nm颗粒或HB表面抗原（HBs Ag）颗粒已从慢性感染（病毒）携带者的胞浆中提纯。由于它们的胞浆（血浆）为阳性颗粒的，这些慢性感染的携带者被称为HBs+。当这些携带者发动一次足够的免疫反应时能够清除感染而成为HBs-。由于他们体内形成了抗HBs的抗体，这些人是抗HBs+的。因此，抗HBs+与疾病的痊愈是相互关联的。因而，希望能够通过HB疫苗来刺激或形成抗体-HBs+以提供抵抗HBV感染的保护作用。
通过实验来对这种假设进行验证。除人之外，黑猩猩是唯一的对HBV感染完全敏感的种，这可以通过黑猩猩的诸如HBs+、肝酶的血清水平的提高等可以数量衡量的标志反映出来。黑猩猩被用三种剂量的提纯的HBs Ag颗粒接种之后，用大剂量的传染性HBV对其进行袭击。当模拟接种的黑猩猩出现患有急性HBV感染的征兆时，用HBs Ag接种的黑猩猩得到了完全的保护而不出现任何感染的征兆。因此，在该实验系统中，由gp27及p24（仅为S区域）组成的HBs Ag颗粒已足以引起保护性的免疫。在这些现察结果的激励下，有人生产出了由HBs Ag颗粒组成的HB疫苗。
最近的实验结果表明pre S-1及pre S-2区域能在抵抗HBV感染的免疫中担当重要的角色。针对pre S-1的抗体（用一个由pre S-1的10至32个氨基酸残基组成的肽通过免疫作用诱导而得）及针对pre S-2的抗体（用一个pre S-2的1至26个氨基酸残基组成的肽通过免疫作用的诱导而得）在体外实验中都同样具有阻断HBV与人类肝癌细胞之间的连接的功能。抗HBs（从用缺少pre S-1或pre S-2的HBs Ag接种的病人身上的血清中获得）不能产生阻断连接的作用。如果在体外模仿体内感染pre-S（即pre S1及pre S2全都连接起来）区域可以代表HBV与其肝细胞受体之间的连接位点，抗pre S可以阻断HBV的连接从而阻断感染的发生。此外，还发现在从急性的HBV感染痊愈的阶段中抗pre S的滴定度增加，表明这些抗体对痊愈所起的作用。最终，还证明用108氨基酸的pre S多肽（27-119个pre S-1残基与1-16个pre S-2残基邻接）对黑猩猩进行接种在某种程度具有抵抗HBV挑战的保护作用。总之，这些实验现象表明pre-S区域是目前的HB疫苗的有用的成分。
为了扩大HB疫苗的产量，生产者经利用重组技术来表达“S”蛋白质。在各种微生物系统中，大肠杆菌及酵母属酿酒酵母最普遍地用于表达许多重组得来的蛋白质。很多在大肠杆菌中表达具有免疫学活性的HBs Ag颗粒的企图都没有获得成功。但是，酵母属酿酒酵母在表达免疫学活性的HBs Ag颗粒方面显出极大的适应性。这些颗粒所制成的疫苗，已经证明具有完全保护黑猩猩抵抗有强活性HBV的挑战的作用。而且，酵母中提得的HBs Ag在人类临床试验中具有与从胞浆中提得的HBs Ag一样有效的免疫学作用。因而，用酵母属酿酒酵母种作为直接合成重组HBs Ag的宿主的效用是完全确定的。由于这一事实，人们希望在免疫原颗粒中表达与S区域连接的整个pre-S区域。
在一些重组体微生物表达系统中，合成许多不同的多肽表明对宿主细胞是有害的。因此，对于表达这些多肽产生有透择性的压力，按比例扩大重组培养物积累的细胞是那些停止对外来多肽进行表达或极少对外来多肽进行表达的那些细胞，从而使培养物变成不实用的多肽源。在某些情况下，有害作用是如此之强，以致当表达由一个强的组成启动子起动时，新转化的细胞不能繁殖而不能在选择板上形成菌落。这种有害作用可以通过采用诱导启动子合成这些多肽而得到克服。在酵母属酿酒酵母中有许多诱导基因。三种富有特征的可诱导系统为半乳糖（GAL）利用基因、醇脱氢酶2（ADH2）基因及χ杂交因子基因。
酵母属酿酒酵母有三个编码与利用半乳糖作为生长碳源有关的酶的基因。GAL1、GAL7及GAL10基因分别编码半乳糖激酶、α-D-半乳糖-1-磷酸尿苷转化酶及尿苷二磷酸半乳糖-4-差向异构酶。在半乳糖不存在时，这些酶的表达极少。在葡萄糖中生长细胞培养中加入乳糖后，在RNA转录水平上，这三种酶被协调地诱导，增加至少1.000倍。GAL1及GAL10基因已经被分子克隆并进行了顺序测定。分别针对各自的编码区域的5′端的调节及启动了顺序被置于LacZ基因的编码区域的邻近。这些实验确定了那些对于半乳糖诱导是必需的而且是充分有效的启动子及调节顺序。
酵母属酿酒酵母还有三个基因，每一个都编码一个ADH的同功酶。其中之一为ADHⅡ，与酵母属酿酒酵母在氧化生长阶段利用乙醇作为碳源的能力有关。编码ADHⅡ同功酶的ADH2基因的表达被葡萄糖产物抑制，因而，在有0.1%（w/v）水平的葡萄糖存在时的发酵生长阶段，实际上不存在ADH2基因的转录。在葡萄糖耗尽并有其他非抑制性碳源存在的情况下，ADH2基因的转录被诱导提高100至1000倍。该基因已经作了分子克隆及顺序测定，并对那些对于转录的去抑制作用是必需的而且是有效的调节顺序及启动子也都得到了明确的确定。
α杂交因子是MATα及MATa细胞之间的杂交所需要的酵母属酿酒酵母的性外激素。这种α杂交因子被表达为前体性外激素导入内质网，经过糖基化及蛋白裂解步骤而成为最终的成熟形式，从细胞分泌出来。这个生化途径被用作对外来多肽的表达。χ杂交因子基因已经被分子克隆并利用其具有pre-pro引导顺序的启动子以表达和分泌多种多肽。从外来蛋白能够穿过粗糙的内质网及高尔基体推断，它们能够经受N-及O-联接的糖基化作用。α杂交因子启动子仅能在表现型为α的细胞中显示活性。在酵母属酿酒酵母中存在4个基因位点称为SIR，它合成抑制其它正常a及χ信息静拷贝所需要的蛋白质。干扰这种抑制的温敏损份存在于这四个位点中至少一个基因产物之中。在这个突变体中，35℃的生长解除了这种抑制，产生a/α表现型的细胞，其中的α杂交因子启动子是失活的。温度移动到23℃时，细胞的表现型转化成为α，从而使启动子成为有活性启动子。业已证明，使用温敏（ts）SIR损伤株可以对几种外源多肽的表达进行控制。
本发明一个目的提供表达载体及其方法，用以在酵母中表达可使之与S区域连接的pre S-1及pre S-2区域以作为免疫原颗粒。另一个目的是提供在酵母中表达pre S-1及pre S-2区域的载体及方法。再一个目的是指明由这些载体转化的宿主细胞重组体的扩大生长的条件，以便可以大体积及高浓度地获得含有pre S的多肽的最大产量以供提纯这种多肽之用。本发明的这些目的及其它的目的通过下列的说明将会更明显。
在酵母属酿酒酵母中对在一条连续的阅读框架与乙型肝炎病毒的表面抗原基因相连的完整的乙型肝炎病毒pre S抗原基因进行了表达。被表达的蛋白质聚集成为颗粒的形状，显示了由两个区域编码的主要的抗原位点，从而突出表明了酵母作为表达pre S区域的宿主的可利用性。这种蛋白质可用于体外诊断系统及作为一种疫苗用于乙型肝炎病毒引起的疾病及/或感染的治疗及预防。
图1A、1B及1C是质粒PYGAP/PSS△，PYGAP/PSSC，PYGAL/PSS△，PYGAL/PSSC，PYADH2/PSS△，PYADH2/PSSC，及PUC13/PSSC的结构示意图。
图2及图3是α杂交因子载体pJC197的结构示意图。
图4A及4B是表示质粒pYαMF/pS△S的结构的示意图。
本发明旨在提供在酵母种中表达与S区域连接的pre-S区域（或其部分）作为一个连续的多肽或者表达pre S区域本身（或其部分）的方法。更具体地说，本发明是利用一可由半乳糖诱导的启动子、一种可由葡萄糖抑制的启动子及一种可由温度诱导的启动子，在酵母属的种中表达这些区域以便克服当用一个强的组成启动子对该区域进行表达时pre-S区域对宿主产生的毒性作用。此外，本发明还揭示了表达包含pre S的呈颗粒状的多肽的重组体细胞的规模扩大到相当大的体积时的操作条件。
对于熟悉本技术领域的人员来说，那些活性可以在生理上进行调节（即可诱导的）的其他启动子也可以用于在酵母种中进行包含pre S的多肽的表达以克服上面提及的pre S区域的毒性作用。
Dane颗粒被用作分离pre S1/pre S2/SORF的HBV核酸的来源。采用了内源性聚合酶反应以由自然存在于HB病毒粒中的缺失来产生共价封闭的环状双股HBV基因组的DNA。对修复的DNA进行分离并用EcoRⅠ进行消化。大肠杆菌克隆载体pBR322同样用EcoRⅠ消化并与HBV DNA连接，用于转化大肠杆菌。选出重组体质粒，这些质粒包括变更成为环将的HBV基因组，在该HBV基因组中，EcoRⅠ位点将完全的pre S1/pre S2/S编码区域分隔成一个0.4千碱基对的5′区域及一个0.8千碱基对的3′区域。这两个区域通过亚克隆以进行完整基因的最终的组装。对于3′区域，用EcoRⅠ及BamHⅠ对pUC19进行消化，然后连接到由该编码区的最后5个核苷酸、终止密码、一个HindⅢ位点及一个BamHⅠ末端组成的合成寡核苷酸上。pre S1/pre S2/S基因的由一个0.8Kb PEcoRⅠ-AccⅠ段组成的3′部份被克隆进入该载体中。由一个0.3Kb PBamHⅠ-EcoRⅠ片段组成的5′部份被亚克隆进入到pUC18中。根据情况这可以通过在两种方法中任选一种方法来加以实现。方法的选择取决于（1）是要表达完全的ORF还是（2）要消除被公认的憎水信号顺序（2-15个氨基酸）。第一种方法，用HindⅢ及EcoRⅠ消化pUC18然后连接到一个72bp的合成寡核苷酸上，从BamHⅠ位点向上游，通过未端ATG及一个10bp的非转译引导顺序至一个可以和HindⅢ相容的末端，重新构成完整的ORF。对于第2种方法，则连接到一个具有相同功能但消除了2-15氨基酸编码区域的30bp的寡核苷酸上。然后，将5′区域的0.3Kbp BamHⅠ-EcoRⅠ片段连接到这些与寡核苷酸相连的克隆载体中的任一个中。5′pUC18及3′pUC19克隆通过在大肠杆菌中生长而放大，然后克隆区域被从分离的质粒中消化为HindⅢ-EcoRⅠ片段。接着，连接5′片段与3′片段，用HindⅢ进行消化，然后将具有HindⅢ末端的完全的ORF克隆进入预先用HindⅢ消化的pUC13中。完全的ORF作为一个HindⅢ片段用琼脂糖凝胶电泳进行提纯，以克隆到GAPDH、ADH2或GAL10启动子表达系统中。
含有GAPDH表达盒的PBR322质粒在GAPDH启动子与ADH1转录终止区之间拥有一个唯一的HindⅢ位点，上述的来自于pUC13的完全的ORF以适当的方向插入在GAPDH启动子与ADH1转录终止区之间的HindⅢ位点中。然后，用SphⅠ消化分离这个3.0Kb P的表达盒并且连接至穿梭载体pcl/l上以取代小的SphⅠ片段。用此方式组建的载体用于转化酵母属酿酒酵母的2150-2-3株（参见Valenzuela等.，Biotechnology3∶317-320，April1985）;然而，在选择板上对转化混合物进行载培时，不形成稳定的菌落。对于表达产物的毒性作用的猜疑，通过将pre S1-pre S2/S编码区域的大部分去除并用BamHⅠ消化及与质粒重新连接而产生移码突变的方式作了进一步的确定措施：用这样的方法制备的DNA可以有效地转化酵母细胞。YEP52大肠杆菌/酵母属酿酒酵母穿梭载体驱动插入唯一的HindⅢ位点上的外源基因从可被葡萄糖诱导的GAL10启动子开始进行表达。上述pre S1/pre S2/SORF（具有HindⅢ末端）被连接到载体的HindⅢ位点上。将这种重组体质粒导入酵母属酿酒酵母株BY-19（也称为DCO4，参见Broach等.，Cell21∶501-508，1980）并选择转化的克隆。细胞在含有甘油乳酸的合成选择性培养基中生长。然后，在培养中加入半乳糖以诱导表达。制备溶胞产物，用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行柝分，并在硝基纤素上进行Western blot测试。由于仅仅存在于诱导的转化体中及根据与恢复期病人HB血清的反应性，p39产物被发现是pre S1/pre S2/S所特有的产物。此外，转化体的胞溶物（而非野生型的酵母属酿酒酵母），通过放射免疫测定法证实HBs Ag，并基于与聚合的人类白蛋白之间的连接（这种连接对pre S区域专一性的）这样一个事实而证实确是pre S。利用一个连接有识别颗粒状的HBs Ag的山羊抗体的免疫亲和层析柱从转化的酵母属酿酒酵母中纯化pre S1/pre S2/S。洗脱的产物经放射免疫测定证实是HBs Ag，因其与聚合的人类白蛋白相连接而确定为pre S，并且在电子显微镜下呈现颗粒状。这些实验数据表明在酵母属酿酒酵母中，完整的pre S1/pre S2/S蛋白质是表达成为颗粒状的p39蛋白。这种同时包括HBs及pre S抗原的颗粒状蛋白可以有效地作为HB疫苗及诊断试剂。
pADH2△67（-1）大肠杆菌克隆载体含有能够在酵母属酿酒酵母中驱动对插入ADH2（可由葡萄糖抑制）的启动子的独特的HindⅢ位点的外源基因进行表达。用BamHⅠ及EcoRⅠ消化p ADH2△67（-1），并用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段产生平端，并用预备的琼脂糖凝胶电泳提纯包含有ADH2启动子及终止区的49Kb P片段。用PstⅠ消化pUc7，用T4 DNA聚合酶产生平端，然后连接到4.9Kb P片段上。产生的质粒用SalⅠ进行消化，用预备的琼脂糖凝胶电泳提纯4.9Kb P片段。用HindⅢ消化p Uc 18，用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段产生平端，然后进行自身连接。所产生质粒用SalⅠ进行消化并连接到4.9Kb P SalⅠ片段上。上述的1.2Kb Ppre S1/pre S2/SORF（具有HindⅢ末端）被连接到该载体的HindⅢ位点上。用SalⅠ消化产生的质粒，并将6.1Kb P片段连接到穿梭载体pCl/l的SalⅠ位点上。质粒pCl/l是pJDB219的衍生物，pJDB219中与pJDB219中细菌质粒pMB9对应的片段被pBR322所取代。将这样的重组体质粒导入酵母属酿酒酵母中，并选择转化的克隆。细胞生长在含有0.3%（w/v）葡萄糖的合成的选择性的培养基中。48小时之后，当葡萄糖耗尽时，制备胞溶产物然后用SDS-PAGE进行柝分并对硝基纤维素进行Western blot分析。有一个p39产物因其仅仅存在于转化体中及其与恢复期病人的HB血清的反应性被发现是专一于pre S1/pre S2/S的。此外，转化体而非野生型的酵母属酿酒酵母通过放射免疫测定确证为HBs Ag并因其与聚合的人类白蛋白之间的连接而确证为pre S。利用一个有可以识别颗粒状的HBs Ag的山羊抗体的免疫亲和层析柱从转化了的酵母属酿酒酵母中提纯pre S1/pre S2/S。洗脱产物通过放射免疫测定而确认为HBs Ag，因其与人类聚合白蛋白之间的连接而被确认为pre S，并在电子显微镜下呈现颗粒状。
α杂交因子基因MFα1被克隆在取自于酵母属酿酒酵母DNA基因组的质粒载体上。产生的pKH2质粒用EcoRⅠ进行消化并用预备的琼脂糖凝胶电泳提纯含有α杂交因子的1.7Kb P片段。用EcoRⅠ消化质粒pRJ148（缺乏HindⅢ位点的修饰的pBR322）并与1.7Kb P片段连接以产生质粒p RJ159。用HindⅢ消化该DNA并自身连接以形成此时具有一个独特的HindⅢ位点的质粒pRJ167。质粒pRJ167用HindⅢ消化并通过插入一个合成的寡核苷酸转接体进行修饰以产生一个含有位于启动子及pre-pro引导物的3′端，以及位于所有阅读框架的转译终止信号的5′端的独特的HindⅢ位点的新的质粒（pRJ178）。HindⅢ位点用HindⅢ消化而转化成为BamHⅠ位点，用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段产生平端，加上BamHⅠ连接子并自身连接以形成质粒pJC193。该质粒用EcoRⅠ消化，用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段产生平端，加入BclⅠ连接子进行修饰，用BclⅠ消化，并用预备的凝胶电泳分离含有α杂交因子基因的1.5Kb P片段。所产生的该BclⅠ片段用小生肠道的碱性磷酸酶进行处理，然后插入到pCl/l的独特的BamHⅠ位点上，在此步骤中破坏原先的BamHⅠ位点（质粒pJC194）。该DNA用BamHⅠ进行消化并自身连接以去除多余的BamHⅠ连接子，以产生新的表达α杂交因子表达质粒pJC197。上述的pUc13中的pre/pre S2/SORF用HinfⅠ及AvaⅠ消化，并用预备的琼脂糖凝胶电泳提纯0.5Kb PORF。用SalⅠ及BamHⅠ消化pUc18并连接到二个含成的寡核苷酸上。5′寡核苷酸包括一个SalⅠ末端、一个HindⅢ位点、编码一个KEX2劈开位点的核苷酸、编码pre S1的2及3氨基酸的核苷酸以及一个HinfⅠ末端。3′寡核苷酸包括一个AvaⅠ位点、编码pre S2最终的8个氨基酸的核苷酸、终止密码子、一个HindⅢ位点及一个BamHⅠ末端。0.5Kb PORF被克隆进入到与寡核苷酸连接的p Uc 18载体中。所产生的载体用HindⅢ消化并用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段产生平端。产生的被修饰的0.5Kb Ppre S1/pre S2 ORF通过预备琼脂糖凝胶电泳被提纯并被克隆进入预先用BamHⅠ消化并用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段产生平端的p Jc197中以产生可通过操作而与χ杂交因子的pre-pro引导物顺序相连的pre SORF。
α杂交因子的启动子仅在表现型为χ的细胞中才有活性。在酵母属酿酒酵母中有4个称为SIR的位点它合成抑制通常情况下静止的a及α信息的拷贝所必需的蛋白质。JRY188株细胞（MATα、Sir3-8、leu2-3、leu2-112trpl、ura3-52、his4）在SIR3基因产物中含有一个ts（温敏）损伤。结果，生长135℃的TRY188表现型为a/α α杂交因子启动子是没有活性的;另一方面，在23℃生长的细胞的表现型为α，因而能够诱导由α杂交因子启动子指导的表达作用。含有pre S1/pre S2的的重组体χ杂交因子质粒被用于转化酵母属酿酒酵母JRY188株（Brake等.，Proc.Natl.Acac.Sci.USA81∶4642-4646，1984）并选择转化的克隆。在35℃下细胞在合成的（leu）选择性培养基中生长。接着将A600＝0.5的细胞在23℃下于同样的培养基中生长。制备胞溶产物，用SDS-PAGE拆分，并对硝基纤维素进行Western blot分析。一个p21产物因其仅存在于转化体中及其与恢复期的人类HB血清的反应性而被发现是专一于pre S1/pre S2的组成启动子GAPDH。指导pre S1/pre S2/S表达的载体不能稳定地转化酵母属酿酒酵母这一点，表明组成性及高水平pre S表达对酵母属酿酒酵母产生不良的生理影响。从同一个启动子指导S多肽表达的质粒pHBS56-GAP347/33可以有效地转化酵母属酿酒酵母，并且，如此转化的酵母属酿酒酵母可以有效地生长至生产的规模。这一现象突出了利用一个可诱导的、可以去阻遏的、或具有较低活性组成启动子在酵母属酿酒母中指导含有pre S的多肽的表达的穿梭质粒的可利用性。该现象特别地突出了利用GAL10启动子指导在酵母属酿酒酵母中表达pre S1/pre S2/S的表达载体的可利用性。以起同样作用的可调节的GAL10启动子，或GAL1、GAL2、GAL7或MEL1启动子可以使重组体酵母属酿酒酵母培养在开始合成重组体蛋白之前放大到生产规模的大体积，藉此，使对于宿主细胞产生的不利影响减到最小，对于本技术领域内的人来说这一点是明显的。此外，含有ADH2及χ杂交因子（但不限于ADH2及α杂交因子）等可由其它方式生理地进行诱导或去阻遏的别的可调节启动子的表达载体也能够用于指导含pre S的多肽的表达，这一点对于本发明技术领域的人员也是明显的。再有，可利用一个活性低于GAPDH的组成性启动子，例如CYCl（但不限于CYCl）启动子，以一个较低的细胞蛋白质比例驱动表达包含pre S的多肽，以便避免过度表达所产生的生理上的不利影响，这一点对于本技术领域的人员亦是明显的。应该利用合适的测定系统，例如Western blot或者放射免疫测定法对本系统中含有pre S的多肽的表达情况进行测定，以便确定一个最佳的时候以获得最多的增养物，这一点对于本技术领域的人员也是明显的。
酵母属包括许多的种。最通常地用作重组DNA媒介的外源多肽表达的宿主的是酵母属酿酒酵母或面包酵母。但是，它和酵母属中的其它各个种之间的区别不总是那么明确的。其中有许多的种可以与酵母属的酿酒酵母杂交并可能类似于或相同于酵母属酿酒酵母中的启动子，其中包括，但不限于，GAL10、ADH2及/或χ杂交因子启动子。因此，可以选择酵母属的其它的种包括但不限于Carlsbergensis、Uvarum、rouxii、montanus、kluyveri、elongisporus、norbensis、oviformis及diastaticus，用于表达含有pre S的多肽，这一点对于本技术领域的人员也是明显的。
有若干个酵母的属，诸如Hansenula、Candida、Torulopsis及Pichia表明有利用甲醇作为生长的唯一碳源的类似的代谢途径。已经从Pichia pastoris中分离出了一种编码参与该代谢途径的醇氧化酶的基因。已经分离出了P.Pastoris的醇氧化酶的启动子，并且表明该启动子对于甲醇诱导表达是敏感的。这样的可诱导的启动子可用于在酵母中表达那些不被选择的多肽。在颗粒状的P.Pastoris中这样的启动子特别地在可诱导表达S区域的质粒中显示出活性。这一现象表明其它的酵母属可以作为宿主而起到以免疫活性形式表达重组体DNA媒介的S多肽的能力。对于本技术领域的人员应该是明白的另一点是对于含有pre S的多肽的表达，对宿主菌株的选择可以扩展至Saccharomycetaceae及Cryptococcaceae科的其它的酵母属中的种，包括但并不限于Pichia、Candida、Hansenula、Torulopsis、Kluyveromyces及Saccharomycopsis。
近年来，在比酵母高等的真核生物的细胞，尤其是在哺乳动物细胞系及用杆状病毒表达载体转染的昆虫细胞中进行的重组体蛋白质表达有一些成功的例子。作为免疫原颗粒成功地表达了S区域本身以及与S区域相连的pre S2区域。因此，在酵母中作为免疫原颗粒而表达完全的pre S1/pre S2/S区域的概念很容易地扩展至在较高等的真核生物的细胞，例如但不限于哺乳动物细胞系如Vero、GH3、It K及CHO中进行连接区域的表达，这一点对于本技术领域的人员的明显的。
下列的例子作为举例对本发明进行描述但并不限于这些例子。以下例子提及的内容在此用作参考。
例1
克隆pre S1/pre S2/S基因
Dane颗粒（亚类ayw）是已告成熟的技术[Landers et al.，J.Virology 23∶368（1977）]从受感染的病人的血浆中提纯得到的。乙型肝炎病毒基因组的DNA以切口、缺口的形式存在于病毒颗粒中[Hruska et al.，J.Virology 21∶666（1977）]。为制备分子克隆用的DNA，利用内源性聚合酶反应产生共价闭环状双股DNA[Landers et al.，J.Virology 23∶368（1977）]。DNA通过在含有十二烷基硫酸钠和蛋白酶K的缓冲液培育，然后用酚、氯仿和异戊醇（依次按25∶24∶1的比例）配制而成的溶液萃取，并再用乙醇沉淀法浓缩而进行去蛋白作用。提纯后的DNA用大肠杆菌消化完全。大肠杆菌克隆载体PBR322也用Eco RⅠ消化，并连接到消化后的乙型肝炎病毒DNA上，以用于转化大肠杆菌。将含有围绕着单一Eco RⅠ位点（PHBV/AYW-1，图1A）成环状排列取向的乙型肝炎病毒基因组的重组体质粒分离出来，将整个pre S1/pre S2/S编码区分成0.4千碱基对（kbp）的5′结构域（区域）和0.8千碱基对的3′结构域[Galibert et al.，Nature 281∶646（1979）]。这两个结构域（区域）进行亚克隆，以最终重新组合整个基因。PUC19用Eco RⅠ和Bam HⅠ消化，然后被连接到密码区、终止密码子、HindⅢ位点和Bam HⅠ终端的最后5个核苷酸所组成的一个合成寡核苷酸上。该寡核苷酸的结构为：
ATACATTTAAAGCTTG
TGTAAATTTCGAACCTAG
由0.8千碱基对EcoRⅠ-AccⅠ片段所组成的pre S1/pre S2/S基因的3′部分被克隆到此载体中（PUC19/DSD，图1A和1B）。
5′部分以两种方式中的任一种方式克隆到PUC18上，采用何种方法取决于是否需表示整个ORF，还是消除推想的疏水信号顺序（氨基酸2-15）。第一个对策是用HindⅢ和Eco RⅠ消化PUC18，然后将其连接到72碱基对的合成寡核苷酸上，后者从远侧ATG上方的Bam HⅠ位点，通过一个10碱基对的未转译的前导顺序，至可与HindⅢ相容的末端以重组全部ORF。上述寡核苷酸的结构为：
AGCTTACAAAACAAAATGGGGCAGAATCTTTCCACCAGCAATCCTCTGGGATTTTT
ATGTTTTGTTTTACCCCGTCTTAGAAAGGTGGTCGTTAGGAGACCCTAAAAA
TCCCGACCACCAGTTG
AGGGCTGGTGGTCAACCTAG。
（＊自然顺序包括C，而不是T;上述变化破坏了HinfⅠ位点，但未改变编过码的氨基酸）。第二种对策是连接一个30碱基对寡核苷酸，后者起72碱基对寡核苷酸相同的作用，但消除了氨基酸2-15的密码区。此种寡核苷酸的结构为：
AGCTTACAAAACAAAATGGACCACCAGTTG
ATGTTTTGTTTTACCTGGTGGTCAACCTAG。
然后将5′结构域（区域）的0.4千碱基对Bam HⅠ-Eco RⅠ片段连接到这些寡核苷酸连接的克隆载体中的任一个（PUC18/USD△，PUC18/USDC，图1A和1B）。5′PUC18和3′PUC19克隆通过在大肠杆菌中生长而扩增，而密码区从离体质粒中被消化为HindⅢ-Eco RⅠ片段。这些片段用HindⅢ连接和消化，并将具有HindⅢ末端的整个ORF克隆到业已用HindⅢ消化的PUC13上（PUC13/PSS△，PUC13/PSSC：图1B和1C）。如例2、3和4所述，通过制备琼脂糖凝胶电泳法提纯上述载体的整个ORF，以将其克隆到GAPDH或GAL10启动子（YEp52），或者ADH-2启动子表达系统中。
例2
利用GAPDH启动区指导表达
酵母属酿酒酵母中pre S1/pre S2/S
包含GAPDH表达盒[Holland and Holland，J.Biol.Chem.255∶2596（1980）]PBR322质粒具有一个单一的HindⅢ克隆位点，带有HindⅢ末端（如例1所述）的1.1千碱基对pre S1/pre S2/S ORF被克隆到该位点（PEGAP/PSS△，PEGAP/PSSC，图1C）。通过SphⅠ消化和制备琼脂糖凝胶电泳法从PBR322质粒中除去表达盒（包含HBV基因），然后将该表达盒克隆到预先用SphⅠ（PYGAP/PSS△，PYGAP/PSSC，图1C）消化的穿梭载体PCl/1中[Beggs，Nature 275∶104（1978）;Rosenberg et al.，Nature 312∶77（1984）]。具有表达盒的PCl/1质粒被用于转化酵母属酿酒酵母菌株2150-2-3;然而在转化混合物平板培养后的选择平板培养中几乎回收不到稳定的重组体酵母克隆。通过BamHⅠ消化和再连接质粒，而除去pre S1/pre S2/S密码区，并产生移码突变，证实了含有产物的pre S对酵母属酿酒酵母的推测毒性;用这种方式制备的DMA能有效地转化酵母。
例3
利用GAL10启动子指导表达
酵母属酿酒酵母中pre S1/pre S2/S
YEP52大肠杆菌/酵母属酿酒酵母穿载体驱动对嵌在半乳糖-诱发的GAL10启动子中一个单一HindⅢ位点的外来基因的表达[Broach et al.，In Experimental Manipulation of Gene Expression，p83，Academic Press（1983）]。而且，该载体包含有关在酵母属酿酒酵母中繁殖的部分2∑循环顺序、（ori和一个反向重复）、在酵母属酿酒酵母中选择用的LEU2、以及分别用于大肠杆菌中扩增和选择的ori和bla顺序。具有HindⅢ末端（见例1所述）的1.1千碱基对pre S1/pre S2/S ORF被克隆到单一HindⅢ位点（PYGAP/PSS△，PEGAL/PSSC，图1C），并将所产生的质粒用于转化从普林斯顿（Princeton）大学的J.R勃罗契（Broach）博士实验室中得到的酵母属酿酒酵母菌株BY-19。分离重组体克隆，并检验它的pre S1/pre S2/S多肽的表达。然后使克隆在合成选择（leu-）甘油-乳酸培养基[0.67%（重量/体积）无氨基酸的酵母氮碱、0.004%腺嘌呤、0.004%尿嘧啶、1%琥珀酸、0.005%酪氨酸、0.002%精氨酸、0.006%异亮氨酸、0.004%赖氨酸、0.001%甲硫氨酸、0.006%苯基丙氨酸、0.006%苏氨酸、0.004%色氨酸、0.001%组氨酸、0.6%氢氧化钠、2%（体积百分比）乳酸和3%（体积百分比）甘油]中生长。在酵母生长达到A600＝0.3后，加入半乳糖，并使之浓度达到2%（重量/体积），由此诱发该基因产物的生产。通过AusriaR（Abbot）反应性、聚合人体清蛋白结合活性[Machida et al.，Gastroentrology 86∶910（1984）]和用Western检验法（Western blots）测到的P39而捡出HBs Ag，以验证所需抗原的表达，其中P39是用恢复期人体血清和放射性标记的金黄色葡萄球菌蛋白质A显现的。这些重组体克隆用作例6中所述的大规模发酵和分离的种子培养物。
例4
利用ADH2启动子指导表达
酵母属酿酒酵母中pre S1/pre S-2/S
PADH2△67（-1）大肠杆菌克隆载体具有能在酵母属酿酒酵母中驱动嵌在ADH2去阻遇启动子[Russell et al.，J.Biol.Chem.258∶2674（1983）;E.T.Young，submitted for publication]中一个单一HindⅢ位点的外来基因的表达。上述单一HindⅢ位点位于5′未转译的侧翼顺序的核苷酸-1和ADH2基因的转录终止区之间。用BamHⅠ和EcoRⅠ消化PADH2△67（-1），用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段使之成为平端，并用制备琼脂糖凝胶电泳法提纯含有ADH2启动子和终止区的4.9千碱基对片段。用PstⅠ消化PUC7，用T4 DNA聚合酶使之成为平端，并将其连接到4.9千碱基对ADH2片段上。所产生的质粒用SalⅠ消化，并用制备琼脂糖凝胶电泳法提纯4.9千碱基对片段。用HindⅢ消化PUC18，用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段使之成为平端，并自相连接。所生成的质粒用SalⅠ消化，并连接到4.9千碱基对SalⅠ片段上，产生载体用PUC18△HindⅢ-ADH2（图1C）。将两个具有HindⅢ末端（见例1所述）的不同的1.1千碱基对pre S1/pre S-2/S ORF连接到上述载体的HindⅢ位点上，所生成的质粒（PEADH2/PSS△，PEADH2/PSSC，图1）用SalⅠ消化，并将此6.1千碱基对片段连接到PCl/1的SalⅠ位点，产生质粒PYADH2/PSS△，PYADH2/PSSC（图1C）。这些重组体质粒被用于转化从华盛顿大学的L.赫脱威尔（L.Hartwell）博士实验室中得到的酵母属酿酒酵母菌株2150-2-3。分离重组体克隆，并检验它的pre S1/pre S-2/S多肽的表达。然后使克隆在含有0.3%（重量/体积）葡萄糖的合成选择（leu-）培养基中生长。细胞在30℃温度下经48小时生长至A600＝1.5，在此段时间内，葡萄糖的耗尽业已去阻遇ADH2启动子。或者，使克隆在含有作为碳来源的2%葡萄糖合成选择（leu-）培养基中生长。细胞在30℃温度下经24小时生长至A600为0.1或1.0，此时，对盛有复合培养基的较大烧瓶或发酵器进行接种[接种量为10%（体积百分数）]，基中复合培养基内含有1.6%葡萄糖作为碳源。细胞如上所述那样再经45小时生长至A600＝12.0-14.0，其间葡萄糖的耗尽业已去阻遇ADH2启动子。通过AUSRIAR（Abbott）反应性、聚合人体清蛋白结合活性、以及用Western检验法测到的P39而检出HBs A9，以验证所需抗原的表达，其中P39系用恢复期人体血清和放射性标记的金黄色葡萄球菌蛋白质显现一个选出的重组体克隆用作例7中所述的按比例扩大的发酵和分离的种子培养物。
例5
利用α杂交（交配）因子启动子和（pre-pro）引导物
（引导）指导表达在酵母属酿酒酵母中的pre S1/pre S-2/S
α杂交（交配）因子基因MFχ1已被克隆到酵母属酿酒酵母基因组DNA的质粒载体上[Kurjan et al.，Cell 30∶933（1982）;Singh et al.，Nucleic Acids Res.11∶4049（1983）].所产生的质粒p KH2用EcoRⅠ消化，并用制备琼脂糖凝胶电泳法提纯具有χ杂交（交配）因子基因的1.7千碱基对片段。质粒pRJ148（无HindⅢ位点的一个改变的pBR322）用EcoRⅠ消化，并与1.7千碱基对片段连接，而产生质粒pRJ159。该DNA用HindⅢ消化，并自行连接，而形成具有一个单一HindⅢ位点的质粒pRJ167。质粒pRJ167用HindⅢ消化，并通过嵌入一个合成寡核苷酸结合体而改变，由此产生一个具有一个单一HindⅢ位点的新质粒（pRJ178），其中HindⅢ位点在所有三个阅读框架中均位于启动子和pre-pro腱（引导）的3′侧，以及转译终止信号的的5′侧（图2）。通过用HindⅢ消化、用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段平端、添加联结子以及自相连接，将HindⅢ位点转化成BamHⅠ位点，从而形成质粒pJC193。该质粒用EcoRⅠ消化、用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段平端、添加BclⅠ联结子而改变，用BclⅠ消化、以及用制备琼脂糖凝胶电泳法分离具有α杂交（交配）因子基因的1.5千碱基对片段。所产生的BClⅠ片段用小牛肠碱性磷酸酶处理，并被嵌入PCl/1的单一BamHⅠ位点，在此过程中破坏了原来的BamHⅠ位点（质粒pJC194）。该DNA用BamHⅠ消化，并自相连接，以除去过量的BamHⅠ联接子，产生新的χ杂交（交配）因子表达质粒pJC197（图3）。PUC13/PSSC质粒（见例1所述）用HinfⅠ和AvaⅠ消化，并用制备琼脂糖凝胶电泳法提纯0.45千碱基对ORF（图4A）。用SalⅠ和BamHⅠ消化PUC18，然后将其连接到2个合成寡核苷酸中。5′寡核苷酸由一个SalⅠ末端、一个HindⅢ位点、编码KEX2切开位点的核苷酸、编码pre S-1的氨基酸2和3的核苷酸，以及一个HinfⅠ终端组成，其结构为：
TCGACAAGCTTGGATAAGAGAGGGCAG
GTTCGAACCTATTCTCTCCCGTCTTA
3′寡核苷酸包括一个AvaⅠ位点、编码pre S-2中最后8个氨基酸的核苷酸、终止密码子、一个HindⅢ位点和一个BamHⅠ终端，其结构为：
TCGAGGATTGGGGACCCTGCGCTGAACTAAAGCTTG
CCTAACCCCTGGGACGCGACTTGATTTCGAACCTAG
将0.4千碱基对ORF克隆到这个寡核苷酸联接的PUC18载体中（图4A和4B），所产生的载体（PUC18/PS△S）用HindⅢ消化，并用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段平端，由此产生一个含有与χ因子pre pro（引导物）相联结的pre S1/pre S2/ORF的表达盒。然后用制备琼脂糖凝胶电泳法提纯该表达盒，并将其克隆到业已用BamHⅠ消化，且用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段平端、（PY αMF/PS△S，图4B）的pJC19中，由此产生与χ因子pre-pro（引导物）相联结的pre S1/pre S2/ORF。
α杂交（交配）因子启动子仅在表型上是α的细胞中具有活性[Brake et al.，Mol.Cell Biol.3∶1440（1983）]。在酵母属酿酒酵母中有4个称为SIR的位点，它们合成用于阻遇其他通常静静地复制a或χ信息所需的蛋白质[Rine et al.，Genetics 93∶877（1979）]。菌株JRY188细胞（MATχ，Sir 3-8，leu 2-3，leu 2-112，trpl，ura 3-52，his 4）在SIR3基因产物中具有一个温度敏感损伤，因此在35℃温度下生长的JRY188细胞在表型上是a/α，而且α杂交（交配）因子启动子没有活性;另一方面，在23℃温度下生长的细胞在表型上是α，因此能够诱导由α杂交（交配）因子启动子控制的表达[Brake el al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81∶4642（1984）]。将含有重组体pre S1/pre S2/的α杂交（交配）因子质粒用于转化从伯克利的加利福尼大学吉斯柏·赖因博士实验室中得到的酵母属酿酒酵母菌株JRY188，并选出转化克隆。在37℃温度下，使细胞在合成选择（leu）培养基中生长，接着让A600＝0.5的细胞在相同培养基中，但温度为23℃的条件下生长。然后制备溶胞产物，用SDS-PAGE分析，并用Western测定法在硝化纤维素上测定。根据P21产物仅在转化突变型中存在，以及它与恢复期人体HB血清的反应性，因而认为这种产物是pre S1/pre S2特有的。
例6
用免疫亲和色谱提纯颗粒状
pre S1/pre S2/S
如例3所述的方式产生的重组体酵母属酿酒酵母（包括氨基酸2-15在内的完整的pre S顺序）在装有9升合成选择甘油-乳酸培养基（组成与例3所述的相同）的新布鲁斯威克科学（New Brunswick Scientific）发酵器中生长。发酵条件如下：250转/分的搅拌速率，2.5升空气/分，30℃。生长至A660＝0.25后，通过加入半乳糖（2%（重量/体积）]而诱导产物合成，发酵过程再继续进行33小时，直至最后A660＝2.40。然后在Amicon DC-10装置中进行微过滤，以采集酵母细胞，接着使其悬浮在30毫升缓冲液A中（0.1MNa2HPO4，PH7.2，0.5MNa Cl）中，并在75-85磅/英寸2的Stansted高压室中断裂。用120毫升缓冲液A稀释断裂细胞悬浮液（湿细胞重31克），并加入Triton X-100，至最终浓度为0.5%（重量/体积），尔后将悬浮液在10，000Xg和4℃温度下离心分离20分钟，使其澄清。去澄清后液体培养基的上层清液，并用含有对付HBs Ag的抗体[Mc Aleer et al.，Nature 307∶178（1984）]的琼脂糖（Sepharose）4B在4℃温度下培养19小时，以使抗原吸附到树脂上。培养期结束后，将浆液加温至室温（其后的操作步骤均在室温下进行），并在真空下除气15分钟。将除气后的浆液倾入2.5×40厘米柱中，俟柱充满后，用缓冲液A洗去未结合的蛋白质，尔后用3MKSCN的缓冲液A洗提抗原。使含有抗原的部分在4℃温度下对PH为7的0.007M Na2HPO4-0.15MNa Cl溶液透析，并汇集成20毫升含有1.08毫克蛋白质的透析亲和液（Dialyzed Affinity Pool），接着将16毫升上述亲如液用5.6毫升，PH为7.2的0.06MNa HPO，0.15MNa Cl溶液稀释到40毫升。所得产物通过Millex-GV0.22∑m膜过滤而灭菌。最后用Ausria反应性和聚合人体清蛋白结合活性检测HBs Ag，从而鉴定和证实透析亲和液中的产物。
例7
用免疫亲和色谱法提纯
颗粒状pre S1/pre S2/S
按例4所述方式产生的重组体酵母属酿酒酵母（包括氨基酸2-15在内的整个pre S顺序）在充有9.0升复合培养基的新布鲁斯威克科学发酵器中生长，其配制方法与文献中描述的相同，但用Hy Soy（琥珀）代替蛋白胨。发酵条件如下：搅拌速率为500转/分，充气量每分钟5.0升空气，温度30℃，时间44小时，其间A600从0.65增加到9.50。然后采集酵母细胞，并使之溶解，接着按例6所述方法提纯pre S1/pre S2/S产物。最后采用Ausria反应性、聚合人体清蛋白结合活性和用western测定法测得的p39而检测HBs Ag，由此鉴定和证实所得的产物，其中p39系用恢复期人体血清和放射性标记的金黄色葡萄球菌蛋白质A显现。