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复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体及其制备方法
    【技术领域】

    本发明属于生物制药领域，具体涉及复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体及其制备方法。

    背景技术

    磺胺药是一类人工合成的抗微生物药，自1935年发现以来，在控制细菌性感染病中发挥了巨大作用。具有抗菌谱广；性质稳定，便于长期保存，价格低廉等优点。如：磺胺间甲氧嘧啶钠，为N-(6-甲氧基-4-嘧啶基)-4氨基苯磺酰胺钠盐一水合物。体内乙酰化率低，因而在体内抗菌效力较强，并且较少引起泌尿道特别是肾的损害；内服后吸收良好，血中浓度较高，但有效浓度维持时间较短(猪5.8小时，山羊7小时，湖羊2小时)；对猪弓形虫病、猪水肿病和家畜球虫病等都有较好的疗效，常用于畜禽敏感菌感染。

    磺胺类药物的抗菌增效剂甲氧苄啶(TMP)均为淡黄色或白色结晶粉末；无臭，味微苦；几乎不溶于水，易溶于酸及有机溶剂。口服或注射后吸收迅速，维持时间短。抗菌作用同磺胺药，但较弱；二者合用，能使磺胺类药物的抗菌作用增加数倍至数十倍，并可呈现杀菌作用，对磺胺类药有耐药性的菌株，亦能增效作用；此外还能增强各种抗生素如四环素、青霉素及红霉素的抗菌效力。在临床应用上，常以1∶5与磺胺药合用。甲氧苄啶单用时可能在某些菌株迅速出现耐药性，但毒性很低，治疗量不会出现明显的毒性反应。磺胺间甲氧嘧啶钠与甲氧苄啶两者联合使用，使得磺胺类药物在抗微生物新药不断涌现的今天，仍然在临床上广泛应用。

    尽管磺胺间甲氧嘧啶钠与甲氧苄啶配合后抗菌作用显著增强，临床应用较为广泛，但在临床应用上仍然具有一些缺陷，如它的半衰期较短，由于是抑菌剂，首次剂量要加倍且需要不断反复给药。仍然具有一定的副作用，常表现为：精神沉郁、食欲减退或废绝、贫血、白细胞减少、尿少或无尿、血尿和体温升高等；禽类过量使用可致大批死亡，或见增重减慢、产蛋量下降及因肠道菌群失调引起维生素B₁、K吸收减少产生的多发性神经炎和全身性出血症。另外该药物易产生骨髓抑制、白细胞减少症、血小板减少症等，免疫系统受损伤时该药物会产生更高的毒性。因此，合理的用药、提高临床疗效、降低药品不良反应就成了当物之举。

    脂质体(liposome)是磷脂依靠疏水缔合作用在水中自发形成的一种分子有序组合体，为多层囊泡结构，每层均为类脂双分子膜，层间和脂质体内核为水相，双分子膜间为油相，膜厚度约为4nm。正因为既有水相，又有油相，这一基本性质，为亲水亲油药物包裹在同一脂质体中提供了依据。而且因为其粒子大小处于纳米级的介观范围，有许多独特的物理、化学性质，它由磷脂在水中自发形成，制备工艺简单，在人体内具有无毒、无免疫原性、可降解、缓释等特点，所载药物广泛，并减少所需药量，增强其体内稳定性和药理作用，降低毒副作用，使药物具有被动靶向性特征，还可制成免疫脂质体实现主动靶向性。然而由卵磷脂(PC)和胆固醇(Cho1)等组成的传统脂质体是热力学不稳定体系，在体内外的弱稳定性限制了它的使用，极大影响其作为药物载体的应用。

    此外，脂质体在血液中的稳定性是发挥药物载体作用的关键。血液中有多种破坏因素：高密度脂蛋白(HDL)是破坏脂质体的主要成分，载脂蛋白A-1(apoA-1)易从HDL上脱落并与脂质体磷脂结合，且HDL和脂质体易发生apoA-1与磷脂的互换，脂质体膜形成孔洞；同时脂质体在血液中激活补体系统，最终形成攻膜复合体，脂质体膜出现亲水性通道，引起药物渗漏和水、电解质的大量进入，最终渗透裂解脂质体；血清白蛋白与脂质体磷脂结合形成复合物，降低其稳定性；血液中的磷脂酶可水解磷脂，该反应强弱由磷脂结构决定；脂质体进入循环系统后，未经修饰的脂质体大部分运转至肝脏和脾脏等单核吞噬细胞系统(MPS)丰富的部位，少量被肺、骨髓及肾摄取；肝细胞膜受体对直接暴露于表面的磷脂负电基进行识别，因而脂质体首先被肝细胞吞噬。这些因素综合使传统脂质体的半衰期仅十几min。因此传统脂质体作为药物的载体还是存在着明显的缺陷。

    而多囊脂质体(Muhivesicular liposomes，MVL)是采用贮库泡沫技术(Depofoam technology，Depo-Foam)于1983年研制(英国Skyepharma PLC公司)成功的一种新型脂质体，主要用于运载亲水性药物。注射后，作为药物贮库随时间释放被包封的药物。由于以上特点以及粒子在显微镜下泡沫状的外观，MVL也被称为贮库泡沫药物传递系统。MVL注射途径广泛，可用于敏感部位的注射如眼部、硬膜外或关节腔等，人体研究表明安全性较高。另外，Depofoam技术经证明可以进行工业化大生产，具有良好的贮藏期稳定性。多囊脂质体的主要特点之一是缓释时间明显长于普通脂质体，如果能将亲水药物磺胺间甲氧嘧啶钠和亲脂药甲氧苄啶包裹在同一多囊脂质体中，将发挥良好的药理作用；目前还没有这方面的研究报道。

    【发明内容】

    本发明的目的旨在提供一种选材和操作简单的将亲水药物磺胺间甲氧嘧啶钠和亲脂性药物甲氧苄啶包裹在同一多囊脂质体中的制备方法。

    本发明另一目的旨在提供上述方法制备的复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体，其缓释时间长、亲水药物磺胺间甲氧嘧啶钠和亲脂性药物甲氧苄啶包裹在同一多囊脂质体中，包封率高、稳定性好，可作为兽药新剂型，为临床推广应用打下基础。

    本发明的复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体是由脂质：大豆卵磷脂、胆固醇和三酰甘油形成的多囊脂质体结构中同时包裹了亲水性药物磺胺间甲氧嘧啶钠和亲脂性药物甲氧苄啶；所述的多囊脂质体中小囊粒径范围10-40μm；合成所述多囊脂质体时，磺胺间甲氧嘧啶钠和甲氧苄啶总质量与脂质的总质量的添加比例为1∶4-1∶10，优选为1∶4；磺胺间甲氧嘧啶钠和甲氧苄啶的添加质量比为10∶3-4∶1，优选为4∶1；大豆卵磷脂与胆固醇的添加质量比为1-4∶1，优选为1∶1；三酰甘油的用量为8-16/mmol·L^-1，优选为16/mmol·L^-1。

    上述的复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体的制备方法，包括以下步骤：

    (1)按比例称取大豆卵磷酯、胆固醇、甲氧苄啶、三酰甘油溶解于10-15mL三氯甲烷中形成脂溶液；

    (2)将磺胺间甲氧嘧啶钠溶解于10-15mL超纯水中形成水溶液；

    (3)将脂溶液和水溶液混合，涡旋振荡1-10min，然后在超声波细胞破碎机上乳化2-12min形成形成W/O型初乳；

    (4)取W/O型初乳5-10mL，加入超纯水10-15mL，在涡旋混合仪上振荡1-10min，超声乳化2-5min；形成W/O/W型复乳；

    (5)取上述W/O/W型复乳于旋转蒸发器上挥发掉三氯甲烷，即得复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体。

    步骤(1)中还加入Vit-E溶解于三氯甲烷中。

    步骤(1)在25-30℃水浴中形成脂溶液。

    步骤(3)在乳化前保温2-5min。

    步骤(4)中加入超纯水后再加入Tween-80和Span-80，在涡旋混合仪上振荡。

    步骤(5)中旋转蒸发温度45-50℃，时间10-20min。

    多囊脂质体是一种新型的药物缓释制剂，与传统的脂质体相比，其具有包封率高、包封体积大、药物渗漏少等众多优点。相对传统脂质体，多囊脂质体的脂质成分中除了磷脂等两性磷脂外，尚需加入至少1种中性磷脂如三酰甘油，它们无成膜能力但能填充于脂质双分子层交汇处的疏水空间，稳定交叉处的连接，还能以小油滴形式分散在水相隔室中，使脂质体包封药物后具有不连续的药物溶液囊泡，因而具有更多的包封容积和更大的粒径。多囊脂质体脂质层的非同心结构会使脂质体的稳定性增加，且药物释放时间延长。在制备过程中影响复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体包封率的原因主要是复乳的破裂和聚合以及膜的致密性等，膜材的组成会影响膜的刚性，刚性不足，膜易破裂，得到不稳定的多囊脂质体。故本发明采用复乳法制备多囊脂质体，筛选了合适的膜材组成和乳化条件，使制备的多囊脂质体在普通光学显微镜下和投射电子显微镜下观察可见“大囊包小囊”的典型多囊脂质体结构，包封率高达86.2％。在制备脂质体的过程中除了在油相中加入膜稳定剂，如Vit-E外，在外水相中也加入辅助乳化剂(如Tween-80和Span-80)稳定复乳；反之则易聚合结块，得不到多囊脂质体。

    多囊脂质体的膜是随着有机溶剂的挥发在原油相部位形成的，制备温度及溶剂挥发速率直接影响多囊脂质体的形成。制备时温度太高或太低，除有机溶剂速度过快或过慢，都容易造成复乳在转化成多囊脂质体之前即已破裂，最终无法形成多囊脂质体。在制备过程中，最好始终保持相同的温度，避免介质的表面张力以及表面活性剂的HLB值随着温度的变化而发生变化，影响复乳的稳定性。本发明考察了不同温度条件下的成囊情况，最终选择始终控制温度为25-30℃，所得复乳较稳定，囊形状较好。

    采用复乳法法作为复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体制备方法，这也是目前制备多囊脂质体的唯一方法。乳化条件的控制是影响粒径的一个很重要的因素，第一次乳化和第二次乳化的强弱对多囊脂质体粒径的影响最为显著，第一次乳化采用大功率，乳化条件适当延长，第二次功率较小，乳化时间适当缩短，这样能增大多囊脂质体的粒径，反之亦然。根据这些条件，采取合适的乳化条件，来控制粒径。

    在制备的过程中影响复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体形成及包封率、含量的因素很多，其中主要因素是大豆磷脂-胆固醇的比例，若磷脂用量太多，胆固醇用量太少，则脂质体的稳定性差；反之，脂质体不易形成；其次是脂质体膜材-药物的比例，若膜材用量多，药物量少，虽然脂质体对药物的包封率高，但脂质体的含药量少，造成脂质体膜材的浪费。

    脂质体是磷脂等分散在水中形成的封闭囊泡，磷脂含有亲水和疏水基团，在水中闭合的过程本身能形成双分子层，根据这一原理，本发明采取两种药物，一种亲水性药物和一种亲脂性药物，使脂质体在形成的过程中，即能包裹亲水性药物和亲脂性药物。由于多囊脂质体主要用来包封亲水性药物，磺胺间甲氧嘧啶钠和甲氧苄啶在多囊脂质体的比例也将会是影响药效的一个重要因素。故该试验在设计的过程中，采用磺胺间甲氧嘧啶钠(亲水性)和甲氧苄啶(亲脂性)两种药物，并优选相差比较大的比例(4∶1)来制备复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体，取得了较好的效果。

    本发明制备得到的多囊脂质体多囊脂质体是由许多大小不一、形状不规则的小囊紧密堆积在一起形成的，小囊与小囊之间被脂质双层膜隔开。光学显微镜观察，可看到多囊脂质体呈球形，内部有许多小粒，类似蜂窝状的形成；一般情况下采用贮库泡沫技术研制的脂质体适合于包封水溶性药物。但本发明药物选择巧妙，在制备多囊脂质体时除了磷脂和胆固醇外，还使用了三酰甘油，三酰甘油不是均一地夹杂在脂质双层膜中，而是有一部分以一小油滴的形式分布散在多囊脂质体的内水相中；另一部分则填充在小囊与小囊之间的脂质膜交联部位的空隙中，起着连接、架桥、稳定内部小囊的作用。甲氧苄啶只含1％-2％，而且是脂溶性药物，刚好溶解在三酰甘油的小油滴形态中，并不干扰水溶性药物的包裹。因此，本发明利用了独有的既能运载亲水性药物，又能运载脂溶性药物的结构特点，克服了多囊脂质体只用做水溶性药物运载系统的缺陷；而将水溶性药物和脂溶性药物完美的组成多囊脂质体。

    本发明将不同溶解性药物按一定的配比填充于脂质体的亲水亲脂囊腔，这种特殊的包封方式，还提高了脂质体的包封容积，药物包封率最高达80％以上。弥补以往的脂溶性药物包封少会影响临床药效的缺陷；而且其制备工艺简单，制备的多囊脂质体性质稳定，在体内具有用药量极低、无免疫原性、可降解、缓释等重要特点，减少所需药量，增强其体内稳定性和药理作用，降低毒副作用(脂质体中磺胺间甲氧嘧啶钠含量极低、但疗效显著；大豆磷酯为大豆提取物，无毒)、使药物具有被动靶向性特征，还可制成免疫脂质体实现主动靶向性。克服了由卵磷脂(PC)和胆固醇(Cho1)等组成的传统脂质体的热力学不稳定体系的缺点，大豆磷酯比卵磷脂和胆固醇的热稳定性要高。

    本发明药物具有高效、长效和低残留等特点。本发明的高效性主要体现在水溶性药物磺胺间甲氧嘧啶钠与脂溶性药物甲氧苄啶按适合的比例包裹在同一多囊脂质体中形成一个整体，充分发挥了药物的组合效应，比单纯用药的疗效大大增强，使磺胺间甲氧嘧啶钠的抗菌作用增强疗效几倍、甚至几十倍。其长效性主要体现在本发明形成的新型多囊脂质体是一个药物贮库，随时间缓慢释放被包封的药物，也就是药物缓释时间明显长于普通脂质体(多囊脂质体的最大特点就是长效，他像很多的小的脂质体粘在一起，外面的破裂后里面的还是小的完整的脂质体，一直消融到最后还是完整的小的脂质体，他的结构就像泡沫一样，把泡沫掰开，里面都是小的完整的颗粒，)其低残留主要体现在本发明形成的多囊脂质体中磺胺间甲氧嘧啶钠和甲氧苄啶的含药量极低，总用药量只有正常用量的1/10-1/100。

    本发明的复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体可制成注射剂或口服制剂。

    【附图说明】

    图1为本发明的多囊脂质体的结构形态；

    图2为本发明多囊脂质体的药动学研究中空白血浆色谱图；

    图3为本发明多囊脂质体的药动学研究中磺胺间甲氧嘧啶钠溶液色谱图；

    图4为本发明多囊脂质体的药动学研究中血浆提取后磺胺间甲氧嘧啶钠色谱图；

    图5为本发明多囊脂质体的药动学研究中血浆提取后复方磺胺间甲氧嘧啶钠色谱图；

    图6为本发明多囊脂质体的药动学研究中肌肉注射复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体平均药-时曲线。

    【具体实施方式】

    从图1能看到很多小的囊体聚集，像泡沫一样紧紧的堆积在一起，累计成多囊脂质体。

    以下实施方式旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

    按以下步骤制备得到了本发明的多囊脂质体。

    (1)按比例称取大豆卵磷酯、胆固醇、甲氧苄啶、三酰甘油，Vit-E溶解于10-15mL三氯甲烷中，25-30℃水浴中形成脂溶液；

    (2)将磺胺间甲氧嘧啶钠溶解于10-15mL超纯水中形成水溶液；

    (3)将脂溶液和水溶液混合，涡旋振荡1-10min，25-30℃水浴保温2-5min；然后在超声波细胞破碎机上乳化2-12min形成形成W/O型初乳；

    (4)取W/O型初乳5-10mL，加入超纯水10-15mL，再加Tween-80Span-80；在涡旋混合仪上振荡，超声乳化2-5min；形成W/O/W型复乳；

    (5)取上述W/O/W型复乳于旋转蒸发器上挥发掉三氯甲烷，旋转蒸发温度45-50℃，时间10-20min；即得复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体。

    正交设计优化复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体处方和制备工艺

    按照上述步骤，本实验使用四因素四水平的正交设计筛选脂质体制备的最优条件，即以药脂比(质量比，其中磺胺间甲氧嘧啶钠和甲氧苄啶的质量比为4∶1)、磷脂和胆固醇比(质量比)、油相中三酰甘油的用量、两次乳化时间比4个因素，每个因素取3个水平，以包封率作为指标，优化最佳工艺配方。主要的影响因素和水平见表1。

    表1  正交设计实验因素和水平表

    

    根据已确定的四因素四水平，按[L₉(3⁴)]正交设计配制9份样品，以包封率为考察指标进行正交试验，结果详见表2。由[L₉(3⁴)]正交设计可见，4个因素中对复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体包封率的影响顺序为D＞B＞C＞A，得出优化处方为A₁B₁C₃D₃。即m(药物)∶m(脂质)＝1∶4；m(磷脂)∶m(胆固醇)＝1∶1；三酰甘油的用量为16/mmol·L^-1；第一次乳化时间和第二次乳化时间比为4∶1(12min∶3min)。

    表2  正交设计实验结果

    

    注：X₁、X₂、X₃分别为各因素不同水平3次实验的平均包封率；R为各因素不同水平极差。

    依据数学模型优化所得最优处方制备样品3批，结果表明3批样品包封率基本一致，分别为86.2％，85.1％，83.7％，平均包封率为85％，说明该制备工艺重现性好。

    本发明的复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体的毒性研究

    在临床应用中，磺胺间甲氧嘧啶钠作为磺胺类药物中的强效抑菌剂，其抗菌谱广，运用广泛，但同时也表现出较强的局部刺激性和肝、肾等器官毒性及神经肌肉阻滞等毒副作用，脂质体适合体内降解，无毒性和免疫原性，脂质体作为药物载体可以提高药物的治疗指数，降低药物毒性，减少药物副作用，并具有能延长有效血药浓度时间，减少药物用量等优点。本实验从复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体的急性毒性试验、亚慢性毒性试验入手，考察了该制剂的安全性，为保证临床用药安全提供依据。

    使本发明的复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体质量浓度为22.5mg/mL，备用。

    试验动物

    SPF级昆明小鼠60只，♀各半，18～24g/只，购于湖南农业大学动物医学院小动物实验室。室温控制在18～22℃，相对湿度40～70％，保持室内通风良好，雌雄分笼饲养，笼底垫料为创木花屑，经日光晒后使用，隔日清扫鼠笼一次，更换垫料并消毒鼠笼，饲料为湖南农业大学动物医学院小动物实验室提供的全价营养固体颗粒鼠饲料，其中含蛋白质约21％，自由采食，自由饮水，动物饲养7d观察后，确定为健康动物，方可进行试验。

    方法

    1)急性毒性试验

    在预试验中，发现复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体以极限容量1mL/只腹腔注射后，小鼠无死亡，不能进行LD50值的测定，因此进行最大耐受量实验。在多次预试验基础上，取小白鼠20只，雌雄各半，随机分为两组，一组注射复方磺胺间甲氧嘧啶钠注射液，剂量为837.52mg/kg.bw^[83]，腹腔注射0.5mL，另一组按1700mg/kg.bw(相当于复方磺胺间甲氧嘧啶钠临床用药量的85倍，)给小白鼠腹腔注射复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体，分3次在24小时内给药完毕(受制备方法的影响，无法得到高浓度的复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体，所以分多次给药以达到所需剂量)。给药后，观察并记录7天内动物外观体征、饮食欲、行为活动、大小便、中枢神经系统症状及死亡动物数。如有动物死亡，及时尸检，观察脏器变化，分析小鼠死亡原因，如有病变组织则进行切片镜检。

    2)亚慢性毒性试验

    根据半数致死量法并结合拟用临床剂量法进行剂量设计，设高、中、低3个剂量组和1个阴性对照组，高剂量组为300mg/kg.bw(为临床用药量的15倍)、中剂量组为100mg/kg.bw(为临床用药量的5倍)、低剂量组为50mg/kg.bw(为临床用药量的2.5倍)。取小白鼠80只，雌、雄各半，随机分为4组，每组20只(雌雄各半)，雌雄分笼饲喂。将复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体用灭菌生理盐水稀释适当倍数，每鼠隔天于固定时间腹腔注射药物0.5mL，每隔三天称一次体重，根据体重变化调整药物的稀释倍数，对照组同样每天于固定时间腹腔注射生理盐水0.5mL，连续4w，观察临床反应。4w于停药24小时内对各组小鼠进行体重、血液学检测，并取各组1/2小鼠断头处死，进行脏器系数测定、组织学检查和血液生化学检测，余下小鼠停药继续饲喂2w时间，观察并记录停止给药后2w时间内的动物死亡情况及体重的变化。

    观察指标

    (1)一般生理性状观察

    每天观察并记录各组小鼠的外观、活动、摄食、饮水、被毛、鼻、口腔、肛门等天然孔以及大小便等体征，如有动物死亡，及时尸检，肉眼观察后，如有病变组织则进行切片镜检，分析死亡原因。

    (2)生长发育指标

    隔天称一次体重，记录数据，分别在给药4w恢复期(2w后)计算小鼠增重情况。

    (3)外周血液学指标

    给药4w后尾静脉采血，血样用肝素钠抗凝后，按常规检验方法进行血红蛋白(HB)，红细胞(RBC)，白细胞(WBC)计数及分类。血常规检查项目及方法分别为：血红蛋白测定用碱化血红蛋白光电比色法；红细胞和白细胞计数采用目视计数法；白细胞分类计数采用显微镜分类计数法。

    (4)血液生化学检测

    给药4w后断头处死动物并采血，2～3只小鼠血液合并成一个血样，常规制备血清，测定碱性磷酸酶(ALP)，谷草转氨酶(AST)，谷丙转氨酶(ALT)，总蛋白(TP)，白蛋白(ALB)，尿素氮(BUN)，肌酐(Cre)等指标。试剂盒由中生北控生物科技股份有限公司提供，按试剂盒说明操作，在半自动血清生化分析仪(MD-110美国产)上测定。

    (5)系统尸检及脏器系数测定

    给药4w后各组随机取采血处死的5只小鼠解剖，观察心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、胃、小肠等器官大小、形态、色泽、质感。取心、肝、脾、肺、肾等重要脏器进行脏器系数测定，脏器系数＝(器官湿重/体重)×100％。

    (6)病理组织学检查

    将心、肝、脾、肺、肾用生理盐水清洗干净后，用10％福尔马林固定三天，石蜡包埋，切片经HE染色，在光学显微镜下进行组织学检查。

    统计处理

    将试验所得数据整理成表，判断各数据是否在正常范围，计算均值和标准差，用t检验测定各服药组均数和对照组均数的差异显著性。

    结果

    1、急性毒性试验结果

    以837.52mg/kg.wb剂量注射复方磺胺间甲氧嘧啶钠注射液的小鼠，有6只小鼠立即出现精神委靡，躁动不安，站立不稳，被毛逆立，腹部着地不起，肌肉震颤直至抽搐，7d内小鼠死亡5只。以1700mg/kg.wb剂量注射复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体的小鼠在给药后7d内，未见有小鼠死亡，但有20％以上的小鼠在最后一次注射后，产生行走减少、嗜睡的症状，两小时后恢复正常。可知复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体对小鼠的最大耐受量大于1700mg/kg.wb，此量相当于临床用量的85倍。结果表明复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体的毒性显著低于复方磺胺间甲氧嘧啶钠。

    2、亚慢性毒性试验结果

    1)体重与摄食量变化

    小鼠体重称重结果见表3由试验结果可知，摄食量的变化同体重增长变化一致。经方差分析，各试验组体重增长值与对照组相比无显著性差异(P＞0.05)，说明各试药组在本试验条件下对小鼠的生长无明显影响。

    表3  小鼠体重称定结果表

    

    2)血液学检查

    小鼠血液学指标的检测结果见表4.结果显示各项数值均在正常范围之内波动，各剂量组与对照组比较无显著性差异(P＞0.05)，未见因药物引起的异常。

    表4  小鼠血液学指标结果

    

    3)血清生化学检测

    小鼠血清生化指标的检测结果见表5.各试验组对小鼠血清生化指标的影响试验结果表明：各剂量组小鼠血清中总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)与对照组相比无显著性的差异(P＞0.05)，血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)，天门冬氨酸氨基转移酶(AST)，尿素氮(BUN)，总胆固醇(TCHO)，碱性磷酸酶(ALP)等指标与对照组相比也均无显著影响。停药2周后，与给药4W后各项指标相比没有统计意义上的差异(P＞0.05)。说明各试药组在本试验条件下对小鼠的血液学生化指标无明显影响。

    表5  小鼠血清生化指标结果表

    

    

    4)脏器系数检查

    小鼠重要脏器的脏器系数见表6，由结果可知，在小鼠给药4W后，与对照组相比各试药组脑、心、肝、脾、肺、肾主要脏器系数均无显著差异(P＞0.05)，均未见异常。

    表6  小鼠脏器系数结果表

    

    5)剖检检查结果

    肉眼观察各试药组小鼠脑、心、肝、脾、肾等器官，与对照组比较，各脏器大小、形态、色泽质感均无明显的异常发现。

    将脑、心、肝、脾、肾等重要脏器固定，包埋后切片，切片经HE染色，在光学显微镜下进行组织学检查，各组小白鼠脏器组织结构基本正常、细胞染色均匀。

    (1)心

    各组均无充血，坏死和炎症变化。心外膜光滑，无出血点，心肌厚度及色泽未见异常，未见心肌细胞结构坏死或疤痕，心瓣膜厚度正常，心内膜光滑，冠状动脉未见狭窄或硬化。

    (2)肝

    各组未见肝细胞变性、坏死、炎症、硬化、癌瘤等病理变化，肝脏表面光滑润泽，肝小叶结构清晰，门静脉区无变化，未见主要静脉扩张。

    (3)脾

    各组硬度色泽均正常，切面轮廓整齐清晰，未见异常变化。

    (4)肺

    肺脏大小、硬度、色泽均无异常，切面轮廓整齐清晰，各组均未见水肿、出血、炎性变化，未见肺褐色硬变，未见支气管、血管异常变化。

    (5)肾

    二肾大小、硬度、色泽均无异常，切面光滑，未见包膜粘连，切面皮、髓质交界清晰，皮层条纹清晰，输尿管内未见结石，肾动脉壁未见异常。各组均未见变性、坏死、炎症、萎缩、纤维化等病变。

    以上剖检及病理组织学检查表明，各器官没有表现与药物作用相关的病理变化，说明复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体组小鼠主要脏器无病理损害。

    结论：

    1、由于复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体的毒性很低，以及制备方法的限制不能得到高浓度的脂质体，无法求出其LD₅₀，目前对腹腔注射给药的最大容量也无明确规定，所以急性毒性试验只粗略地进行了最大耐受量试验，比较了复方磺胺间甲氧嘧啶钠与复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体的急性毒性，复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体对小鼠的最大耐受量大于1700mg，此量相当于临床用量的85倍。结果表明复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体的毒性显著低于复方磺胺间甲氧嘧啶钠，同时也说明脂质体确有降低药物毒性的作用，相对与传统制剂来说安全范围更大。

    2、复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体的亚慢性毒性试验中，对心、肝、脾、肺、肾等重要器官进行剖检及病理组织学镜检，结果表明，复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体各剂量组与生理盐水对照组相比，上述各器官和组织形态学正常，无组织学病变，说明复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体各剂量组对小鼠的组织和器官无明显损害作用。给药4w后，对各组小鼠心、肝、脾、肺、肾等重要器官的脏器系数进行测定，结果表明，复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体各剂量组与生理盐水对照组相比无显著性差异，说明复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体对小鼠重要脏器的生长发育无明显影响。

    复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体的亚慢性毒性试验中，检查了小鼠血清生化指标，包括血红蛋白、红细胞计数、白细胞计数、总蛋白、白蛋白、ALT、AST、ALP、BUN。血红蛋白、红细胞计数、白细胞计数主要反映小鼠的一般生理状况，结果表明，高、中、低剂量组与生理盐水对照组相比均无显著差异，说明复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体脂质体对小鼠的一般生理状况无明显影响；总蛋白、白蛋白、ALT、AST、ALP主要反映小鼠肝功能，结果表明，高、中、低剂量组与生理盐水对照组相比均无显著差异，说明复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体对小鼠的肝功能无明显影响；BUN主要反映小鼠肾功能状况，结果表明，高、中、低剂量组与生理盐水对照组相比均无显著差异，说明复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体对小鼠的肾功能状况无影响。以上结果均表明，复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体对小鼠无蓄积毒性作用，说明本制剂在治疗剂量范围内安全可靠。复方磺胺间甲氧嘧啶钠具有较强的肝、肾毒性，将该药物包封于脂质体中后，由于脂质体具有能在疾病靶区浓集的作用，药物也从给药部位转送到靶区，在靶区浓集，在其它脏器和组织分布较少，浓度很低，因而能大大降低其对机体特别是肝、肾毒性。复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体能降低药物毒性的另一重要原因可能在于脂质体颗粒较大，难以进入肾皮层，因而能显著降低对肾脏的损害。

    复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体在家兔体内的药动学研究

    据资料介绍，脂质体剂型通过各种途径进入体循环后，大部分选择性地分布于富有吞噬细胞的网状内皮组织系统，导致某些部位特别是肝、脾对包裹药物的滞留量增加，较少进入骨骼、心肌和神经组织，因此，脂质体剂型能显著改变药物的动力学性质和组织分布。目前磺胺间甲氧嘧啶钠普通注射剂，具有半衰期较短，对感染部位靶向性差等缺点。将磺胺间甲氧嘧啶钠制备成多囊脂质体后，能增加感染部位的靶向性，降低毒副作用，大大延长有效血药浓度时间。本实验将复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体给家兔肌肉注射，采用HPLC法测定了96h内不同时间点的血浆中药物浓度，研究了复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体的经时变化过程，重点讨论了磺胺间甲氧嘧啶钠的一些参数。

    供试动物与药物

    健康家兔6只，雌雄各半，体重1.6～2.2kg，购自湖南医科大学实验动物部。常规饲养，自由采食。观察一周，临床表现健康。

    使本发明复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体质量浓度为20mg/mL，备用。

    1、血浆样品处理

    取家兔血浆样品0.5mL于10mL具塞离心管中，分别加入适量的磺胺间甲氧嘧啶钠对照品，混匀，加入醋酸乙酯3mL提取，漩涡混合器上混合3min，以3000r/min离心，分离醋酸乙酯层于另一试管中，然后再加醋酸乙酯重提1次。中和2次提取的醋酸乙酯混合液，在通风橱内，40℃水浴，N₂气吹干。再加3mL醋酸乙酯冲洗管壁，继续水浴吹干，残留物用100μL流动相溶解，分别取20μL进样。

    2、血浆标准曲线的建立

    精密量取5份空白血浆各0.5mL，分别置于5只10mL具塞离心管中，各加入不同量的磺胺间甲氧嘧啶钠溶液，使血浆中的磺胺间甲氧嘧啶钠浓度分别为0.05、0.25、1、5、10ug/mL的溶液。

    3、动物给药及血样采集

    取健康家兔6只，分别于给药前采取空白对照血样4mL左右，置于含肝素钠的离心管中，用自制的复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体按照20mg/kg腿部肌肉给药，分别于0h、1h、6h、12h、18h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h采血。每次采血2mL左右，所有血样均置于含肝素钠的离心管中，混匀。血样在2000转下离心15min，分离血浆，-20℃冰箱保存，待测。

    4、血药浓度测定

    离心后精密量取0.5mL血浆，处理后，测定血浆中血药浓度。

    5、数据处理

    中国药理学会编制的3P97药动学软件拟合，求算药动学参数。

    结果

    1、色谱图

    空白血清、磺胺间甲氧嘧啶钠溶液、磺胺间甲氧嘧啶钠血清样品、复方磺胺间甲氧嘧啶钠血清样品的色谱图如图2～图5所示，结果表明，在本试验所采用的条件下，复方磺胺间甲氧嘧啶钠的色谱峰分离效果良好，空白血清及其他杂质峰对其无影响，保留时间分别为6.51 1min。

    2、线性相关性

    SMM在0.05～10μg/mL浓度范围内，峰面积(A)与药物浓度(C)线性关系良好，标准曲线方程：y＝20508x+235.32(r：0.9999)，其中x为所测血药浓度ug/mL，y为SMM钠的峰面积。

    3、药物代谢动力学参数测定

    静注复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体后，家兔各取样点的血药质量浓度见表7，静注复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体组的平均药-时曲线见图6，血药浓度数据经3P97程序拟合后符合静脉注射一室开放模型，主要药动学参数见表8。从表中可知，在给药96h后仍可检测出药物，说明复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体血药浓度维持时间在96h以上，极具长效作用。

    表7  复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体在家兔体内不同时间血药浓度(μg/mL)

    

    表8  复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体在家兔体内代谢动力学参数

    

    结论

    多囊脂质体的粒径一般为5～50μm，普通的单室，多室脂质体一般粒径为0.1～5μm，多囊脂质体的粒径较普通脂质体大一到两个数量级，不适合静脉注射，所以在药物代谢学试验中采用肌肉注射，血液采集由于时间间隔比较长，没采用药物代谢动力学常用的颈总动脉插管方法，用家兔耳静脉采血，收效良好。

    单室，多室脂质体具有相同的同心圆结构，多囊脂质体没有相同的同心圆，其内部有许多大小不一，形状很不规则的小囊，这些小囊是紧密的堆积在一起的，小囊与小囊之间倍脂质双层膜隔开，其内部结构与泡沫很相像，这是其商品名叫DepoFoam的原因。这种结构赋予了脂质膜较强的机械强度，使其稳定性优于普通脂质体，多囊脂质体能实现药物的缓控释的原因，也就在于它具有这种独特的结构。经过试验验证：复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体缓释效果明显，在96h仍有药物均匀释放，这证明了多囊脂质体能比普通制剂，普通单室，多室脂质体更多的延长药物释放时间。

    本次实验中血样采集后，将部分样品用3层保鲜膜包封保存于4℃冰箱中24h后测定，其结果比立即离心分离测定，药物浓度平均降低约10％，保存48 h后测定，药物浓度降低约17％，提示在冷藏保存过程中，药物有沉降的趋势。因此，条件允许时，应尽量及时处理样品。如果因样品数量多无法及时处理，应及时分离血浆-20℃冻存待测。

    据资料报道，磺胺间甲氧嘧啶钠注射给药符合二室动力学模型；口服给药符合一室动力学模型。复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体肌肉注射后的药-时曲线为一室模型，反应了药物经脂质体包封后，药物在动物体内的代谢动力学发生了明显改变。另据资料报道，脂质体的组成、粒径、电荷、给药途径、剂量及给药频率均影响药物的体内动力学。

    多囊脂质体由于其独特的结构，可知其释放应是一个缓慢匀速的过程，家兔药物代谢动力学研究表明，在一小时内有突释现象，原因可能与多囊脂质体混悬液中含有一些游离的药物或者脂质碎片中含有一些药物所致，所以在应用多囊脂质体混悬液时需离心将上清液出去游离药物。

    复方磺胺间甲氧嘧啶钠多囊脂质体在家兔体内的生物半衰期t_1/2为51.5h，药-时曲线下面积AUC为1049.70h.mg/L，表观分布容积为1536.53mL/kg，清除率为19.05mL/d，在给药96h后仍有一定浓度的药物出现。另据文献报道，磺胺间甲氧嘧啶钠在家兔体内的生物半衰期t_1/2为2.94h，药-时曲线下面积AUC为537.7h.μg/mL，这表明复方磺胺间甲氧嘧啶钠脂质体包封后，其药代动力学及组织分布发生了明显变化，药物代谢速度大大减慢，有效血药浓度时间延长，提高疗效。