一株具提高大豆对除草剂抗性的寡养单胞菌及其制备方法和应用.pdf

本发明涉及一株处理大豆种子后具诱导大豆产生对阿特拉津抗性的嗜麦芽寡养单胞菌Stenotrophomonas maltophilia Sneb 42及其制备方法和应用，属于微生物农药技术领域。本发明涉及的细菌菌株Sneb 42，已于2010年2月1日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.3620。通过液体发酵培养制备，其代谢物处理大豆种子后，大豆种子萌发出苗时可以产生对阿特拉津的抗性。通过该细菌的代谢产物处理后的大豆可以与玉米等禾本科作物混种，采用统一阿特拉津除草剂除草，解决了玉米与大豆间套作的除草难题，具良好的应用开发前景。

1.  处理大豆种子后具有诱导大豆产生抗阿特拉津抗性的细菌菌株，其特征在于：该菌株为嗜麦芽寡养单胞菌Stenotrophomonas maltophilia Sneb 42，已于2010年2月1日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.3620。

2.  具有诱导大豆产生抗阿特拉津抗性的细菌代谢物，其特征在于，是由权利要求1所述的细菌菌株经过液体发酵后形成的发酵液制备的，液体发酵培养基配方为：以重量百分比计，含有牛肉浸膏0.2％-0.4％、蛋白胨1％-2％、酵母浸膏0.1％-0.5％、蔗糖1％-2％、余下为蒸馏水，pH为7-8。

3.  权利要求1所述的细菌菌株的液体发酵方法，其特征在于：液体发酵培养基配方为：以重量百分比计，含有牛肉浸膏0.2％-0.4％、蛋白胨1％-2％、酵母浸膏0.1％-0.5％、蔗糖1％-2％、余下为蒸馏水，pH为7-8，发酵温度为25-28℃，摇床转速150r·min^-1～200r·min^-1、发酵时间45-50h。

4.  根据权利要求3所述的液体发酵方法，其特征在于：所述的发酵时间为48h.

5.  具有诱导大豆产生抗阿特拉津抗性的细菌代谢物的制备方法，其特征在于：是由权利要求1所述的细菌菌株经过液体发酵后形成的发酵液制备的，液体发酵培养基配方为：以重量百分比计，含有牛肉浸膏0.2％-0.4％、蛋白胨1％-2％、酵母浸膏0.1％-0.5％、蔗糖1％-2％、余下为蒸馏水，pH为7-8，发酵温度为25-28℃，摇床转速150r·min^-1～200r·min^-1、发酵时间45-50h。

6.  根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述的发酵时间为48h.

7.  一种用于发酵权利要求1所述的细菌菌株的培养基，其特征在于：发酵培养基配方为：以重量百分比计，含有牛肉浸膏0.2％-0.4％、蛋白胨1％-2％、酵母浸膏0.1％-0.5％、蔗糖1％-2％、余下为蒸馏水。

8.  权利要求7所述的培养基，其特征在于：培养基的pH为7-8。

9.  一种大豆种子处理剂，其特征在于，包含有效量的权利要求1所述的细菌菌株或权利要求2所述的细菌代谢物作为活性成分，用于诱导大豆产生对大豆敏感的除草剂阿特拉津的抗性。

10.  权利要求1所述的细菌菌株或权利要求2所述的细菌代谢物在诱导大豆抗阿特拉津除草剂中的应用。

一株具提高大豆对除草剂抗性的寡养单胞菌及其制备方法和应用
技术领域：
本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一株处理大豆种子后可提高大豆对大豆敏感除草剂产生抗性的寡养单胞菌及其制备方法和应用。
背景技术：
我国是大豆的故乡，全国大豆种植面积达8000万亩以上，每年大豆产量达1600多万吨。随着农村土地流转和耕作规模扩大以后，人工除草越来越受到限制，但目前大豆田的化学除草剂对玉米的药害比较大，而玉米田的除草剂对大豆的药害也比较大，导致玉米和大豆的间作难以实现。因此，如果对大豆种子进行微生物处理后可以使大豆抵抗对大豆敏感的玉米田除草剂，就可以解决大豆和玉米混种问题，同时，可以解决玉米前茬使用玉米田除草剂对后茬种植大豆的药害问题。
除草剂阿特拉津(Atrazine)又名莠去津，全称为2-氯-乙胺-6-异丙胺-1，3，5-三嗪，是一种广泛使用于玉米田的除草剂。阿特拉津是选择性内吸传导型苗前、苗后除草剂，用于玉米、高粱、甘蔗、果树、林地等，可防除一年生禾本科杂草和阔叶杂草，对某些多年牛杂草也有一定的抑制作用。目前，阿特拉津在世界各地得到了大面积的使用。在美国，阿特拉津被列为使用最广泛的除草剂之一。在1980-1990年间，每年喷洒阿特拉津达8000万磅，1986年，瑞典全国施用了120t的阿特拉津。
20世纪60年代以来，许多国家均致力于寻找高效降解阿特拉津的微生物。到目前为止，已分离出能彻底降解阿特拉津的单菌株。阿特拉津生物降解机理的研究也获得了迅速发展。近两年来，国内也开始了阿特拉津生物降解的研究报道，但缺乏利用微生物的诱导使敏感农作物产生对阿特拉津的抗性研究。
由于阿特拉津具有难降解和在土壤中持留期长的特点，容易影响后茬敏感作物正常生长，尤其对豆科作物危害更大。因此，阿特拉津的环境问题得到了广泛的关注。为了消除阿特拉津在农田环境中的残留对后茬豆科作物的影响，本研究分离、筛选可以诱导大豆产生抗阿特拉津的菌株，通过此种方法使大豆生长不受阿特拉津残留或阿特拉津的影响，为豆科作物抗均三氮苯类除草剂的研究提供基础。
发明内容：
本发明的目的是选择一株菌株处理大豆种子可以使大豆产生对其敏感除草剂产生抗性，将菌株按常规液体发酵培养后，该菌体活体或代谢产物可以形成生物农药用于处理大豆种子，使大豆产生对阿特拉津的抗性。
本发明筛选到的一株处理大豆种子可以使大豆产生对除草剂莠去津(阿特拉津)产生抗性的细菌菌株是Sneb 42，其分类学命名为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)Sneb 42，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏日期：2010年2月1日；保藏登记入册的编号：CGMCC No.3620。嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)Sneb 42该菌株是段玉玺于2006年5月从中国辽宁省沈阳市沈河区沈阳农业大学试验地土壤细菌菌株中筛选出的一个细菌菌株。
本发明通过研究发现，获得的这株土壤细菌及其液体发酵产物处理大豆种子后可专一使大豆产生对大豆敏感除草剂阿特拉津产生抗性。
本发明的细菌菌株嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)Sneb 42是通过试管种培养后，再经扩大发酵培养来制备，其具体方法如下：
1.试管种培养
培养基配方为牛肉膏蛋白胨(NA)培养基，即成分：牛肉浸膏3g，蛋白胨10g，酵母浸膏1g，蔗糖10g，琼脂20g，加水至1000mL。
2.液体发酵培养
其中液体发酵培养基配方为：以重量百分比计，含有牛肉浸膏0.2％-0.4％、蛋白胨1％-2％、酵母浸膏0.1％-0.5％、蔗糖1％-2％、余下为蒸馏水，pH为7-8。
将试管种接种到250mL三角瓶(每瓶装100mL)液体培养基中，25℃～28℃下，摇床转速以150r·min^-1～200r·min^-1、发酵45-50小时，优选48h。
液体发酵的菌种可以通过大型发酵罐进行规模生产，其产品为发酵液或发酵液的制成品。
本发明涉及一种大豆种子处理剂，其包含有效量的本发明所述的嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)Sneb 42本身或其代谢物作为有效活性成分。
本发明的目的在于提供一种大豆种子处理剂，其特征在于，包含有效量的本申请的细菌菌株嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)Sneb 42或其细菌代谢物作为活性成分，用于诱导大豆产生对大豆敏感的除草剂阿特拉津的抗性。
本发明的细菌菌株嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)Sneb 42或其代谢物具有诱导大豆产生对大豆敏感除草剂阿特拉津产生抗性的能力，可用于大豆种子处理。
具体实施方式：
为了更详细地进一步阐明而不是为了限制本发明，给出了下列实施例。
实施例1：嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)Sneb 42的获得
取大豆田的土壤1g，加入无菌水100ml，取200μl，加入冷却至35℃以下的灭菌的20ml NA液体培养基，25℃下培养待菌落长出后，根据菌落色泽和边缘状态，挑取嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)菌落单独保存，进行扩繁和生理生化测定，培养性状符合嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)特征的保存备用。
实施例2：嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)Sneb 42的培养
首先对嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)Sneb 42菌株进行发酵培养，然后对发酵培养后的代谢产物进行大豆诱导活性试验，确定其对大豆的诱导作用。
将嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)Sneb 42的菌体接种到试管琼脂培养基上，培养基配方为NA培养基，即成分：牛肉浸膏3g，蛋白胨10g，酵母浸膏1g，蔗糖10g，琼脂20g，加水至1000mL。25℃培养10d，获得试管种。
再将试管种接种到250mL三角瓶(每瓶装100mL)液体培养基中，培养基配方为：以重量百分比计，含有牛肉浸膏0.2％、蛋白胨1％、酵母浸膏0.5％、蔗糖1％、余下为蒸馏水，pH为8。在25℃下培养，摇床转速以180r·min^-1、发酵48h，形成的发酵液或发酵液的制成品可以直接或间接处理大豆种子。被处理的大豆种子可以种植在喷施莠去津除草剂的土壤中，大豆出苗时可以抵抗阿特拉津(莠去津)的药害。
实施例3：嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)Sneb 42的发酵
基本同实施例一，不同之处是将液体培养的菌种接种到1000L的发酵罐进行发酵，在25℃下培养，pH为8，发酵48h。
实施例4：嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)Sneb 42的发酵
基本同实施例一，不同之处是液体培养基配方，其配方为：
以重量百分比计，含有牛肉浸膏0.3％、蛋白胨1％、酵母浸膏0.1％、蔗糖2％、余下为蒸馏水，pH为7。
实施例5：嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)Sneb 42发酵产品的使用
将发酵液稀释为10⁸cfu/L，按1∶50的比例处理包衣大豆种子，晾干后，将处理过的大豆种子正常播种，按150g/667m²喷施阿特拉津(莠去津)，大豆可以正常出苗生长。