香石竹茎尖超低温保存及植株再生的方法 【技术领域】
本发明涉及一种植物种质资源保存的方法，尤其是香石竹茎尖玻璃化超低温保存的方法，属于植物细胞工程技术领域。
背景技术
香石竹(Dianthus caryophyllus)，又名康乃馨，为石竹科石竹属的多年生宿根性草本植物，是世界著名的鲜切花之一，也是云南省最主要的大宗出口花卉之一。
目前对香石竹种质资源的保存主要采用田间保存法和组织培养保存法，田间保存法易受病虫害的侵袭和恶劣环境的威胁，组织培养保存法因长期离体培养需多次继代，不可避免地引起某些遗传性状的改变。
超低温保存是植物种质保存的理想途径，自从1973年Nag和Street首次成功地用液氮超低温保存了胡萝卜悬浮细胞后，迄今进行超低温保存的植物材料已达两百余种。两步法和预冻法等多种超低温保存技术也逐步发展起来，但这些传统的超低温保存方法操作繁琐耗时，并且需要程序降温仪等设备，因此这些方法的普遍推广使用仍存在不少困难。
近年来，发展较快的玻璃化法超低温保存具有设备要求简单、材料处理步骤简便、效果和重演性好等优点，是目前较为理想的植物种质资源长期稳定的保存方法，尤其适合组培物和茎尖培养物的保存，已经成功应用于几十种植物的茎尖保存。
【发明内容】
为解决田间保存法易受病虫害的侵袭、组织培养保存法易引起某些遗传性状的改变及传统超低温保存方法操作繁琐耗时等问题，本发明提供一种香石竹茎尖超低温保存及植株再生的方法。
本发明通过下列技术方案实现：一种香石竹茎尖超低温保存及植株再生的方法，其特征在于经过下列步骤：
A.将香石竹组培苗茎段置于下列预培养基上：MS+0.3～0.5mol/L的蔗糖+体积百分比为5％的DMSO+7g/L的琼脂，在光照强度为：1500～2000lx，光照时间为：8～12小时/天，温度为：22～28℃条件下，培养1～3天；
B.取出A中预培养后的茎段，切取茎尖，放入下列装载液中：MS+2mol/L的甘油+0.4mol/L的蔗糖，装载30～40分钟；
C.将茎尖从装载液中转移到下列玻璃化液PVS2中：MS+0.4mol/L的蔗糖+体积百分比为30％的甘油+体积百分比为15％的乙二醇+体积百分比为15％的DMSO，于0℃脱水处理40～60分钟；
D.将C中的茎尖转移至与上述C相同的PVS2液中，于液氮中保存即可；
E.将茎尖从液氮中取出于38～42℃水浴中迅速化冻，用下列去装载溶液：MS+1.2mol/L的蔗糖，洗涤2-3次；
F.将洗涤后的茎尖接种在下列继代培养基上：MS+0.05～0.3mg/L的BA+0.05～0.5mg/L的NAA，在光照强度为：1500～2000lx，光照时间为：8～12小时/天，温度为：22～28℃的条件下，培养20～40天，至芽成活后，再转入上述相同的继代培养基上，在相同培养条件下，培养20～40天，即获得恢复生长的再生香石竹植株。
所述步骤A中香石竹组培苗是经过下列步骤获得：取香石竹1-2个芽的茎段，用体积浓度为70％酒精消毒30-60s，再用质量浓度为0.05％-0.2％的升汞消毒15-25min，无菌水冲洗3-4次，将茎段接种于下列诱导培养基上：MS+0.5～2.0mg/L的BA+0.1～0.5mol/L的NAA，在光照强度为：1500～2000lx，光照时间为：8～12小时/天，温度为：22-28℃条件下，培养20～30天，待芽成活后，转入上述诱导培养基上培养20～30天，再转入下列继代培养基上：MS+0.05～0.3mg/L的BA+0.05～0.5mg/L的NAA，在光照强度为：1500～2000lx，光照时间为：8～12小时/天，温度为：22-28℃条件下，培养20-40天，即获得香石竹无菌组培苗。
所述步骤A中香石竹组培苗的茎段长度为10～15mm。
所述步骤B中切取的茎尖长度为2～4mm。
所述步骤D的液氮保存时间，视香石竹植株的再生需要而具体确定，需要再生时，从液氮中取出茎尖，经过步骤E、F即可得到再生的香石竹植株。
本发明具有下列优点和效果：采用上述方案，可实现香石竹茎尖玻璃化超低温保存，不仅方法简单、程序简化，易于操作，保存效果好，而且保存后的香石竹恢复生长良好，再生率可达52.4％，遗传变异机率极小，是香石竹种质资源离体保存的有效途径。
【具体实施方式】
下面结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1、香石竹组培苗的获得
取香石竹两个芽的茎段，用体积浓度为70％的酒精消毒30s，再用质量浓度为0.2％的升汞消毒25min，无菌水冲洗3次，将茎段接种于下列诱导培养基上：MS+2.0mg/L的BA+0.5mol/L的NAA，在光照强度2000lx，光照时间12小时/天，温度为25℃，培养20天，待芽成活后，转入上述诱导培养基上培养20天后，再转入MS+0.3mg/LBA+0.5mg/LNAA继代培养基上培养30天即获得香石竹无菌组培苗。
实施例2、香石竹茎尖超低温保存及植株再生
A.切取实施例1的香石竹组培苗茎段10mm，置于下列预培养基上：MS+0.3mol/L的蔗糖+体积百分比为5％的DMSO+7g/L的琼脂，在光照强度为：1500lx，光照时间为：12小时/天，温度为：22℃条件下，培养3天；
B.取出A中预培养后的茎段，切取2mm长的茎尖，放入下列装载液中：MS+2mol/L的甘油+0.4mol/L的蔗糖，装载40分钟；
C.将茎尖从装载液中转移到下列玻璃化液PVS2中：MS+0.4mol/L的蔗糖+体积百分比为30％的甘油+体积百分比为15％的乙二醇+体积百分比为15％的DMSO，于0℃脱水处理40分钟；
D.将C中的茎尖转移至与上述C相同的PVS2液中，于液氮中保存即可；
E.将茎尖从液氮中取出于40℃水浴中迅速化冻，用下列去装载溶液：MS+1.2mol/L的蔗糖，洗涤2次；
F.将洗涤后的茎尖接种在下列继代培养基上：MS+0.05mg/L的BA+0.05mg/L的NAA，在光照强度为：1500lx，光照时间为：12小时/天，温度为：22℃的条件下，培养40天，至芽成活后，再转入上述相同的继代培养基上，在相同培养条件下，培养40天，即获得恢复生长的再生香石竹植株。
实施例3、香石竹茎尖超低温保存及植株再生
A.切取实施例1的香石竹组培苗茎段15mm，置于下列预培养基上：MS+0.5mol/L的蔗糖+体积百分比为5％的DMSO+7g/L的琼脂，在光照强度为：2000lx，光照时间为：8小时/天，温度为：28℃条件下，培养1天；
B.取出A中预培养后的茎段，切取4mm长的茎尖，放入下列装载液中：MS+2mol/L的甘油+0.4mol/L的蔗糖，装载30分钟；
C.将茎尖从装载液中转移到下列玻璃化液PVS2中：MS+0.4mol/L的蔗糖+体积百分比为30％的甘油+体积百分比为15％的乙二醇+体积百分比为15％的DMSO，于0℃脱水处理60分钟；
D.将C中的茎尖转移至与上述C相同的PVS2液中，于液氮中保存即可；
E.将茎尖从液氮中取出于38℃水浴中迅速化冻，用下列去装载溶液：MS+1.2mol/L的蔗糖，洗涤3次；
F.将洗涤后的茎尖接种在下列继代培养基上：MS+0.3mg/L的BA+0.5mg/L的NAA，在光照强度为：2000lx，光照时间为：8小时/天，温度为：28℃的条件下，培养20天，至芽成活后，再转入上述相同的继代培养基上，在相同培养条件下，培养20天，即获得恢复生长的再生香石竹植株。