抗紧密连接蛋白3单克隆抗体以及使用该抗体的癌症的治疗和诊断 【技术领域】
本发明涉及癌症的诊断和治疗方法、以及细胞增殖抑制和抗癌药。
背景技术
近年来，利用单克隆抗体的特征——高靶特异性和低副作用的特质，使用该抗体作为治疗药物的癌症治疗受到关注。作为治疗药物使用的抗体的主要抗肿瘤机理例如有以下的机理：通过抗体，从正常细胞中识别肿瘤细胞；
具有细胞毒作用的效应细胞与抗体的结合，该抗体与在肿瘤细胞上表达的抗原特异性结合；或形成与该抗体结合的补体复合物；
由效应细胞或补体发挥的对该肿瘤细胞的细胞毒活性。
以HER-2为靶的乳腺癌治疗抗体司徒曼布、以CD20为靶的非何杰金淋巴瘤治疗抗体利妥希玛可作为利用抗体治疗癌症的例子。但是，实际上显示临床有效性的抗体的数目目前仅有少数。因此，目前认为适合抗体治疗的对象癌症种类受到很大限定。对于现有的治疗药物几乎无法获得效果、因此几乎没有治疗选择方案的癌症，人们强烈希望开发副作用少、抗肿瘤效果高的抗体治疗药物，确立新的治疗方法。
紧密连接蛋白(claudin)3是属于紧密连接蛋白家族的蛋白质的一种，在紧密连接中存在，具有除去紧密连接中特征性的细胞间空隙的作用。紧密连接是指在动物等生物体组织中，将相邻的细胞膜结合的牢固的结构。紧密连接蛋白3是控制离子等小的溶质物质的细胞间透过性的结构蛋白。有报道称在卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌和结肠癌等多种癌症组织中的紧密连接蛋白3分子的表达升高(非专利文献1-6)。紧密连接蛋白3的表达分布可参照The Swedish Human Protein Atlas(HPA)的网站(http://www.proteinatlas.org/)。在妇科癌症中，在美国致死率最高的子宫癌中显示紧密连接蛋白3和紧密连接蛋白4的表达在化疗药物抗性的复发部位特别升高。紧密连接蛋白4与紧密连接蛋白3同样，是属于紧密连接蛋白家族的蛋白质的一种。目前有报道称：在人的染色体上存在包含紧密连接蛋白3或紧密连接蛋白4的24种紧密连接蛋白基因家族。
已知紧密连接蛋白3和紧密连接蛋白4均发挥产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)肠毒素(CPE)的毒素受体的功能。CPE与紧密连接蛋白3、紧密连接蛋白4结合之后，形成巨大复合物，由此在细胞膜上开孔，引发细胞坏死。对移植了表达紧密连接蛋白3、紧密连接蛋白4的人肿瘤细胞而制备的胆癌模型小鼠给予致死剂量以下(亚致死量)的CPE，则显示肿瘤体积减小、存活率提高的数据(非专利文献6-7)。虽然有人提出了CPE在人的临床应用的可能性，但是显示药效和致死毒性的给予量的差异的狭窄、或CPE本身对人的抗原性尚存疑问，因此实际上尚未达到临床应用阶段。
紧密连接蛋白3是具有四次跨膜区域的蛋白质，具有在细胞外露出2个肽环的结构。构成预想为胞外环的肽序列的多肽部分如下所示，仅有51个氨基酸残基(环1)和23个氨基酸残基(环2)。
胞外环1 胞外环2
[30-80] [137-159]
细胞膜＝[9-29]＝＝＝＝＝[81-101]＝＝＝＝＝＝＝[116-136]＝＝＝＝＝＝＝[160-180]＝＝
[NH2-1-8] [102-115] [181-219-COOH]
胞质的 胞质的 胞质的
除此之外，动物种之间的紧密连接蛋白家族的序列同一性高，因此在常规免疫方法中极难获得识别胞外区地抗体。并且，属于紧密连接蛋白家族的分子互相具有非常相似的结构，因此尚未确立获得特异性识别亚型的抗体的方法(非专利文献8)。
作为识别在细胞上表达的紧密连接蛋白3的抗体，仅有报道，即，对鸡免疫紧密连接蛋白3的部分肽，通过对该肽进行亲和纯化，获得多克隆抗体，然后进行分离(非专利文献3)。对与在细胞表面表达的天然分子型紧密连接蛋白-3结合的单克隆抗体进行分离、从而显示其抗肿瘤作用的例子目前尚未有报道。
非专利文献1：Soini(2005)Histopathology 46，551.
非专利文献2：Santin等人(2005)Br.J.Cancer 92，1561.
非专利文献3：Offner等人(2005)Cancer Immunol.Immunother.54，431.
非专利文献4：Long等人(2001)Cancer Res.61，7878.
非专利文献5：Rangel等人(2003)Clin.Cancer Res.9，2567.
非专利文献6：Kominsky等人(2004)Am.J.Path.164，1627.
非专利文献7：Santin等人(2005)Cancer Res.65，4334.
非专利文献8：Hoevel等人(2002)J.Cell.Physiol.191，60.
【发明内容】
本发明的课题在于提供抗紧密连接蛋白3抗体及其用途。更具体地说，其目的在于提供新型的抗紧密连接蛋白3抗体、或使用抗紧密连接蛋白3抗体治疗癌症的新方法、含有抗紧密连接蛋白3抗体的新型的细胞增殖抑制剂或抗癌药。
本发明人通过将编码紧密连接蛋白3多肽的DNA免疫小鼠，成功获得了抗紧密连接蛋白3抗体。并且本发明人对这样得到的抗体测定了与在细胞表面上表达的以下的属于紧密连接蛋白家族的分子的结合活性。
人紧密连接蛋白3蛋白、
小鼠紧密连接蛋白3蛋白、
人紧密连接蛋白1蛋白、
人紧密连接蛋白4蛋白、和
人紧密连接蛋白6蛋白。
结果确认，本发明的抗紧密连接蛋白3抗体具有下述结合活性的任意一种或全部：与人紧密连接蛋白3蛋白的高结合活性、与人和小鼠紧密连接蛋白3蛋白的高结合活性、以及与人紧密连接蛋白3蛋白和人紧密连接蛋白4蛋白的结合活性。
本发明人发现：获得的抗紧密连接蛋白3抗体包含以下抗体：与具有预想为胞外环的肽序列的合成肽实质性不显示结合活性、而与在细胞表面上表达的人紧密连接蛋白3蛋白特异性结合的抗体。
本发明人进一步发现：获得的抗紧密连接蛋白3抗体与内源性表达紧密连接蛋白3的人乳腺癌细胞株MCF7显示结合活性，了解到该抗体可用作原发性的或转移性的各种癌细胞的诊断。本发明人发现：通过使用抗紧密连接蛋白3抗体，可以诊断下述各种癌组织的任意一种或全部：表达紧密连接蛋白3蛋白的各种癌组织；表达紧密连接蛋白4蛋白的各种癌组织；以及共表达紧密连接蛋白3蛋白和紧密连接蛋白4蛋白的癌组织
本发明人进一步测定了抗紧密连接蛋白3抗体对于稳定表达人紧密连接蛋白3蛋白的DG44细胞和上述MCF7细胞的补体依赖性细胞毒活性(CDC)，发现本发明的抗紧密连接蛋白3抗体对于任何细胞均具有CDC活性。并且本发明人又测定了抗紧密连接蛋白3抗体对MCF7细胞的抗体依赖性细胞毒活性(ADCC)，发现本发明的抗紧密连接蛋白3抗体对MCF7细胞具有ADCC活性。
根据以上认识，本发明人发现：抗紧密连接蛋白3抗体对于原发性的或转移性的各种癌症的诊断、预防或治疗有效，从而完成了本发明。
本发明提供与紧密连接蛋白3蛋白结合的单克隆抗体。本发明还提供含有与紧密连接蛋白3蛋白结合的抗体作为有效成分的药物组合物。本发明又提供含有与紧密连接蛋白3蛋白结合的抗体作为有效成分的抗癌药。优选与紧密连接蛋白3蛋白结合的抗体是具有细胞毒活性的抗体。本发明的优选方案中，可作为治疗对象的癌症是卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌和结肠癌。特别优选乳腺癌。含有本发明的抗紧密连接蛋白3抗体的抗癌药对于上述紧密连接蛋白3表达亢进的、原发性或转移性的癌症的治疗有效。
或者，本发明提供含有与紧密连接蛋白3蛋白结合的抗体和可药用的载体的药物组合物。本发明的药物组合物对于紧密连接蛋白3表达亢进的癌症的治疗和预防的任意一方面或两者有效。即，本发明涉及与紧密连接蛋白3蛋白结合的抗体在用于癌症治疗和预防中的任意一方面或两者的药物组合物的制备中的应用。
在另外的方案中，本发明提供通过使紧密连接蛋白3表达细胞与同紧密连接蛋白3蛋白结合的抗体接触，对表达紧密连接蛋白3蛋白的细胞引发细胞毒的方法。本发明还提供通过使表达紧密连接蛋白3蛋白的细胞与同紧密连接蛋白3蛋白结合的抗体接触，抑制表达紧密连接蛋白3蛋白的细胞的增殖的方法。优选与紧密连接蛋白3蛋白结合的抗体是具有细胞毒活性的抗体。还优选表达紧密连接蛋白3蛋白的细胞为癌细胞。
在另一种方案中，本发明提供与紧密连接蛋白3蛋白结合、且对表达紧密连接蛋白3蛋白的细胞具有细胞毒活性的抗体。优选该细胞毒活性是ADCC活性。优选该细胞毒活性是CDC活性。本发明还提供结合了细胞毒性物质的抗体。本发明中，与抗体结合的细胞毒性物质可给出化疗药物、放射性同位素、以及毒性肽。本发明的抗体优选为抗体本身具有细胞毒活性的抗体。
在又一方案中，本发明提供癌症的诊断方法，其特征在于：使用与紧密连接蛋白3蛋白结合的抗体，检测紧密连接蛋白3蛋白。本发明的方法中，优选检测紧密连接蛋白3蛋白的胞外区。还优选本发明的方法是使用识别紧密连接蛋白3蛋白的抗体进行。
在其它方案中，本发明提供癌症的诊断方法，该癌症的诊断方法包含以下步骤：
(a)由被检者采集试样的步骤；
(b)使用与紧密连接蛋白3蛋白结合的抗体，检测采集的试样中所含的紧密连接蛋白3蛋白的步骤。
本发明中，上述试样只要是可从被检者中采集的即可，可以使用任何试样。在一个方案中，使用从被检者采集的血液试样。在其它方案中，也使用通过外科或活检由被检者采集的试样。该诊断方法的癌症只要是作为对象的癌细胞表达紧密连接蛋白3蛋白的癌症即可，可以是任何癌症。本发明中优选的癌症是卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌和结肠癌。特别优选乳腺癌。根据本发明，可以诊断这些癌症的原发性病灶以及转移性病灶的任意一种。本发明中，从被检者采集试样的步骤也可称作是由受试者提供试样的步骤。
在又一种方案中，本发明提供癌症的诊断方法，该诊断方法包含以下步骤：(1)将用放射性同位素标记的、与紧密连接蛋白3蛋白结合的抗体给予被检者的步骤；以及(2)检测上述放射性同位素的聚集的步骤。在某一方案中，放射性同位素是正电子发射核素。本发明中的优选正电子发射核素例如可选自11C、13N、15O、18F、45Ti、55Co、64Cu、66Ga、68Ga、76Br、89Zr和124I。
在又一方案中，本发明提供癌症的诊断方法，其特征在于：检测编码紧密连接蛋白3蛋白的基因的表达。在又一方案中，本发明提供用于本发明的诊断方法的诊断药或试剂盒。即，本发明提供以下发明。
[1]单克隆抗体，该单克隆抗体与紧密连接蛋白3蛋白结合。
[2][1]所述的单克隆抗体，该单克隆抗体与在细胞膜上表达的、含有SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列的蛋白质结合。
[3][2]所述的单克隆抗体，该单克隆抗体基本上不与含有SEQ IDNO.2所述氨基酸序列的第30号-第80号氨基酸序列的肽、或含有第137号-159号氨基酸的肽交叉反应。
[4][1]-[3]中任一项所述的单克隆抗体，该单克隆抗体与在细胞膜上表达的、含有SEQ ID NO.4所述氨基酸序列的蛋白质结合。
[5][1]-[3]中任一项所述的单克隆抗体，该单克隆抗体与在细胞膜上表达的、含有SEQ ID NO.8所述的氨基酸序列的蛋白质结合。
[6]抗体，该抗体识别由蛋白质的2个胞外环形成的立体结构并结合，其中，所述蛋白质是在细胞膜上表达的、含有SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4、和SEQ ID NO.8中任一个所述的氨基酸序列的蛋白质。
[7][6]所述的抗体，该抗体基本上不与含有SEQ ID NO.2所述氨基酸序列的第30号-第80号氨基酸序列的肽、或含有第137号-159号氨基酸的肽交叉反应。
[8][6]或[7]所述的抗体，该抗体是单克隆抗体。
[9][1]-[8]中任一项所述的抗体，该抗体具有细胞毒活性。
[10][9]所述的抗体，其中，细胞毒活性是ADCC活性。
[11][9]所述的抗体，其中，细胞毒活性是CDC活性。
[12][1]-[11]中任一项所述的抗体，该抗体结合有化疗药物或毒性肽。
[13]抗体，该抗体是与紧密连接蛋白3蛋白结合的抗体，结合有选自化疗药物、毒性肽和放射性同位素的任意一种细胞毒活性物质。
[14][1]-[13]中任一项所述的抗体，该抗体是以下(1)-(61)中任一项所述的抗体：
(1)含有H链的抗体，该H链具有SEQ ID NO.12所述的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO.14所述的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ IDNO.16所述的氨基酸序列作为CDR3；
(2)含有(1)所述的H链的抗体，该H链具有SEQ ID NO.20所述的氨基酸序列的139-462号氨基酸序列作为CH；
(3)含有(1)所述的H链的抗体，该H链具有SEQ ID NO.22所述的氨基酸序列作为CH；
(4)含有L链的抗体，该L链具有SEQ ID NO.24所述的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO.26所述的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ IDNO.28所述的氨基酸序列作为CDR3；
(5)含有(4)所述的L链的抗体，该L链具有SEQ ID NO.32所述的氨基酸序列的135-240号氨基酸序列作为CL；
(6)含有(4)所述的L链的抗体，该L链具有SEQ ID NO.34所述的氨基酸序列作为CL；
(7)抗体，该抗体含有(1)所述的H链和(4)所述的L链；
(8)抗体，该抗体含有(2)所述的H链和(5)所述的L链；
(9)抗体，该抗体含有(3)所述的H链和(6)所述的L链；
(10)抗体，该抗体是在(1)-(9)中任一项所述的抗体中有1或多个氨基酸置换、缺失、附加和/或插入所得的抗体，与(1)-(9)中任一项所述的抗体具有同等的活性；
(11)含有H链的抗体，该H链具有SEQ ID NO.36所述的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO.38所述的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ IDNO.40所述的氨基酸序列作为CDR3；
(12)含有(11)所述的H链的抗体，该H链具有SEQ ID NO.44所述的氨基酸序列的140-476号氨基酸序列作为CH；
(13)含有(11)所述的H链的抗体，该H链具有SEQ ID NO.22所述的氨基酸序列作为CH；
(14)含有L链的抗体，该L链具有SEQ ID NO.46所述的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO.48所述的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ IDNO.50所述的氨基酸序列作为CDR3；
(15)含有(14)所述的L链的抗体，该L链具有SEQ ID NO.54所述的氨基酸序列的133-238号氨基酸序列作为CL；
(16)含有(14)所述的L链的抗体，该L链具有SEQ ID NO.34所述的氨基酸序列作为CL；
(17)抗体，该抗体含有(11)所述的H链和(14)所述的L链；
(18)抗体，该抗体含有(12)所述的H链和(15)所述的L链；
(19)抗体，该抗体含有(13)所述的H链和(16)所述的L链；
(20)抗体，该抗体是在(11)-(19)中任一项所述的抗体中有1或多个氨基酸置换、缺失、附加和/或插入所得的抗体，与(11)-(19)中任一项所述的抗体具有同等的活性；
(21)含有H链的抗体，该H链具有SEQ ID NO.56所述的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO.58所述的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ IDNO.60所述的氨基酸序列作为CDR3；
(22)含有(21)所述的H链的抗体，该H链具有SEQ ID NO.64所述的氨基酸序列的137-471号氨基酸序列作为CH；
(23)含有(21)所述的H链的抗体，该H链具有SEQ ID NO.22所述的氨基酸序列作为CH；
(24)含有L链的抗体，该L链具有SEQ ID NO.66所述的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO.68所述的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ IDNO.70所述的氨基酸序列作为CDR3；
(25)含有(24)所述的L链的抗体，该L链具有SEQ ID NO.74所述的氨基酸序列的133-238号氨基酸序列作为CL；
(26)含有(24)所述的L链的抗体，该L链具有SEQ ID NO.34所述的氨基酸序列作为CL；
(27)抗体，该抗体含有(21)所述的H链和(24)所述的L链；
(28)抗体，该抗体含有(22)所述的H链和(25)所述的L链；
(29)抗体，该抗体含有(23)所述的H链和(26)所述的L链；
(30)抗体，该抗体是在(21)-(29)中任一项所述的抗体中有1或多个氨基酸置换、缺失、附加和/或插入所得的抗体，与(21)-(29)中任一项所述的抗体具有同等的活性；
(31)含有H链的抗体，该H链具有SEQ ID NO.76所述的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO.78所述的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ IDNO.80所述的氨基酸序列作为CDR3；
(32)含有(31)所述的H链的抗体，该H链具有SEQ ID NO.84所述的氨基酸序列的140-463号氨基酸序列作为CH；
(33)含有(31)所述的H链的抗体，该H链具有SEQ ID NO.22所述的氨基酸序列作为CH；
(34)含有L链的抗体，该L链具有SEQ ID NO.86所述的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO.88所述的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ IDNO.90所述的氨基酸序列作为CDR3；
(35)含有(34)所述的L链的抗体，该L链具有SEQ ID NO.94所述的氨基酸序列的133-238号氨基酸序列作为CL；
(36)含有(34)所述的L链的抗体，该L链具有SEQ ID NO.34所述的氨基酸序列作为CL；
(37)抗体，该抗体含有(31)所述的H链和(34)所述的L链；
(38)抗体，该抗体含有(32)所述的H链和(35)所述的L链；
(39)抗体，该抗体含有(33)所述的H链和(36)所述的L链；
(40)抗体，该抗体是在(31)-(39)中任一项所述的抗体中有1或多个氨基酸置换、缺失、附加和/或插入所得的抗体，与(31)-(39)中任一项所述的抗体具有同等的活性；
(41)含有H链的抗体，该H链具有SEQ ID NO.96所述的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO.98所述的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ IDNO.100所述的氨基酸序列作为CDR3；
(42)含有(41)所述的H链的抗体，该H链具有SEQ ID NO.104所述的氨基酸序列的140-474号氨基酸序列作为CH；
(43)含有(41)所述的H链的抗体，该H链具有SEQ ID NO.22所述的氨基酸序列作为CH；
(44)含有L链的抗体，该L链具有SEQ ID NO.106所述的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO.108所述的氨基酸序列作为CDR2、和SEQID NO.110所述的氨基酸序列作为CDR3；
(45)含有(44)所述的L链的抗体，该L链具有SEQ ID NO.114所述的氨基酸序列的133-238号氨基酸序列作为CL；
(46)含有(44)所述的L链的抗体，该L链具有SEQ ID NO.34所述的氨基酸序列作为CL；
(47)抗体，该抗体含有(41)所述的H链和(44)所述的L链；
(48)抗体，该抗体含有(42)所述的H链和(45)所述的L链；
(49)抗体，该抗体含有(43)所述的H链和(46)所述的L链；
(50)抗体，该抗体是在(41)-(49)中任一项所述的抗体中有1或多个氨基酸置换、缺失、附加和/或插入所得的抗体，与(41)-(49)中任一项所述的抗体具有同等的活性；
(51)含有H链的抗体，该H链具有SEQ ID NO.167所述的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO.169所述的氨基酸序列作为CDR2、和SEQID NO.171所述的氨基酸序列作为CDR3；
(52)含有(51)所述的H链的抗体，该H链具有SEQ ID NO.173所述的氨基酸序列的118-447号氨基酸序列作为CH；
(53)含有(51)所述的H链的抗体，该H链具有SEQ ID NO.22所述的氨基酸序列作为CH；
(54)含有L链的抗体，该L链具有SEQ ID NO.179所述的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO.181所述的氨基酸序列作为CDR2、和SEQID NO.183所述的氨基酸序列作为CDR3；
(55)含有(54)所述的L链的抗体，该L链具有SEQ ID NO.185所述的氨基酸序列的113-218号氨基酸序列作为CL；
(56)含有(54)所述的L链的抗体，该L链具有SEQ ID NO.34所述的氨基酸序列作为CL；
(57)抗体，该抗体含有(51)所述的H链和(54)所述的L链；
(58)抗体，该抗体含有(52)所述的H链和(55)所述的L链；
(59)抗体，该抗体含有(53)所述的H链和(56)所述的L链；
(60)抗体，该抗体是在(51)-(59)中任一项所述的抗体中有1或多个氨基酸置换、缺失、附加和/或插入所得的抗体，与(51)-(59)中任一项所述的抗体具有同等的活性；
(61)抗体，该抗体与表位结合，该表位与(1)-(60)中任一项所述的抗体所结合的紧密连接蛋白3蛋白的表位相同。
[15]癌症的诊断方法，该诊断方法包含将上述[1]-[14]中任一项所述的抗体与紧密连接蛋白3蛋白结合的步骤。
[16]癌症的诊断方法，该诊断方法包含以下步骤：
(a)从被检者采集试样的步骤；
(b)使用与紧密连接蛋白3蛋白结合的抗体，检测采集的试样中所含的紧密连接蛋白3蛋白的步骤。
[17]癌症的诊断方法，该诊断方法包含以下步骤：(1)将用放射性同位素标记的、与紧密连接蛋白3蛋白结合的抗体给予被检者的步骤；以及(2)检测上述放射性同位素的聚集的步骤。
[18][17]所述的诊断方法，其中，放射性同位素是正电子发射核素。
[19][18]所述的诊断方法，其中，正电子发射核素是选自11C、13N、15O、18F、45Ti、55Co、64Cu、66Ga、68Ga、76Br、89Zr和124I的任意之一的核素。
[20][15]-[19]中任一项所述的诊断方法，其中，癌症为选自卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌和结肠癌的任意之一的癌症。
[21][20]所述的诊断方法，其中，癌症为原发性癌症。
[22][20]所述的诊断方法，其中，癌症为转移性癌症。
[23]用于癌症的诊断方法的诊断药，该诊断药含有与紧密连接蛋白3蛋白结合的抗体。
[24]用于癌症的诊断方法的试剂盒，该试剂盒含有与紧密连接蛋白3蛋白结合的抗体和含有紧密连接蛋白3蛋白的生物试样。
[25]药物组合物，该药物组合物含有与紧密连接蛋白3蛋白结合的抗体作为有效成分。
[26]细胞增殖抑制剂，该细胞增殖抑制剂含有与紧密连接蛋白3蛋白结合的抗体作为有效成分。
[27]抗癌药，该抗癌药含有与紧密连接蛋白3蛋白结合的抗体作为有效成分。
[28][27]所述的抗癌药，其中，癌症为选自卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌和结肠癌的任意之一的癌症。
[29][28]所述的抗癌药，其中，癌症为原发性癌症。
[30][28]所述的抗癌药，其中，癌症为转移性癌症。
[31][28]所述的抗癌药，其中，抗体为[1]-[14]中任一项所述的抗体。
[32]与紧密连接蛋白3蛋白结合的抗体在制备细胞增殖抑制剂中的应用。
[33]与紧密连接蛋白3蛋白结合的抗体在制备抗癌药中的应用。
[34][33]中所述的应用，其中，癌症为选自卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌和结肠癌的任意之一的癌症。
[35][33]所述的应用，其中，癌症为原发性癌症。
[36][33]所述的应用，其中，癌症为转移性癌症。
[37][32]或[33]中所述的应用，其中，抗体为[1]-[14]中任一项所述的抗体。
[38]抑制细胞增殖的方法，该方法包含将与紧密连接蛋白3蛋白结合的抗体给予对象的步骤。
[39]预防或治疗癌症的方法，该方法包含将与紧密连接蛋白3蛋白结合的抗体给予对象的步骤。
[40][39]所述的方法，其中，癌症为选自卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌和结肠癌的任意之一的癌症。
[41][39]所述的方法，其中，癌症为原发性癌症。
[42][39]所述的方法，其中，癌症为转移性癌症。
[43][38]或[39]所述的方法，其中，抗体为[1]-[14]中任一项所述的抗体。
[44]对表达紧密连接蛋白3蛋白的细胞引发细胞毒的方法，该方法包含将表达紧密连接蛋白3蛋白的细胞与同紧密连接蛋白3蛋白结合的抗体接触的步骤。
[45]抑制表达紧密连接蛋白3蛋白的细胞的增殖的方法，该方法包含将表达紧密连接蛋白3蛋白的细胞与同紧密连接蛋白3蛋白结合的抗体接触的步骤。
[46][44]或[45]所述的方法，其中，表达紧密连接蛋白3蛋白的细胞为癌细胞。
[47][44]-[46]中任一项所述的方法，其中，抗体是具有细胞毒活性的抗体。
[48][44]-[46]中任一项所述的方法，其中，抗体是[1]-[14]中任一项所述的抗体。
[49]与紧密连接蛋白3蛋白结合的抗体，该抗体应用于癌症的治疗方法。
[50][49]所述的抗体，其中，癌症为选自卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌和结肠癌的任意之一的癌症。
[51][50]所述的抗体，其中，癌症为原发性癌症。
[52][50]所述的方法，其中，癌症为转移性癌症。
[53][50]所述的抗体，该抗体是[1]-[14]中任一项所述的抗体。
【附图说明】
图1是表示紧密连接蛋白3胞外环与人紧密连接蛋白家族分子的比对和树状图。
图2是表示人、小鼠紧密连接蛋白3氨基酸序列比对的图。下划线部表示预想的跨膜区域，方框部表示预想的胞外区。
图3是表示表达紧密连接蛋白3的DG44细胞和Ba/F3细胞或乳腺癌细胞株MCF7中的抗紧密连接蛋白3抗体结合反应性不同的图。(A)表示Ba/F3细胞，(B)表示乳腺癌细胞株MCF7。纵轴、横轴表示X几何平均数值(荧光强度(相对值))。
图4是表示抗紧密连接蛋白3单克隆抗体与紧密连接蛋白3胞外环肽区域的结合性的图。纵轴表示405nm的吸光度(参照波长655nm)，横轴表示抗紧密连接蛋白3抗体的抗体浓度(ng/mL)。
图5是表示抗紧密连接蛋白3抗体诱导抗原表达依赖性的细胞毒活性的图。纵轴表示通过添加补体使死亡细胞增加的比例(％)。
图6是表示抗紧密连接蛋白3抗体诱导对MCF7细胞的补体依赖性毒活性的图。纵轴表示铬游离率(％)。
图7是表示抗紧密连接蛋白3抗体诱导对MCF7细胞的抗体依赖性细胞毒活性的图。纵轴表示铬游离率(％)。
图8是使用流式细胞仪表示重组嵌合抗体与紧密连接蛋白3强制表达细胞特异性结合的图。纵轴表示细胞数(荧光系数)，横轴表示荧光强度值。
图9-1是表示对各种抗紧密连接蛋白3抗体与以下表达细胞的结合活性进行分析的FACS的结果图表(单克隆抗体CDN1、CDN2、和CDN3的结果)。CLD3/3：天然型表达紧密连接蛋白3的细胞，1/3：CLD1/3嵌合蛋白质表达细胞、3/1：CLD3/1嵌合蛋白质表达细胞、Ba/F3：宿主细胞Ba/F3。X轴表示荧光强度，Y轴表示各荧光强度下的相对细胞数。
图9-2接续图9-1(抗紧密连接蛋白3单克隆抗体CDN4、CDN5、和CDN7的结果)
图9-3接续图9-2(抗紧密连接蛋白3单克隆抗体CDN8、CDN16、和CDN17的结果)
图9-4接续图9-3(抗紧密连接蛋白3单克隆抗体CDN24、CDN27、和CDN28的结果)
图9-5接续图9-4(抗紧密连接蛋白3单克隆抗体CDN29、CDN30、和CDN31的结果)
图9-6接续图9-5(抗紧密连接蛋白3单克隆抗体CDN32、CDN33、和CDN35的结果)
图9-7接续图9-6(抗紧密连接蛋白3单克隆抗体CDN36、CDN37、和CDN38的结果)
图9-8接续图9-7(抗紧密连接蛋白3抗血清[稀释200倍]、抗紧密连接蛋白3抗血清[稀释1000倍]和未添加阴性的结果)。
图10是表示图9-1至图9-7中所示的直方图横轴的相对荧光强度为100以上的细胞相对于全体细胞的比例图表。
图11是表示通过流式细胞术表示重组嵌合抗体与紧密连接蛋白3强制表达细胞的结合结果的图。纵轴表示细胞数(荧光系数)，横轴表示荧光强度。灰色虚线、黑色实线分别表示未添加嵌合抗体、添加时的细胞荧光强度分布。
图12是表示软琼脂集落形成/MTT杂交测定体系中，抗紧密连接蛋白3抗体抑制MCF7细胞增殖的情形的图表。
图13是表示创面愈合测定中，通过添加抗紧密连接蛋白3抗体(CDN04)来抑制细胞运动能力的情形的照片。虚线所框取的区域的细胞是经剥离处理后移动的细胞。
【具体实施方式】
紧密连接蛋白3是属于紧密连接蛋白家族的蛋白质的一种，是控制细胞间透过性的结构蛋白。人紧密连接蛋白3的氨基酸序列和编码该氨基酸序列的碱基序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.1所示(GenBankAccession No.NM_001306)。本发明中，单克隆抗体所识别的紧密连接蛋白3蛋白是指保持天然的紧密连接蛋白3蛋白的立体结构的蛋白质。本发明的单克隆抗体优选识别紧密连接蛋白3的胞外区并结合。紧密连接蛋白3蛋白的胞外区在SEQ ID NO.2的氨基酸序列中相当于第30-80号(环1)，在SEQ ID NO.2的氨基酸序列中相当于第137-159号(环2)。
含有这些胞外区的氨基酸序列的多肽只要可保持细胞表面的紧密连接蛋白3的立体结构即可，本发明的单克隆抗体可以识别该多肽。本发明的单克隆抗体优选与保持在细胞表面表达的天然的紧密连接蛋白3立体结构的多肽结合。多肽保持天然的紧密连接蛋白3立体结构，这例如可如下确认。即，本发明的单克隆抗体与在细胞表面表达紧密连接蛋白3的细胞免疫学结合被某种多肽抑制时，可以确认该多肽保持了天然的紧密连接蛋白3胞外区的立体结构。
本发明特别优选的方案中，本发明的单克隆抗体识别含有由紧密连接蛋白3的2个胞外环区构成的立体结构的表位。本发明中，含有立体结构的表位包含通过1个或多个肽链间的相互作用而构成的结构。这样的表位被称为立体结构表位(构象性表位)。例如，由构成紧密连接蛋白3的胞外结构域的2个环之间的相互作用而构成的表位包含含有本发明的立体结构的表位。即，本发明的单克隆抗体优选识别由紧密连接蛋白3的2个胞外环构成的立体结构表位。
单克隆抗体识别立体结构表位，这例如可如下确认。例如，合成线状的肽，该线状肽含有构成紧密连接蛋白3胞外环的氨基酸序列。该肽可化学合成。或者利用紧密连接蛋白3的cDNA中编码相当于环部分的氨基酸序列的区域，通过基因工程方法获得。接着，评价含有构成环部分的氨基酸序列的线状肽与受试抗体的结合活性。例如，通过以被固定的线状肽作为抗原的ELISA，可评价受试抗体与该肽的结合活性。或者根据受试抗体与表达紧密连接蛋白3的细胞的结合中线状肽的抑制水平，可以明确与线状肽的结合活性。通过这些实验，可以明确受试抗体与线状肽的结合活性。
本发明中，与表达紧密连接蛋白3的细胞结合的抗体与线状肽也具有结合活性时，称作“抗体与线状肽具有交叉反应性”。本发明中的优选的单克隆抗体是与线状肽基本上不具有交叉反应性的抗体，其中线状肽含有构成紧密连接蛋白3胞外环的氨基酸序列。与线状肽基本上不具有交叉反应性是指同抗体与表达紧密连接蛋白3的细胞的结合活性相比，与线状肽的结合活性例如为50％以下，通常为30％以下，优选20％以下。
本发明的单克隆抗体识别立体结构表位，这可如下确认。首先准备表达嵌合分子的细胞，该嵌合分子使紧密连接蛋白3的2个胞外环分别与其它的紧密连接蛋白3样分子的胞外环连接而成。紧密连接蛋白3样分子例如可使用人紧密连接蛋白1。例如，制作表达如下构成的嵌合分子的强制表达细胞。
3/1嵌合 1/3嵌合 天然
环1 紧密连接蛋白3 紧密连接蛋白1 紧密连接蛋白3
环2 紧密连接蛋白1 紧密连接蛋白3 紧密连接蛋白3
使受试抗体与这些强制表达细胞接触，同与天然型的表达紧密连接蛋白3的细胞的结合活性相比，与3/1嵌合表达细胞和1/3嵌合表达细胞两者的结合活性低的单克隆抗体是识别紧密连接蛋白3立体结构表位的抗体。如上所述，例如识别由构成紧密连接蛋白3胞外结构域的2个环之间的相互作用构成的表位的单克隆抗体是本发明的识别紧密连接蛋白3立体结构表位的抗体的优选方案之一。更具体的表现是：本发明的优选的单克隆抗体与强制表达人紧密连接蛋白3的细胞强烈结合，而与3/1嵌合表达细胞和1/3嵌合表达细胞两者均实质性不结合。这里，实质性不结合是指与表达人紧密连接蛋白3的细胞的结合活性的80％以下，通常为50％以下，优选30％以下，特别优选15％以下的结合活性。
测定抗体与细胞的结合活性的方法例如有抗体实验手册(Ed Harlow，David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)中的359-420页所述的方法。即，可通过以细胞作为抗原的ELISA或FACS(荧光激活细胞分选仪)的原理进行评价。
在ELISA形式中，抗体与细胞的结合活性通过比较酶促反应产生的信号水平来定量评价。即，向固定了各强制表达细胞的ELISA板上加入受试抗体，利用识别受试抗体的酶标记抗体来检测与细胞结合的抗体。或者在FACS中，制备受试抗体的稀释系列，通过确定与各强制表达细胞的抗体结合效价来比较与细胞的结合活性。
在悬浮于缓冲液等中的细胞表面上表达的抗原与抗体的结合可通过流式细胞仪检测。流式细胞仪例如已知有以下装置。
FACSCantoTM II
FACSAriaTM
FACSArrayTM
FACSVantageTM SE
FACSCaliburTM(均为BD Biosciences的商品名)
EPICS ALTRA HyPerSort
Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(均为Beckman Coulter的商品名).
受试紧密连接蛋白3抗体与抗原的结合活性的优选测定方法的一个例子是以下方法。首先用FITC标记的二次抗体染色，该二次抗体识别与表达紧密连接蛋白3的细胞反应的受试抗体。受试抗体的浓度用适合的缓冲液适当稀释，调节成所需浓度使用。例如，可以以10μg/mL-10ng/mL之间的任意浓度使用。接着，通过FACS Calibur(BD制备)测定荧光强度和细胞数。抗体与该细胞的结合量是使用CELL QUEST软件(BD制备)进行分析，反映为荧光强度、即几何平均数值。即，通过获得该几何平均数值，可以测定由抗体的结合量表示的抗体的结合活性。
本方法中，例如“基本上不与3/1嵌合表达细胞结合”可通过以下方法判断。首先将受试抗体用二次抗体染色，该受试抗体与表达上述3/1嵌合分子的细胞结合。例如，如果受试抗体为小鼠的抗体，则可以利用FITC标记的抗小鼠免疫球蛋白抗体作为二次抗体。接着，检测细胞的荧光强度。荧光检测是使用FACS Calibur作为流式细胞术时，所得荧光强度可使用CELL QUEST软件分析。按照下述计算式，由受试抗体存在和非存在下的几何平均数值计算该比(ΔGeo-Mean)，由此可以求出受试抗体的结合导致的荧光强度增加的比例。
ΔGeo-Mean＝Geo-Mean(受试抗体存在下)/Geo-Mean(受试抗体非存在下)
将通过分析得到的、反映了受试抗体与3/1嵌合分子表达细胞的结合量的几何平均数比值(3/1嵌合分子ΔGeo-Mean值)与反映了受试抗体与表达紧密连接蛋白3的细胞的结合量的ΔGeo-Mean值比较。这种情况下，特别优选求出3/1嵌合分子表达细胞以及表达紧密连接蛋白3的细胞的ΔGeo-Mean比值时所使用的受试抗体的浓度可以用互相相同或基本上相同的浓度调节。对照抗体可以利用预先确认了识别紧密连接蛋白3立体结构表位的单克隆抗体。例如图9所示的以下的本发明的单克隆抗体可用作识别紧密连接蛋白3的立体结构表位的抗体。
CDN01，CDN02，CDN03，CDN04，CDN05，CDN07，CDN08，
CDN16，CDN17，CDN24，CDN27，CDN28，CDN29，
CDN30，CDN31，CDN32，CDN33，CDN35，CDN36，CDN37或CDN38
本发明中，受试抗体与3/1嵌合分子表达细胞的ΔGeo-Mean比值至少为受试抗体与表达紧密连接蛋白3的细胞的ΔGeo-Mean比值的80％，优选50％、进一步优选30％，特别优选比15％还小，则为“与3/1嵌合分子表达细胞基本上不结合”。求出Geo-Mean值(几何平均数)的计算式记于Cell QUEST软件用户指南(BD Biosciences)。与1/3嵌合分子表达细胞的结合活性也可同样进行评价。公知的结合活性评价中使用的表达3/1嵌合分子、1/3嵌合分子、以及紧密连接蛋白3各分子的细胞均利用共通的表达载体和宿主细胞制备，优选各细胞的表达量为同等程度。
本发明的单克隆抗体包含以下的单克隆抗体：与表达人紧密连接蛋白3的细胞结合、且与表达包含人紧密连接蛋白3胞外环和人紧密连接蛋白1胞外环的嵌合分子的细胞的结合活性比与上述表达人紧密连接蛋白3的细胞的结合活性低的单克隆抗体。或者本发明的优选的单克隆抗体包含下述单克隆抗体：与表达人紧密连接蛋白3的细胞结合、且与表达包含人紧密连接蛋白3胞外环和人紧密连接蛋白1胞外环的嵌合分子的细胞基本上不结合的单克隆抗体。
抗紧密连接蛋白3单克隆抗体的制备
本发明的单克隆抗体可通过DNA免疫获得。本发明的抗紧密连接蛋白3单克隆抗体特别优选来自哺乳动物的单克隆抗体。来自哺乳动物的单克隆抗体包含通过杂交瘤生成的、以及通过基因工程方法由用含有抗体基因的表达载体转化的宿主所生成的。
本发明的生成单克隆抗体的杂交瘤可使用DNA免疫如下制备。DNA免疫是将载体DNA给予该免疫动物，使免疫抗原在免疫动物的机体内表达，由此获得免疫刺激的方法。其中所述载体DNA以编码抗原蛋白质的基因可在免疫动物中表达的方式构建。与给予蛋白质抗原的常规免疫方法相比，DNA免疫有以下的优越性。
-可保持紧密连接蛋白3这样的膜蛋白的结构，并获得免疫刺激
-无需纯化免疫抗原
但是，在DNA免疫中，难以与佐剂等免疫刺激手段组合使用。紧密连接蛋白3的人-小鼠之间的同一性特别是在构成胞外区的环1中为46/51，极高。识别这种种间同一性高的蛋白质的单克隆抗体可通过DNA免疫获得，这是预想外的成果。
通过DNA免疫获得本发明的单克隆抗体时，首先是将表达紧密连接蛋白3蛋白的DNA给予免疫动物。编码紧密连接蛋白3的DNA可通过PCR等公知的方法合成。将所得DNA插入到适当的表达载体中，给予免疫动物。表达载体例如可利用pcDNA3.1等市售的表达载体。将载体给予生物体的方法也可利用常规使用方法。例如将吸附有表达载体的金颗粒通过基因枪射入细胞内，由此可进行DNA免疫。
根据本发明人的认识，通过腹腔内给予紧密连接蛋白3强制表达细胞进行免疫的小鼠中无法高效率获得生成紧密连接蛋白3结合性抗体的杂交瘤。而利用DNA免疫进行免疫的小鼠中可高效率获得生成紧密连接蛋白3结合性抗体的杂交瘤。特别是在DNA免疫后进一步给予紧密连接蛋白3强制表达细胞的小鼠中，可容易地获得目标杂交瘤。即，DNA免疫后通过表达紧密连接蛋白3的细胞进行追加免疫(激发)，这是获得本发明的单克隆抗体的优选方法。
本发明中，可以利用任意的非人动物作为免疫动物。为了通过细胞融合法获得单克隆抗体，优选考虑与细胞融合中所使用的母细胞的相容性来选择免疫动物。通常优选啮齿类的动物作为免疫动物。具体可以将小鼠、大鼠、仓鼠或兔作为免疫动物。其它也可以使用猴等作为免疫动物。
如上所述，确认免疫动物被免疫、血清中目标抗体效价升高，然后从免疫动物中采集抗体生成细胞，进行克隆。优选的免疫细胞(抗体生成细胞)是脾细胞。
与上述免疫细胞融合的细胞可使用哺乳动物的骨髓瘤细胞。骨髓瘤细胞优选具备用于进行筛选的适当的选择标记。选择标记是指在特定的培养条件下可(或者无法)存活的细胞。公知的选择标记有次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺损(以下简称为HGPRT缺损)、或胸苷激酶缺损(以下简称为TK缺损)等。具有HGPRT或TK缺损的细胞具有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷感受性(以下简称为HAT感受性)。HAT感受性细胞无法在HAT选择性培养基中进行DNA合成，会死亡，但与正常的细胞融合，则可利用正常细胞的补救途径继续合成DNA，因此在HAT选择培养基中也可增殖。
HGPRT缺损或TK缺损的细胞可分别由含有6-硫代鸟嘌呤、8-氮鸟嘌呤(以下简称为8AG)、或5’-溴脱氧尿苷的培养基选择。正常的细胞会将这些嘧啶类似物摄入到DNA中，因此死亡。而缺损这些酶的细胞无法摄入这些嘧啶类似物，因此可在选择培养基中存活。除此之外，被称为G418抗性的选择标记通过新霉素抗性基因获得对2-脱氧链霉胺系抗生素(庆大霉素类似物)的抗性。细胞融合中优选的各种骨髓瘤细胞是公知的。例如可以将下述骨髓瘤细胞应用于本发明的单克隆抗体的制备。
P3(P3x63Ag8.653)(J.Immunol.(1979)123，1548-1550)；
P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81，1-7)；
NS-1(Kohler.G.和Milstein，C.Eur.J.Immunol.(1976)6，511-519)；
MPC-11(Margulies.D.H等人，Cell(1976)8，405-415)；
SP2/0(Shulman，M等人，Nature(1978)276，269-270)；
FO(de St.Groth，S.F等人，J.Immunol.Methods(1980)35，1-21)；
S194(Trowbridge，I.S.J.Exp.Med.(1978)148，313-323)；
R210(Galfre，G等人，Nature(1979)277，131-133)等
基本上可按照公知的方法、例如Kohler和Milstein等人的方法(Kohler.G和Milstein，C.，Methods Enzymol.(1981)73，3-46)等，进行上述免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合。
更具体地说，例如可在细胞融合促进剂的存在下、在通常的营养培养液中实施上述细胞融合。融合促进剂例如可使用聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等。为了进一步提高融合效率，可以根据需要添加二甲基亚砜等辅助剂。
免疫细胞与骨髓瘤细胞的使用比例可任意设定。例如相对于骨髓瘤细胞，优选使免疫细胞为1-10倍。上述细胞融合中使用的培养液例如可利用适合上述骨髓瘤细胞株增殖的RPMI1640培养液、MEM培养液、其它在该种细胞培养中使用的常规培养液。还可以在培养液中进一步添加胎牛血清(FCS)等的血清补液。
细胞融合是将上述免疫细胞和骨髓瘤细胞的规定量在上述培养液中充分混合，再混合预先加温至37℃左右的PEG溶液来形成目标融合细胞(杂交瘤)。细胞融合法中，例如通常可以以30-60％(w/v)的浓度添加平均分子量1000-6000左右的PEG。接着依次添加上述例举的适当的培养液，离心，除去上清，将这些操作反复进行，除去杂交瘤生长发育不优选的细胞融合剂等。
这样得到的杂交瘤可通过选择培养液进行选择，所述选择培养液根据在细胞融合中使用的骨髓瘤所具有的选择标记而得到。例如具有HGPRT或TK缺损的细胞可以通过在HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养液)中培养来选择。即，将HAT感受性的骨髓瘤细胞应用于细胞融合时，在HAT培养液中，可以选择性增殖与正常细胞成功地进行了细胞融合的细胞。可以继续使用上述HAT培养液培养至使目标杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡所足够的时间。具体来说，通常通过数天-数周的培养，可以选择目标杂交瘤。接着，实施通常的极限稀释法，可以实施生成目标抗体的杂交瘤的筛选和单一克隆。或者按照国际公开WO03/104453所述的方法制备识别紧密连接蛋白3的抗体。
目标抗体的筛选和单一克隆可通过基于公知的抗原抗体反应的筛选方法实施。例如，本发明中优选的单克隆抗体可以与在细胞表面表达的紧密连接蛋白3结合。上述单克隆抗体例如可以通过FACS(荧光激活细胞分类术)进行筛选。FACS是将与荧光抗体接触的细胞用激光进行分析，测定各个细胞发出的荧光，由此测定抗体与细胞表面的结合的系统。
为了根据FACS筛选生成本发明的单克隆抗体的杂交瘤，首先准备表达紧密连接蛋白3的细胞。用于筛选的优选的细胞是强制表达紧密连接蛋白3的哺乳动物细胞。通过使用未被作为宿主转化的哺乳动物细胞作为对照，可以选择性检测抗体与细胞表面的紧密连接蛋白3的结合活性。即，通过选择生成未与宿主结合而与紧密连接蛋白3强制表达细胞结合的抗体的杂交瘤，可以获得生成本发明优选的单克隆抗体的杂交瘤。
或者可以通过ELISA的原理评价抗体与固定的表达紧密连接蛋白3的细胞的结合活性。例如，表达紧密连接蛋白3的细胞固定在ELISA板的孔中。使杂交瘤的培养上清与孔内的固定细胞接触，检测与固定细胞结合的抗体。单克隆抗体来自小鼠时，与细胞结合的抗体可根据抗小鼠免疫球蛋白抗体检测。生成抗体的杂交瘤可通过极限稀释法等克隆，所述抗体是通过这些筛选选择的、具有与抗原的结合能力的抗体。
或者为了获得识别紧密连接蛋白3立体结构表位的单克隆抗体，例如可进行下述筛选。首先准备表达该嵌合分子的细胞，该嵌合分子将紧密连接蛋白3的两个胞外环分别与其它紧密连接蛋白3样分子的胞外环连接而成。紧密连接蛋白3样分子例如可使用人紧密连接蛋白1。即，制作表达下述构成的嵌合分子的强制表达细胞。
3/1嵌合 1/3嵌合 天然
环1 紧密连接蛋白3 紧密连接蛋白1 紧密连接蛋白3
环2 紧密连接蛋白1 紧密连接蛋白3 紧密连接蛋白3
使受试抗体与这些强制表达细胞接触，比较天然型与表达紧密连接蛋白3的细胞的结合活性，通过选择与3/1嵌合表达细胞和1/3嵌合表达细胞两者的结合活性低的单克隆抗体，可以获得本发明的识别紧密连接蛋白3立体结构表位的单克隆抗体。用于筛选的优选的细胞是哺乳动物细胞。单克隆抗体与这些细胞的反应性可通过利用细胞作为抗原的ELISA或FACS确认。
如上所述，生成制备的单克隆抗体的杂交瘤可在通常的培养液中继代培养。也可以将该杂交瘤在液氮中长期保存。
按照常规方法培养该杂交瘤，可以由该培养上清中获得目标单克隆抗体。或者将杂交瘤给予与其具有相容性的哺乳动物，使其增殖，以其腹水的形式获得单克隆抗体。前者的方法适合于获得高纯度的抗体。
本发明中，可以利用由抗体基因编码的抗体，该抗体基因由抗体生成细胞克隆得来。克隆的抗体基因可以通过掺入到适当的载体中并导入宿主来以抗体的形式表达。抗体基因的分离和向载体导入、以及宿主细胞的转化的方法已经确立(例如参照Vandamme，A.M.等人，Eur.J.Biochem.(1990)192，767-775)。
例如，可以由生成抗紧密连接蛋白3抗体的杂交瘤细胞获得编码抗紧密连接蛋白3抗体的可变区(V区)的cDNA。为此，通常是首先由杂交瘤提取总RNA。由细胞提取mRNA的方法例如可利用以下方法。
胍超离心法(Chirgwin，J.M.等人，Biochemistry(1979)18，5294-5299)
AGPC法(Chomczynski，P.等人，Anal.Biochem.(1987)162，156-159)
提取的mRNA可使用mRNA纯化试剂盒(GEヘルスケアバイオサイエンス制备)等来纯化。或者如QuickPrep mRNA纯化试剂盒(GEヘルスケアバイオサイエンス制备)等，直接由细胞中提取总mRNA的试剂盒也有销售。可以使用上述试剂盒，由杂交瘤获得mRNA。使用反转录酶，可以由所得mRNA合成编码抗体V区的cDNA。cDNA可通过AMV反转录酶第一条链cDNA合成试剂盒(生化学工业制备)等合成。为了进行cDNA的合成和扩增，可以利用使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech制备)和PCR的5’-RACE法(Frohman，M.A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，8998-9002；Belyavsky，A.等人，Nucleic AcidsRes.(1989)17，2919-2932)。还可以在上述cDNA的合成过程中，向cDNA的两末端导入后述的适当的限制酶切位点。
由所得PCR产物纯化目标cDNA片段，接着与载体DNA连接。如上所述制备重组载体，导入大肠肝菌等，选择集落，然后可由该形成集落的大肝肠菌制备所需重组载体。该重组载体是否具有目标cDNA的碱基序列，这可以通过公知的方法、例如双脱氧核苷酸链终止法等确认。
为了获得编码可变区的基因，利用5’-RACE法是最简便的，其中该5’-RACE法使用可变区基因扩增用的引物。首先，以由杂交瘤细胞提取的RNA作为模板，合成cDNA，获得5’-RACE cDNA文库。5’-RACEcDNA文库的合成使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒等市售的试剂盒较为便利。
以所得5’-RACE cDNA文库作为模板，通过PCR法扩增抗体基因。根据公知的抗体基因序列，可以设计小鼠抗体基因扩增用的引物。这些引物是免疫球蛋白的亚类分别不同的碱基序列。因此，优选亚类预先使用Iso Strip小鼠单克隆抗体同型分型试剂盒(ロシユ·ダイアグノステイツクス)等市售的试剂盒确定。
具体来说，例如为了获得编码小鼠IgG的基因时，可利用可以进行编码重链γ1、γ2a、γ2b、γ3，轻链k链和λ链的基因的扩增的引物。为了扩增IgG的可变区基因，通常利用对3’一侧的引物、对接近可变区、相当于恒定区的部分进行退火的引物。而5’一侧的引物可以利用5’-RACE cDNA文库制备试剂盒中所附的引物。
利用这样扩增的PCR产物，可以重构含有重链和轻链组合的免疫球蛋白。以重构的免疫球蛋白与紧密连接蛋白3的结合活性作为指标，可以筛选目标抗体。
例如，在以获得紧密连接蛋白3的抗体为目的时，进一步优选抗体与紧密连接蛋白3的结合是特异性的。与紧密连接蛋白3结合的抗体例如可如下进行筛选。
(1)使抗体与表达紧密连接蛋白3的细胞接触的步骤，所述抗体含有由杂交瘤得到的、由cDNA编码的V区；
(2)检测表达紧密连接蛋白3的细胞与抗体的结合的步骤；和
(3)选择与表达紧密连接蛋白3的细胞结合的抗体的步骤。
检测抗体与表达紧密连接蛋白3的细胞结合的方法是公知的。具体可通过之前所述的FACS等方法检测抗体与表达紧密连接蛋白3的细胞的结合。为评价抗体的结合活性，可利用表达紧密连接蛋白3的细胞的固定标本。
以结合活性作为指标的抗体的筛选方法可以采用利用噬菌体载体的淘选法。以重链和轻链亚类的文库的形式从多克隆抗体表达细胞组中获得抗体基因时，利用噬菌体载体的筛选方法有利。编码重链和轻链可变区的基因可通过用适当的接头序列连接来制成单链Fv(scFv)。将编码scFv的基因插入到噬菌体载体中，则可以获得在表面表达scFv的噬菌体。将该噬菌体与目标抗原接触，回收与抗原结合的噬菌体，则可以回收编码具有目标结合活性的scFv的DNA。可以根据需要重复该操作，由此可以使具有目标结合活性的scFv浓缩。
本发明中，编码抗体的多核苷酸可以编码抗体的全长，或者编码抗体的一部分。抗体的一部分是指抗体分子的任意部分。以下，表示抗体的一部分的术语可使用抗体片段。本发明中的优选的抗体片段包含抗体的互补链决定区(CDR)。进一步优选本发明的抗体片段包含构成可变区的3个CDR的全部。
在获得编码目标抗紧密连接蛋白3抗体的V区的cDNA之后，通过限制酶来消化该cDNA，该限制酶识别插入到该cDNA的两个末端的限制酶切位点。优选的限制酶是识别在构成抗体基因的碱基序列中出现可能性低的碱基序列并消化。并且，为了将1个拷贝的消化片段以正确的方向插入到载体中，优选具有粘性末端的限制酶。将上述消化的、编码抗紧密连接蛋白3抗体的V区的cDNA插入到适当的表达载体中，由此可获得抗体表达载体。此时，通过使编码抗体恒定区(C区)的基因、和编码上述V区的基因在符合读框内融合，可获得嵌合抗体。这里，嵌合抗体是指恒定区和可变区的来源不同。因此，除小鼠-人等异种嵌合抗体之外，人-人同种嵌合抗体也包含在本发明的嵌合抗体中。预先向具有恒定区的表达载体中插入上述V区基因，可以构建嵌合抗体表达载体。具体来说，例如可在保有编码所需抗体恒定区(C区)的DNA的表达载体的5’一侧配置消化上述V区基因的限制酶的限制酶识别序列。将两者用同样组合的限制酶消化，通过符合读框的融合，可以构建嵌合抗体表达载体。
为了制备本发明的抗紧密连接蛋白3单克隆抗体，可以将抗体基因掺入到表达载体中，使其在表达控制区的控制下进行表达。用于表达抗体的表达控制区例如包含增强子或启动子。接着，通过用该表达载体转化适当的宿主细胞，可以获得重组细胞，该重组细胞表达编码抗紧密连接蛋白3抗体的DNA。
在抗体基因的表达中，编码抗体重链(H链)和轻链(L链)的DNA可分别掺入到其它表达载体中。掺入了H链和L链的载体同时转化相同的宿主细胞(共转化)，可以使具备H链和L链的抗体分子表达。或者也可将编码H链和L链的DNA掺入到单一的表达载体中，转化宿主细胞(参照国际公开WO94/11523)。
先分离抗体基因，导入到适当的宿主中，制备抗体，其中的宿主与表达载体的大部分的组合都是公知的。这些表达系统均可应用于本发明。使用真核细胞作为宿主时，可以使用动物细胞、植物细胞或真菌细胞。具体来说，可用作本发明的动物细胞例如可例举以下细胞。
(1)哺乳类细胞：CHO、COS、骨髓瘤、BHK(幼仓鼠肾细胞)、Hela、Vero等
(2)两栖类细胞：非洲爪蟾卵母细胞等
(3)昆虫细胞：sf9、sf21、Tn5等
或者植物细胞中，由烟草(Nicotiana tabacum)等来自烟草属(Nicotiana)的细胞得到的抗体基因的表达体系为公知的。植物细胞的转化中可以利用进行了愈伤组织培养的细胞。
并且真菌细胞可以利用下述细胞。
酵母：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等的酵母属(Saccharomyces)、巴斯德毕赤式酵母(Pichia pastoris)等毕赤式属
霉菌：黑曲霉(Aspergillus niger)等的曲霉属(Aspergillus)
或者，利用原核细胞的抗体基因的表达系统也是公知的。例如使用细菌细胞时，可以将大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌等细菌细胞在本发明中利用。
通过转化，将含有目标抗体基因的表达载体导入到这些细胞中。通过体外培养转化后的细胞，可以从该转化细胞的培养物中获得所需抗体。
重组抗体的生产中，除上述宿主细胞之外，也可以利用转基因动物。即，可由导入了编码目标抗体的基因的动物获得该抗体。例如，抗体基因符合读框插入到编码在乳汁中特性生产的蛋白质的基因的内部，以融合基因的形式构建。例如可利用山羊β酪蛋白等作为乳汁分泌的蛋白质。含有融合基因的DNA片段注入到山羊的胚胎中，该注入胚胎导入到雌山羊体内，其中，所述融合基因中插入了抗体基因。可以由接受了胚胎的山羊生产的转基因山羊(或其子孙代)所生产的乳汁中以与乳汁蛋白的融合蛋白的形式获得所需抗体。为了使转基因山羊生产的含所需抗体的乳汁量增加，可以对转基因山羊适当应用激素(Ebert，K.M等人，Bio/Technology(1994)12，699-702)。
本发明的重组抗体的C区可使用来自动物抗体的C区。例如，小鼠抗体的H链C区可使用Cγ1、Cγ2a、Cγ2b、Cγ3、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2和Cε，L链的C区可使用Cκ和Cλ。小鼠抗体以外的动物抗体可使用大鼠、兔、山羊、绵羊、骆驼、猴等的动物抗体。这些序列是公知的。为了改善抗体或其生成的稳定性，可以对C区进行修饰。
本发明中，将抗体给予人时，为了降低对人的异种抗原性等，可以制成人工变异的基因重组型抗体。基因重组型抗体例如包含嵌合抗体、人源化抗体等。这些变异抗体可采用公知的方法制备。
嵌合抗体是指将来源不同的可变区和恒定区互相连接的抗体。例如含有小鼠抗体的重链、轻链的可变区，和人抗体的重链、轻链的恒定区的抗体是小鼠-人异种嵌合抗体。编码小鼠抗体的可变区的DNA与编码人抗体的恒定区的DNA连接，将其掺入到表达载体中，由此可制备表达嵌合抗体的重组载体。培养通过该载体转化的重组细胞，使掺入的DNA表达，由此可获得在培养中生成的该嵌合抗体。嵌合抗体和人源化抗体的C区可使用人抗体。
例如H链中，可以利用Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2和Cε作为C区。L链中，可以使用Cκ和Cλ为C区。这些C区的氨基酸序列、以及编码这些氨基酸序列的碱基序列是公知的。为了改善抗体本身或抗体生成的稳定性，可以对人抗体的C区进行修饰。
通常嵌合抗体由来自人以外的动物的抗体的V区和来自人抗体的C区构成。与此相对，人源化抗体由来自人以外的动物的抗体的互补决定区(CDR)和来自人抗体的支架区(FR)以及来自人抗体的C区构成。人源化抗体在人体内的抗原性降低，因此适合作为本发明的治疗药的有效成分。
例如，将基于本发明制备的抗紧密连接蛋白3单克隆抗体的可变区与构成人恒定区的氨基酸序列连接，由此得到的小鼠-人嵌合抗体优选作为本发明的单克隆抗体。即，本发明提供小鼠-人嵌合单克隆抗体，该抗体含有H链的可变区和L链的可变区，该H链的可变区含有下述(1)-(6)中任一项的氨基酸序列。
(1)CDN04
H链：SEQ ID NO.18所述的氨基酸序列
L链：SEQ ID NO.30所述的氨基酸序列
(2)CDN16
H链：SEQ ID NO.42所述的氨基酸序列
L链：SEQ ID NO.52所述的氨基酸序列
(3)CDN27
H链：SEQ ID NO.62所述的氨基酸序列
L链：SEQ ID NO.72所述的氨基酸序列
(4)CDN28
H链：SEQ ID NO.82所述的氨基酸序列
L链：SEQ ID NO.92所述的氨基酸序列
(5)CDN35
H链：SEQ ID NO.102所述的氨基酸序列
L链：SEQ ID NO.112所述的氨基酸序列
(6)CDN38
H链：SEQ ID NO.165所述的氨基酸序列
L链：SEQ ID NO.177所述的氨基酸序列
作为上述小鼠-人嵌合抗体的一个例子，本发明的还提供小鼠-人嵌合抗体，该小鼠-人嵌合抗体是将CDN38的可变区与人恒定区连接得到的，含有含SEQ ID NO.175所述氨基酸序列的H链和含SEQ ID NO.187所述的氨基酸序列的L链。
抗体的可变区通常是由被4个支架(FR)夹持的3个互补决定区(CDR)构成。CDR是基本上决定抗体结合特异性的区域。CDR的氨基酸序列富于多样性。而构成FR的氨基酸序列在具有不同的结合特异性的抗体之间大多显示高同一性。因此，通常通过CDR的移植，可以将某种抗体的结合特异性移植到其它抗体中。
人源化抗体也称为重构人抗体。具体来说，公知的是将人以外的动物例如小鼠抗体的CDR移植到人抗体中所得的人源化抗体等。为获得人源化抗体而采用的常规的基因重组方法也是已知的。
具体来说，将小鼠的抗体的CDR移植到人FR中的方法例如公知重叠延伸PCR。重叠延伸PCR中，用于合成人抗体FR的引物中附加有编码要移植的小鼠抗体CDR的碱基序列。引物是对4个FR分别准备。通常在小鼠的CDR向人FR移植中，选择与小鼠的FR同一性高的人FR，这在保持CDR的功能方面有利。即，通常优选利用的人FR含有与要移植的小鼠CDR所相邻的FR的氨基酸序列同一性高的氨基酸序列。
连接的碱基序列被设计成互相符合读框地连接。由各引物分别合成人FR。结果，可得到在各FR上附加有编码小鼠CDR的DNA的产物。各产物编码的小鼠CDR的碱基序列被设计成互相重叠。接着，将以人抗体基因为模板合成的产物的重叠CDR部分互相退火，进行互补链合成反应。通过该反应，人FR经由小鼠CDR的序列连接。
最终3个CDR与4个FR连接而成的V区基因通过在其5’末端和3’末端退火并附加适当的限制酶识别序列所得的引物扩增其全长。上述得到的DNA和编码人抗体C区的DNA插入到表达载体中，通过符合读框融合，由此可制备人抗体表达用载体。将该掺入载体导入到宿主中，构建重组细胞，然后培养该重组细胞，使编码该人源化抗体的DNA表达，由此可在该培养细胞的培养物中生成该人源化抗体(参照欧洲专利公开EP239400、国际公开WO96/02576)。
对上述制备的人源化抗体与抗原的结合活性进行定性或定量测定并评价，由此可以适当选择在经由CDR连接时该CDR可形成良好的抗原结合部位的人抗体的FR。还可根据需要置换FR的氨基酸残基，使重构的人抗体CDR形成适当的抗原结合部位。例如，可应用在小鼠CDR移植到人FR中时所使用的PCR法，向FR中导入氨基酸序列的突变。具体来说，可以向在FR上退火的引物中导入部分碱基序列的突变。由上述引物合成的FR中可导入碱基序列的突变。按照上述方法对置换氨基酸得到的突变型抗体与抗原的结合活性进行测定并评价，由此可以选择具有所需性质的突变FR序列(Sato，K.等人，Cancer Res.1993，53，851-856)。
将具有人抗体基因的所有组成成分的转基因动物(参照国际公开WO93/12227、WO92/03918、WO94/02602、WO94/25585、WO 96/34096、WO96/33735)作为免疫动物，通过DNA免疫可获得所需的人抗体。并且还已知使用人抗体文库、通过淘选获得人抗体的技术。例如，可以将人抗体的V区作为单链抗体(scFv)，通过噬菌体展示法在噬菌体的表面表达，选择与抗原结合的噬菌体。通过分析所选择的噬菌体的基因，可以确定编码与抗原结合的人抗体的V区的DNA序列。确定了与抗原的scFv的DNA序列后，通过将该V区序列与所需人抗体的C区的序列在符合读框融合，然后插入到适当的表达载体中，由此可以制备表达载体。将该表达载体导入到上述例举的优选的表达细胞中，通过使编码该人抗体的基因表达，可以获得该人抗体。这些方法是已公知的(参照国际公开WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO 95/15388)。
本发明的单克隆抗体只要与紧密连接蛋白3蛋白结合即可，不仅是以IgG为代表的二价抗体，也包含一价抗体或以IgM为代表的多价抗体。本发明的多价抗体包含具有完全相同的抗原结合部位的多价抗体，或者是具有部分或全部不同的抗原结合部位的多价抗体。本发明的单克隆抗体不限于抗体的全长分子，只要与紧密连接蛋白3蛋白结合即可，可以是低分子化抗体或其修饰物。
低分子化抗体包含全长抗体(例如全长IgG等)的一部分缺损的抗体片段。只要具有与紧密连接蛋白3抗原的结合能力即可，允许抗体分子的部分缺损。本发明的抗体片段优选包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的其中之一或两者。VH或VL的氨基酸序列可以包含置换、缺失、附加和/或插入。并且，只要具有与紧密连接蛋白3抗原的结合能力即可，可以使VH和VL的其中一方或两者的一部分缺损。可变区还可以进行嵌合化或人源化。抗体片段的具体例子例如有Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv等。低分子化抗体的具体例子例如有Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv(单链Fv)、二价抗体(Diabody)、sc(Fv)2(单链(Fv)2)等。这些抗体的多聚体(例如二聚体、三聚体、四聚体、聚合物)也包含在本发明的低分子化抗体中。
抗体的片段可通过用酶处理抗体、生成抗体片段来获得。生成抗体片段的酶例如有公知的木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或纤溶酶等。或者构建编码这些抗体片段的基因，将其导入到表达载体中，然后在适当的宿主细胞中表达(例如参照Co，M.S等人，J.Immunol.(1994)152，2968-2976；Better，M.和Horwitz，A.H.，Methods in Enzymology(1989)178，476-496；Plueckthun，A和Skerra，A.，Methods in Enzymology(1989)178，476-496；Lamoyi，E.，Methods in Enzymology(1989)121，652-663；Rousseaux，J等人，Methods in Enzymology(1989)121，663-669；Bird，R.E.等人，TIBTECH(1991)9，132-137)。
消化酶可以切断抗体片段的特定位置，获得下述特定结构的抗体片段。对上述通过酶切获得的抗体片段采用基因工程的方法，则可以使抗体的任意部分缺失。
木瓜蛋白酶消化：F(ab)2或Fab
胃蛋白酶消化：F(ab’)2或Fab’
纤溶酶消化：Facb
因此，本发明中的低分子化抗体只要具有对紧密连接蛋白3的结合亲和性即可，可以是任意区域缺失的抗体片段。并且，特别是在本发明的对癌症等细胞增殖性疾病的治疗中，抗体希望保持其效应活性。即，本发明的优选的低分子化抗体具有与紧密连接蛋白3的结合亲和性和效应功能两者。抗体的效应功能包含ADCC活性和CDC活性。本发明的治疗用的抗体特别优选具备ADCC活性和CDC活性的其中一种或两者效应功能。
二价抗体是指通过基因融合构建的二价(二价体)的抗体片段(Holliger P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)；EP404,097号；WO 93/11161号)。二价抗体是由两条多肽链构成的二聚体。通常构成二聚体的多肽链分别是在同一链中VL和VH通过接头结合。二价抗体中的接头通常短到VL和VH互相无法结合。具体来说，构成接头的氨基酸残基例如为5个残基左右。因此，在同一多肽链上编码的VL和VH无法形成单链可变区片段，只能与其它单链可变区片段形成二聚体。结果二价抗体具有2个抗原结合部位。
scFv通过将抗体的H链V区和L链V区连接获得。在scFv中，H链V区和L链V区经由接头、优选肽接头连接(Huston，J.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1988，85，5879-5883)。scFv中的H链V区和L链V区可以来自本说明书中作为抗体记载的任意的抗体。连接V区的肽接头没有特别限定。例如可以使用含有3-25个残基左右的任意的单链肽作为接头。具体来说，例如可以使用后述的肽接头等。
V区例如可按照上述PCR法连接。为了通过PCR法进行V区的连接，首先在下述的DNA中，利用全部或者编码所需部分氨基酸序列的DNA作为模板：
编码上述抗体的H链或H链V区的DNA序列、以及
编码上述抗体的L链或L链V区的DNA序列
通过PCR法，分别扩增编码H链和L链的V区的DNA，该PCR法使用具有与要扩增的DNA的两端的序列对应的序列的一对引物。接着准备编码肽接头部分的DNA。编码肽接头的DNA也可利用PCR合成。此时可利用的引物的5’一侧可以附加可与另外合成的各V区的扩增产物连接的碱基序列。接着，利用[H链V区DNA]-[肽接头DNA]-[L链V区DNA]的各DNA和装配PCR用的引物进行PCR反应。
装配PCR用的引物包含在[H链V区DNA]的5’一侧退火的引物和在[L链V区DNA]的3’一侧退火的引物的组合。即，装配PCR用的引物是可扩增编码要合成的scFv全长序列的DNA的引物组。而[肽接头DNA]上可以附加可与各V区DNA连接的碱基序列。结果，这些DNA连接，进一步通过装配PCR用的引物，最终以扩增产物的形式生成scFv的全长。制备了编码scFv的DNA，则可以按照常规方法获得含有它们的表达载体以及通过该表达载体转化的重组细胞。另外，其结果，对得到的重组细胞进行培养，使编码该scFv的DNA表达，由此可获得该scFv。
sc(Fv)2是将2个VH和2个VL通过接头等结合，制成单链的低分子化抗体(Hudson等人，J.Immunol.Methods 1999；231：177-189)。sc(Fv)2例如可通过用接头将scFv连接来制备。
还优选具有如下特征的抗体：2个VH和2个VL以单链多肽的N末端一侧为基点，依次排列VH、VL、VH、VL([VH]接头[VL]接头[VH]接头[VL])。
2个VH和2个VL的顺序并不特别限定于上述配置，可以是任何顺序排列。例如有以下的配置：
[VL]-接头-[VH]-接头-[VH]-接头-[VL]
[VH]-接头-[VL]-接头-[VL]-接头-[VH]
[VH]-接头-[VH]-接头-[VL]-接头-[VL]
[VL]-接头-[VL]-接头-[VH]-接头-[VH]
[VL]-接头-[VH]-接头-[VL]-接头-[VH]
与抗体可变区结合的接头可以使用可通过遗传工程导入的任意的肽接头、或合成化合物接头(例如Protein Engineering，9(3)，299-305，1996)中公开的接头等。本发明中优选肽接头。肽接头的长度没有特别限定，可以根据目的由本领域技术人员适当选择。通常，构成肽接头的氨基酸残基为1-100个氨基酸，优选3-50个氨基酸，进一步优选5-30个氨基酸，特别优选12-18个氨基酸(例如15个氨基酸)。
构成肽接头的氨基酸序列只要不妨碍scFv的结合作用即可，可以采取任何序列。例如，肽接头可以利用下述氨基酸序列。
Ser
Gly·Ser
Gly·Gly·Ser
Ser·Gly·Gly
Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO.149)
Ser·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO.150)
Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO.151)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO.152)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO.153)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO.154)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO.155)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO.156)
(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO.157))n
(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO.158))n
[n为1以上的整数]
肽接头的氨基酸序列可以根据目的由本领域技术人员适当选择。例如，确定上述肽接头的长度的n通常为1-5，优选1-3，更优选1或2。
即而，本发明中特别优选的sc(Fv)2的方案例如有以下的sc(Fv)2：
[VH]-肽接头(15个氨基酸)-[VL]-肽接头(15个氨基酸)-[VH]-肽接头(15个氨基酸)-[VL]
或者利用合成化学物接头(化学交联剂)连接V区。也可在本发明中利用肽化合物等的交联中通常使用的交联剂。例如下述化学交联剂是公知的。这些交联剂有市售商品。
N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)
辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)
辛二酸双(硫代琥珀酰亚胺酯)(BS3)
二硫代双(琥珀酰亚胺丙酸酯)(DSP)
二硫代双(硫代琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DTSSP)
双(琥珀酰亚胺基琥珀酸)乙二醇酯(EGS)
双(硫代琥珀酰亚胺基琥珀酸)乙二醇酯(硫代-EGS)
二琥珀酰亚胺基酒石酸盐(DST)、二硫代琥珀酰亚胺基酒石酸盐(硫代-DST)、
双[2-(琥珀酰亚胺基氧基羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)和
双[2-(硫代琥珀酰亚胺基氧基羰基氧基)乙基]砜(硫代-BSOCOES)等。
结合有4个抗体可变区时，通常必须有3个接头。多个接头可以相同，也可以使用不同的接头。本发明中，优选的低分子化抗体是二价抗体或sc(Fv)2。为获得上述低分子化抗体，可以将抗体用酶例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等进行处理，生成抗体片段，或者构建编码这些抗体片段的DNA，将其导入到表达载体中，然后在适当的宿主细胞中表达(参照Co，M.S.等人，J.Immunol.(1994)152，2968-2976；Better，M.和Horwitz，A.H.，Methods Enzymol.(1989)178，476-496；Pluckthun，A.和Skerra，A.，Methods Enzymol.(1989)178，497-515；Lamoyi，E.，Methods Enzymol.(1986)121，652-663；Rousseaux，J.等人，Methods Enzymol.(1986)121，663-669；以及Bird，R.E.和Walker，B.W.，Trends Biotechnol.(1991)9，132-137)。
本发明的单克隆抗体包含识别紧密连接蛋白3并结合的任意的抗体。例如以下(1)-(61)中所述的抗体可作为优选的抗体例举。这些抗体例如可以是全长抗体、低分子化抗体、动物抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
(1)含有H链的抗体，该H链具有SEQ ID NO.12所述的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO.14所述的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ IDNO.16所述的氨基酸序列作为CDR3；
(2)含有(1)所述的H链的抗体，该H链具有SEQ ID NO.20所述的氨基酸序列的139-462号氨基酸序列作为CH；
(3)含有(1)所述的H链的抗体，该H链具有SEQ ID NO.22所述的氨基酸序列作为CH；
(4)含有L链的抗体，该L链具有SEQ ID NO.24所述的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO.26所述的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ IDNO.28所述的氨基酸序列作为CDR3；
(5)含有(4)所述的L链的抗体，该L链具有SEQ ID NO.32所述的氨基酸序列的135-240号氨基酸序列作为CL；
(6)含有(4)所述的L链的抗体，该L链具有SEQ ID NO.34所述的氨基酸序列作为CL；
(7)抗体，该抗体含有(1)所述的H链和(4)所述的L链；
(8)抗体，该抗体含有(2)所述的H链和(5)所述的L链；
(9)抗体，该抗体含有(3)所述的H链和(6)所述的L链；
(10)抗体，该抗体是在(1)-(9)中任一项所述的抗体中有1或多个氨基酸置换、缺失、附加和/或插入所得的抗体，与(1)-(9)中任一项所述的抗体具有同等的活性；
(11)含有H链的抗体，该H链具有SEQ ID NO.36所述的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO.38所述的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ IDNO.40所述的氨基酸序列作为CDR3；
(12)含有(11)所述的H链的抗体，该H链具有SEQ ID NO.44所述的氨基酸序列的140-476号氨基酸序列作为CH；
(13)含有(11)所述的H链的抗体，该H链具有SEQ ID NO.22所述的氨基酸序列作为CH；
(14)含有L链的抗体，该L链具有SEQ ID NO.46所述的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO.48所述的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ IDNO.50所述的氨基酸序列作为CDR3；
(15)含有(14)所述的L链的抗体，该L链具有SEQ ID NO.54所述的氨基酸序列的133-238号氨基酸序列作为CL；
(16)含有(14)所述的L链的抗体，该L链具有SEQ ID NO.34所述的氨基酸序列作为CL；
(17)抗体，该抗体含有(11)所述的H链和(14)所述的L链；
(18)抗体，该抗体含有(12)所述的H链和(15)所述的L链；
(19)抗体，该抗体含有(13)所述的H链和(16)所述的L链；
(20)抗体，该抗体是在(11)-(19)中任一项所述的抗体中有1或多个氨基酸置换、缺失、附加和/或插入所得的抗体，与(11)-(19)中任一项所述的抗体具有同等的活性；
(21)含有H链的抗体，该H链具有SEQ ID NO.56所述的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO.58所述的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ IDNO.60所述的氨基酸序列作为CDR3；
(22)含有(21)所述的H链的抗体，该H链具有SEQ ID NO.64所述的氨基酸序列的137-471号氨基酸序列作为CH；
(23)含有(21)所述的H链的抗体，该H链具有SEQ ID NO.22所述的氨基酸序列作为CH；
(24)含有L链的抗体，该L链具有SEQ ID NO.66所述的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO.68所述的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ IDNO.70所述的氨基酸序列作为CDR3；
(25)含有(24)所述的L链的抗体，该L链具有SEQ ID NO.74所述的氨基酸序列的133-238号氨基酸序列作为CL；
(26)含有(24)所述的L链的抗体，该L链具有SEQ ID NO.34所述的氨基酸序列作为CL；
(27)抗体，该抗体含有(21)所述的H链和(24)所述的L链；
(28)抗体，该抗体含有(22)所述的H链和(25)所述的L链；
(29)抗体，该抗体含有(23)所述的H链和(26)所述的L链；
(30)抗体，该抗体是在(21)-(29)中任一项所述的抗体中有1或多个氨基酸置换、缺失、附加和/或插入所得的抗体，与(21)-(29)中任一项所述的抗体具有同等的活性；
(31)含有H链的抗体，该H链具有SEQ ID NO.76所述的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO.78所述的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ IDNO.80所述的氨基酸序列作为CDR3；
(32)含有(31)所述的H链的抗体，该H链具有SEQ ID NO.84所述的氨基酸序列的140-463号氨基酸序列作为CH；
(33)含有(31)所述的H链的抗体，该H链具有SEQ ID NO.22所述的氨基酸序列作为CH；
(34)含有L链的抗体，该L链具有SEQ ID NO.86所述的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO.88所述的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ IDNO.90所述的氨基酸序列作为CDR3；
(35)含有(34)所述的L链的抗体，该L链具有SEQ ID NO.94所述的氨基酸序列的133-238号氨基酸序列作为CL；
(36)含有(34)所述的L链的抗体，该L链具有SEQ ID NO.34所述的氨基酸序列作为CL；
(37)抗体，该抗体含有(31)所述的H链和(34)所述的L链；
(38)抗体，该抗体含有(32)所述的H链和(35)所述的L链；
(39)抗体，该抗体含有(33)所述的H链和(36)所述的L链；
(40)抗体，该抗体是在(31)-(39)中任一项所述的抗体中有1或多个氨基酸置换、缺失、附加和/或插入所得的抗体，与(31)-(39)中任一项所述的抗体具有同等的活性；
(41)含有H链的抗体，该H链具有SEQ ID NO.96所述的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO.98所述的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ IDNO.100所述的氨基酸序列作为CDR3；
(42)含有(41)所述的H链的抗体，该H链具有SEQ ID NO.104所述的氨基酸序列的140-474号氨基酸序列作为CH；
(43)含有(41)所述的H链的抗体，该H链具有SEQ ID NO.22所述的氨基酸序列作为CH；
(44)含有L链的抗体，该L链具有SEQ ID NO.106所述的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO.108所述的氨基酸序列作为CDR2、和SEQID NO.110所述的氨基酸序列作为CDR3；
(45)含有(44)所述的L链的抗体，该L链具有SEQ ID NO.114所述的氨基酸序列的133-238号氨基酸序列作为CL；
(46)含有(44)所述的L链的抗体，该L链具有SEQ ID NO.34所述的氨基酸序列作为CL；
(47)抗体，该抗体含有(41)所述的H链和(44)所述的L链；
(48)抗体，该抗体含有(42)所述的H链和(45)所述的L链；
(49)抗体，该抗体含有(43)所述的H链和(46)所述的L链；
(50)抗体，该抗体是在(41)-(49)中任一项所述的抗体中有1或多个氨基酸置换、缺失、附加和/或插入所得的抗体，与(41)-(49)中任一项所述的抗体具有同等的活性；
(51)含有H链的抗体，该H链具有SEQ ID NO.167所述的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO.169所述的氨基酸序列作为CDR2、和SEQID NO.171所述的氨基酸序列作为CDR3；
(52)含有(51)所述的H链的抗体，该H链具有SEQ ID NO.173所述的氨基酸序列的118-447号氨基酸序列作为CH；
(53)含有(51)所述的H链的抗体，该H链具有SEQ ID NO.22所述的氨基酸序列作为CH；
(54)含有L链的抗体，该L链具有SEQ ID NO.179所述的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO.181所述的氨基酸序列作为CDR2、和SEQID NO.183所述的氨基酸序列作为CDR3；
(55)含有(54)所述的L链的抗体，该L链具有SEQ ID NO.185所述的氨基酸序列的113-218号氨基酸序列作为CL；
(56)含有(54)所述的L链的抗体，该L链具有SEQ ID NO.34所述的氨基酸序列作为CL；
(57)抗体，该抗体含有(51)所述的H链和(54)所述的L链；
(58)抗体，该抗体含有(52)所述的H链和(55)所述的L链；
(59)抗体，该抗体含有(53)所述的H链和(56)所述的L链；
(60)抗体，该抗体是在(51)-(59)中任一项所述的抗体中有1或多个氨基酸置换、缺失、附加和/或插入所得的抗体，与(51)-(59)中任一项所述的抗体具有同等的活性；
(61)抗体，该抗体与表位结合，该表位与(1)-(60)中任一项所述的抗体所结合的紧密连接蛋白3蛋白的表位相同。
本发明中，优选的单克隆抗体含有来自CDN04、CDN16、CDN27、CDN28、CDN35、CDN38的任意一种的、构成重链和轻链的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列作为CDR的氨基酸序列。这些单克隆抗体的CDR的氨基酸序列如下。因此，可变区含有由以下SEQ ID NO.所示的氨基酸序列形成的CDR的单克隆抗体优选作为本发明的单克隆抗体。例如，各单克隆抗体中，V区序列和全长氨基酸序列分别如以下所示SEQID NO.。含有这些氨基酸序列作为V区的单克隆抗体可以作为本发明的优选的单克隆抗体给出。
本发明的单克隆抗体除含有上述CDR的可变区之外，还可以含有恒定区。各单克隆抗体的含有恒定区的全长序列分别如上所述。并且，可以给出例如以下的来自人的氨基酸序列作为构成本发明的单克隆抗体的恒定区：
SEQ ID NO.21(人IgG1_CH序列)SEQ ID NO.33(人IgG1_CLkappa序列)
SEQ ID NO.22(人IgG1_CH序列)SEQ ID NO.34(人IgG1_CLkappa序列)
因此，在含有上述CDR1、2、3的可变区接合上述SEQ ID NO.所示的、含有来自人的氨基酸序列的恒定区所得的单克隆抗体是本发明中优选的单克隆抗体。可以例举上述(3)、(13)、(23)、(33)、(43)和(53)所述的单克隆抗体作为上述单克隆抗体。这些单克隆抗体可以分别含有上述(6)、(16)、(26)、(36)、(46)和(56)所述的轻链作为轻链。
上述(10)、(20)、(30)、(40)、(50)、(60)所述的抗体的优选方案是在CDR上未发生变异的抗体。其中的一个例子，上述(10)所述的抗体中，“在(1)所述的抗体中有1或多个氨基酸置换、缺失、附加和/或插入的抗体，是与(1)所述的抗体具有同等活性的抗体”的优选方案是“与(1)所述的抗体具有同等的活性，在(1)所述的抗体中有1或多个氨基酸置换、缺失、附加和/或插入的抗体，是含有H链的抗体，所述H链具有SEQ ID NO.12所述的氨基酸序列作为CDR1、SEQ ID NO.14所述的氨基酸序列作为CDR2、和SEQ ID NO.16所述的氨基酸序列作为CDR3”。上述(10)、(20)、(30)、(40)、(50)、(60)所述抗体中，其它的抗体的优选方案也可同样表现。
向多肽中导入突变的方法是用于制备与某种多肽功能性同等的多肽的、本领域常知的方法之一。例如本领域技术人员可采用位点专一性诱变法(Hashimoto-Gotoh，T等人(1995)Gene 152，271-275；Zoller，MJ和Smith，M.(1983)Methods Enzymol.100，468-500；Kramer，W等人(1984)Nucleic Acids Res.12，9441-9456；Kramer W和Fritz HJ(1987)Methods.Enzymol.154，350-367；Kunkel，TA(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82，488-492；Kunkel(1988)Methods Enzymol.85，2763-2766)等，向本发明的抗体中适当导入突变，由此可制备与该抗体功能性同等的抗体。氨基酸的突变在自然界中也发生。如上所述，本发明的抗体的氨基酸序列中，具有1或多个氨基酸发生了突变的氨基酸序列、与该抗体功能性同等的抗体也包含在本发明的抗体中。
上述突变体中的突变的氨基酸数目通常在50个氨基酸以内，优选30个氨基酸以内，进一步优选10个氨基酸以内(例如5个氨基酸以内)。
突变的氨基酸残基中，优选突变为氨基酸支链的性质得到保存的其它的氨基酸。例如根据氨基酸支链的性质，确立了下述分类。
疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)
亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)
具有脂族支链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)
具有含羟基的支链的氨基酸(S、T、Y)
具有含硫原子的支链的氨基酸(C、M)
具有含羧酸和酰胺的支链的氨基酸(D、N、E、Q)
具有含碱基的支链的氨基酸(R、K、H)
具有含芳族支链的氨基酸(H、F、Y、W)
(括号内均表示氨基酸的单字母标记)
我们已经了解，具有对于某种氨基酸序列有1或多个氨基酸残基的缺失、附加和/或通过其它氨基酸的置换而被修饰的氨基酸序列的多肽可以保持其生物学活性(Mark，D.F等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，5662-5666；Zoller，M.J.和Smith，M.Nucleic Acids Research(1982)10，6487-6500；Wang，A等人，Science 224，1431-1433；Dalbadie-McFarland，G等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79，6409-6413)。即，通常在构成某种多肽的氨基酸序列中，被分类为各组的氨基酸在相互置换时，保持该多肽的活性的可能性高。本发明中，将上述氨基酸组的组内氨基酸之间的置换称为保存性置换。
本发明还提供一种抗体，该抗体与表位结合，该表位与本发明中公开的单克隆抗体所结合的表位相同。即，本发明涉及识别与本发明的单克隆抗体所识别的表位相同表位的抗体及其用途。上述抗体例如可通过以下方法获得。
受试抗体与表位结合，且该表位与某种抗体所结合的表位相同，即，与某种抗体共有表位，这可以通过两者对相同表位的竞争来确认。本发明中，抗体之间的竞争可通过FACS或交叉阻断测定等来检测。FACS中，首先将本发明的单克隆抗体与表达紧密连接蛋白3的细胞结合，测定荧光信号。接着，在候补的竞争抗体反应后，将本发明的单克隆抗体与同样的细胞反应，同样通过FACS分析。或者将本发明的单克隆抗体和受试竞争抗体同时与相同细胞反应。竞争抗体反应时，如果本发明的单克隆抗体的FACS分析图谱变化，则可确认竞争抗体识别与本发明的单克隆抗体相同的表位。
除此之外，例如竞争ELISA测定是优选的交叉阻断测定。具体来说，在交叉阻断测定中，在微量滴定板的孔上固定表达紧密连接蛋白3蛋白的细胞。在候补的竞争抗体的存在下或非存在下进行预温育，然后添加本发明的单克隆抗体。孔中的与紧密连接蛋白3蛋白表达细胞结合的本发明的单克隆抗体的量与候补竞争抗体(受试抗体)的结合能力成逆相关，该候补竞争抗体对于与相同表位的结合是竞争性的。即，受试抗体与同一表位的亲和性越大，则本发明的单克隆抗体与固定了紧密连接蛋白3蛋白表达细胞的孔的结合量低。或者相反，受试抗体与同一表位的亲和性越大，则受试抗体与固定有紧密连接蛋白3蛋白表达细胞的孔的结合量增加。
与孔结合的抗体量可通过预先标记抗体而容易地测定。例如，生物素标记的抗体可通过使用抗生物素蛋白过氧化物酶接合物和适当的底物来测定。将利用过氧化物酶等酶标记的交叉阻断测定特别称为竞争ELISA测定。抗体可用可检测或测定的其它标记物标记。具体来说，放射标记或荧光标记等是公知的。
并且，受试抗体具有来自与本发明的单克隆抗体不同种的恒定区时，可以通过特异性识别来自任意种的恒定区的标记抗体来测定与孔结合的任意的抗体。或者即使是来自同种的抗体而类不同时，通过特异性识别各类的抗体可以测定与孔结合的抗体。
与在候补的竞争抗体非存在下实施的对照实验所得到的结合活性相比，候补抗体如果至少可以阻断20％、优选至少20-50％、进一步优选至少50％的本发明的单克隆抗体的结合，则该候补竞争抗体与本发明的单克隆抗体基本上相同的表位结合，或者是对与相同表位结合进行竞争的抗体。
与同单克隆抗体所结合的表位相同的表位结合的抗体例如有上述(61)所述的抗体。
如上所述，上述(1)-(61)所述的抗体中不仅含有一价抗体，也含有多价抗体。本发明的多价抗体包含具有完全相同的抗原结合部位的多价抗体或具有部分或完全不同的抗原结合部位的多价抗体。
抗体的修饰物可以使用与聚乙二醇(PEG)等各种分子结合的抗体。抗体中可以结合化疗药物、毒性肽或放射性化学物质等。上述抗体修饰物(以下称为抗体接合物)可通过对所得抗体实施化学修饰来获得。抗体的修饰方法在该领域中已经确立。如后所述，可以以双特异性抗体等的分子型的形式获得，该双特异性抗体等的分子型是采用基因重组技术，设计成不仅识别紧密连接蛋白3蛋白，也识别化疗药物、毒性肽或放射性化学物质等得到的。本发明中的“抗体”也包含这些抗体。
与本发明的单克隆抗体结合并发挥细胞毒活性功能的化疗药物可例举以下的化疗药物。
氮尿苷、阿那曲唑、5-氮杂胞苷、博来霉素、硼替佐米(bortezomib)、薯司他丁-1、白消安、喜树碱、羟基喜树碱、卡莫司汀、西乐葆、苯丁酸氮芥、顺铂、伊立替康、卡铂、克拉屈滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、多西他赛、放线菌素D、柔红霉素葡糖苷酸、柔红霉素、地塞米松、己烯雌酚、阿霉素、阿霉素葡糖苷酸、表柔比星、炔雌醇、雌莫司汀、依托泊苷、依托泊苷葡糖苷酸、氟尿苷、氟达拉滨、氟他胺、氟尿嘧啶、氟甲睾酮、吉西他滨、己酸羟孕酮、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、亚叶酸、洛莫氮芥、氮芥(mechlorethamine)、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、美法仑、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、光辉霉素、丝裂霉素、米托坦、丁酸苯酯、泼尼松、丙卡巴肼、紫杉醇、喷司他丁、司莫司汀链脲霉素、他莫昔芬、紫杉烷类(taxanes)、紫素、丙酸睾酮、沙立度胺、硫鸟嘌呤、噻替哌、替尼泊苷、拓扑替康、尿嘧啶氮芥、长春碱、长春烯碱、长春新碱
本发明中，优选的化疗药物是低分子的化疗药物。低分子的化疗药物与抗体结合之后，干扰抗体功能的可能性低。本发明中，低分子的化疗药物通常具有100-2000、优选200-1000的分子量。这里所例举的化疗药物均为低分子的化疗药物。这些本发明中使用的化疗药物也包含在生物体内转换为活性化疗药物的前药。前药的活化可以是酶性转换、也可以是非酶性转换。
1.另外，也可以用蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶、豹蛙酶(onconase)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素A(Staphylococcalenterotoxin-A)、美洲商陆抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein)、截短型细胞毒素(gelonin)、白喉毒素、假单胞菌外毒素、假单胞菌内毒素、L-天冬酰胺酶、PEG L-天冬酰胺酶等的毒性肽修饰抗体。在另一方案中，将一或两种以上的低分子化疗药物与毒性肽分别组合，可以用于抗体的修饰。单克隆抗体与上述低分子化疗药物的结合可利用共价键或非共价键。结合了这些化疗药物的抗体的制备方法是公知的。
并且，蛋白质性的药物或毒素可以通过基因工程的方法与抗体结合。具体来说，例如将编码上述毒性肽的DNA与编码本发明的单克隆抗体的DNA进行符合读框融合，可以构建掺入到表达载体中的重组载体。将该载体导入到适当的宿主细胞中，培养由此得到的转化细胞，使掺入的DNA表达，可以以融合蛋白质的形式获得结合了毒性肽的抗紧密连接蛋白3抗体。获得与抗体的融合蛋白时，通常在抗体的C末端一侧配置蛋白质性的药物或毒素。抗体与蛋白质性的药物或毒素之间可以存在肽接头。
本发明的单克隆抗体还可以是双特异性抗体。双特异性抗体是指在同一抗体分子内具有识别不同表位的可变区的抗体。本发明中，双特异性抗体可以具有识别紧密连接蛋白3分子上的不同表位的抗原结合部位。上述双特异性抗体相对1个分子的紧密连接蛋白3可以结合2个分子的抗体分子。结果，有望实现更为强烈的细胞毒作用。
或者，可以制成一个抗原结合部位识别紧密连接蛋白3，另一个抗原结合部位识别细胞毒性物质的双特异性抗体。细胞毒性物质具体来说包含化疗药物、毒性肽或放射性化学物质等。上述双特异性抗体与表达紧密连接蛋白3的细胞结合，同时捕获细胞毒性物质。结果，可以使细胞毒性物质直接作用于表达紧密连接蛋白3的细胞。即，通过识别细胞毒性物质的双特异性抗体，可以特异性毒害肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞的增殖。
本发明中，可以将识别紧密连接蛋白3以外的抗原的双特异性抗体组合。例如可以组合下述双特异性抗体：识别与紧密连接蛋白3同样是在作为靶的癌细胞的细胞表面特异性表达、但与紧密连接蛋白3不同的抗原的双特异性抗体。
制备双特异性抗体的方法是公知的。例如，可将识别抗原不同的2种抗体结合，制备双特异性抗体。所结合的抗体可以是分别具有H链和L链的1/2分子，也可以是只含有H链的1/4分子。或者是使生成不同的单克隆抗体的杂交瘤融合，制备生成双特异性抗体的融合细胞。还可以通过基因工程的方法制备双特异性抗体。
如上所述构建的抗体基因可通过公知的方法表达并获得。为哺乳类细胞时，可以在常用的有效启动子、要表达的抗体基因、其3’一侧下游功能性结合poly A信号并使其表达。例如，启动子/增强子有：人巨细胞病毒早期启动子/增强子。
除此之外，为了抗体的表达，还可以使用病毒启动子/增强子、或者人延长因子1α(HEF1α)等来自哺乳类细胞的启动子/增强子等。可以利用启动子/增强子的病毒具体有：反转录病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿猴病毒40(SV40)等。
使用SV40启动子/增强子时，可利用Mulligan等人的方法(Nature(1979)277，108)。另外，HEF1α启动子/增强子可通过Mizushima等人的方法(Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)容易地应用于目标基因表达。
为大肠杆菌时，可以将常用的有效启动子、用于抗体分泌的信号序列和要表达的抗体基因功能性结合，表达该基因。启动子例如有：lacZ启动子、araB启动子。使用lacZ启动子时，可利用Ward等人的方法(Nature(1989)341，544-546；FASEB J.(1992)6，2422-2427)。或者araB启动子通过Better等人的方法(Science(1988)240，1041-1043)应用于目标基因的表达。
用于抗体分泌的信号序列在大肠杆菌的周质中生成时，可以使用pelB信号序列(Lei，S.P等人，J.Bacteriol.(1987)169，4379)。将在周质中生成的抗体进行分离，然后通过使用如尿素的胍盐酸盐等的蛋白质改性剂，可以重新改正抗体结构，使其具有所需结合活性。
插入到表达载体中的复制起源可以使用来自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV)等起源的。为了在宿主细胞系统中扩增基因拷贝数，可以在表达载体中插入选择标记。具体来说可利用如下选择标记：氨基葡糖苷转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等。
为了制备本发明的单克隆抗体，可以使用任意的表达系统、例如真核细胞或原核细胞系统。真核细胞例如有建立的哺乳类细胞系、昆虫细胞系、丝状真菌细胞或酵母细胞等动物细胞等。原核细胞例如有大肠杆菌细胞等细菌细胞。本发明的单克隆抗体优选使用哺乳类细胞表达。哺乳类细胞例如可以利用CHO、COS、骨髓瘤、BHK、Vero、Hela细胞等。
接着，在体外或体内培养转化的宿主细胞，生成目标抗体。宿主细胞的培养可按照公知的方法进行。例如可使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM作为培养液，可以结合使用胎牛血清(FCS)等的血清补液。
如上所述表达并生成的抗体通过单独采用在通常的蛋白质纯化中使用的公知的方法、或者适当组合进行纯化。例如，通过适当选择蛋白A柱等亲和柱、色谱柱、滤器、超滤、盐析、透析等并组合，可以分离并纯化抗体(Antibodies A Laboratory Manual.Ed Harlow，David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。
抗体与抗原的结合活性(Antibodies A Laboratory Manual.Ed Harlow，David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)的测定可采用公知的方法。例如可采用ELISA(酶联免疫吸附检测法)、EIA(酶联免疫测定法)、RIA(放射免疫测定法)或荧光免疫法等。
本发明的单克隆抗体可以是糖链变异的抗体。已知通过使抗体的糖链变异，可以增强抗体的细胞毒活性。糖链变异的抗体例如公知有下述抗体：
修饰为葡糖基化的抗体(WO99/54342等)、
糖链上附加的果糖缺损的抗体(WO00/61739、WO02/31140等)、
具有糖链的抗体，该糖链具有平分型GlcNAc(WO02/79255等)等。
本发明的单克隆抗体优选为具有细胞毒活性的抗体。
本发明的细胞毒活性例如有：抗体依赖性细胞介导性细胞毒(ADCC)活性、补体依赖性细胞毒(CDC)活性等。本发明中，CDC活性是指通过补体系统产生的细胞毒活性。而ADCC活性是在特异性的抗体附着于靶细胞的细胞表面抗原上时，保有Fcγ受体的细胞(免疫细胞等)经由Fcγ受体与其Fc部分结合，使靶细胞获得毒活性。
本发明中，单克隆抗体是否具有ADCC活性或者是否具有CDC活性可通过公知的方法测定(例如Current Protocols in Immunology，7章.人类的免疫学研究，Editor，John E.Coligan等人，John Wiley & Sons，Inc.，(1993)等)。
具体来说，首先实施效应细胞、补体溶液、靶细胞的制备。
(1)效应细胞的制备
从CBA/N小鼠等中摘除脾脏，在RPMI1640培养基(Invitrogen制备)中分离脾细胞。用含有10％胎牛血清(FBS，HyClone制备)的相同培养基清洗，然后将细胞浓度调节至5×106/mL，由此可制备效应细胞。
(2)补体溶液的制备
将幼兔补体(CEDARLANE制备)用含10％FBS的培养基(Invitrogen制备)稀释10倍，可制备补体溶液。
(3)靶细胞的制备
将表达紧密连接蛋白3蛋白的细胞与0.2mCi的51Cr-铬酸钠(GEヘルスケアバイオサイエンス制备)一起在含10％FBS的DMEM培养基中、在37℃下培养1小时，由此可以对该靶细胞进行放射性标记。表达紧密连接蛋白3蛋白的细胞可以利用由编码紧密连接蛋白3蛋白的基因转化的细胞、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌和结肠癌细胞等。放射性标记后，用含10％FBS的RPMI1640培养基将细胞清洗3次，将细胞浓度制备为2×105/mL，由此可以制备该靶细胞。
ADCC活性或CDC活性可按照下述方法测定。测定ADCC活性时，分别向96孔U底板(Becton Dickinson制备)中添加50μL的靶细胞和抗紧密连接蛋白3抗体，在冰上反应15分钟。然后加入100μL效应细胞，在二氧化碳培养箱内培养4小时。抗体的终浓度为0或10μg/mL。培养后回收100μL的上清，通过γ射线计数仪(COBRAII AUTO-GAMMA，型号D5005，Packard Instrument Company制备)测定放射活性。细胞毒活性(％)可使用所得的值，按照(A-C)/(B-C)×100的计算式计算。A表示各试样的放射活性(cpm)，B表示加入1％NP-40(Nacalai Tesque制备)试样后的放射活性(cpm)，C表示只含有靶细胞的试样的放射活性(cpm)。
进行CDC活性测定时，分别向96孔平底板(Becton Dickinson制备)中加入50μL靶细胞和抗紧密连接蛋白3抗体，在冰上反应15分钟。然后加入100μL补体溶液，在二氧化碳培养箱内培养4小时。抗体的终浓度为0或3μg/mL。培养后回收100μL的上清，通过γ射线计数仪测定放射活性。细胞毒活性与ADCC活性测定同样计算。
另一方面，测定抗体接合物产生的细胞毒活性时，分别向96孔平底板(Becton Dickinson制备)中添加50μL靶细胞和抗紧密连接蛋白3抗体接合物，在冰上反应15分钟。在二氧化碳培养箱内培养1-4小时。抗体的终浓度为0或3μg/mL。培养后回收100μL的上清，通过γ射线计数仪测定放射活性。细胞毒活性可以与ADCC活性的测定同样计算。
本发明中，单克隆抗体抑制其增殖的细胞只要是表达紧密连接蛋白3蛋白的细胞即可，没有特别限定。优选的表达紧密连接蛋白3的细胞例如为癌细胞。更优选卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌和结肠癌细胞。因此，抗紧密连接蛋白3抗体可用于起因于细胞增殖的疾病、例如卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌和结肠癌等的治疗、预防的目的。
药物组合物
在另外一个观点中，本发明提供药物组合物，该药物组合物含有与紧密连接蛋白3蛋白结合的单克隆抗体作为有效成分。本发明还涉及抗癌药，该抗癌药含有与紧密连接蛋白3蛋白结合的单克隆抗体作为有效成分。本发明的细胞增殖抑制剂和抗癌药优选给予罹患了癌症的对象或可能复发的对象。
本发明中，含有与紧密连接蛋白3蛋白结合的单克隆抗体作为有效成分的抗癌药可以表现为包含将与紧密连接蛋白3蛋白结合的抗体给予对象的步骤的预防或治疗癌症的方法；或者是与紧密连接蛋白3蛋白结合的单克隆抗体在抗癌药的制备中的应用。
本发明中，“含有与紧密连接蛋白3蛋白结合的单克隆抗体作为有效成分”是指含有抗紧密连接蛋白3单克隆抗体作为主要的活性成分，并不限制单克隆抗体的含有率。
本发明的药物组合物或抗癌药中，可以根据需要进一步配合多种单克隆抗体。例如，通过制成与紧密连接蛋白3结合的多种单克隆抗体的鸡尾酒，可能强化对表达紧密连接蛋白3的细胞的细胞毒作用。或者除了与紧密连接蛋白3结合的抗体之外，通过配合识别其它肿瘤相关抗原的抗体，可以提高治疗效果。
本发明的药物组合物(例如细胞增殖抑制剂、抗癌药。以下也相同)中含有的单克隆抗体只要与紧密连接蛋白3蛋白结合即可，没有特别限定，可例举本说明书中所述的抗体。
本发明的药物组合物或抗癌药可通过口服、非口服给予的任意方法给予患者。优选非口服给予。所述给予方法具体有：注射给予、经鼻给予、经肺给予、透皮给予等。作为注射给予的例子，例如可通过静脉注射、肌内注射、腹腔内注射、皮下注射等，使本发明的药物组合物全身或局部给予。可以根据患者的年龄、症状选择适当的给予方法。给予量例如每次的给予可以是1kg体重在0.0001mg-1000mg的范围内选择给予量。或者例如每位患者在0.001-100000mg/个体的范围内选择给予量。但是，本发明的药物组合物并不受这些给予量的限定。
本发明的药物组合物可以按照常规方法制成制剂(例如Remington’sPharmaceutical Science，latest edition，Mark Publishing Company，Easton，U.S.A)，可以共同含有药物所接受的载体或添加物。例如有：表面活性剂、赋型剂、着色剂、香味剂、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、混悬剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂等。并不受这些限定，可以适当使用其它常用的载体。具体的载体有：轻质硅酸酐、乳糖、结晶纤维素、甘露糖醇、淀粉、羟甲基纤维素钙、羟甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、聚乙烯基缩醛二乙基氨基乙酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、蔗糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐类等。
本发明提供通过使表达紧密连接蛋白3的细胞同与紧密连接蛋白3蛋白结合的单克隆抗体接触，来对表达紧密连接蛋白3的细胞引发毒性的方法；或抑制细胞增殖的方法。与紧密连接蛋白3蛋白结合的单克隆抗体作为本发明的细胞增殖抑制剂中含有的与紧密连接蛋白3蛋白结合的抗体如上所述。抗紧密连接蛋白3抗体所结合的细胞只要是表达紧密连接蛋白3的细胞即可，没有特别限定。本发明的优选的表达紧密连接蛋白3的细胞是癌细胞。具体来说，卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌和结肠癌细胞适合作为本发明的表达紧密连接蛋白3的细胞。
本发明中，“接触”是例如通过向在试管内培养的表达紧密连接蛋白3的细胞的培养液中添加抗体而进行的。这种情况下，所添加的抗体的形状可以适当采用溶液或通过冷冻干燥等得到的固体等的形状。以水溶液的形式添加时，可以是只含有纯粹的抗体的水溶液，例如可以是含有上述表面活性剂、赋型剂、着色剂、香味剂、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、混悬剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂等的溶液。所添加的浓度没有特别限定，培养液中的终浓度优选在1pg/mL-1g/mL的范围，更优选1ng/mL-1mg/mL，进一步优选1μg/mL-1mg/mL。
本发明中，“接触”进而在又一方案中可通过给予体内移植了表达紧密连接蛋白3的细胞的非人动物、或具有内源性表达紧密连接蛋白3的癌细胞的动物来进行。给予方法可通过口服、非口服给予的任何方式实施。特别优选非口服给予的给予方法，所述给予方法具体有注射给予、经鼻给予、经肺给予、透皮给予等。注射给予的例子例如可以是通过静脉注射、肌内注射、腹腔内注射、皮下注射等，全身或局部给予本发明的药物组合物细胞增殖抑制剂和抗癌药。还可根据受试动物的年龄、症状等选择适当的给予方法。以水溶液的形式给予时，可以是只含有纯粹的抗体的水溶液，例如可以是含有上述表面活性剂、赋型剂、着色剂、香味剂、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、混悬剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂等的溶液。给予量例如是在每次的给予中、对于1kg体重可以在0.0001mg-1000mg的范围内选择给予量。或者例如每位患者在0.001-100000mg/个体的范围内选择给予量。但是，本发明的抗体的给予量并不限于这些给予量。
通过抗紧密连接蛋白3抗体的接触来评价或测定表达紧密连接蛋白3的细胞中引发的细胞毒的方法优选采用以下的方法。在试管中进行该细胞毒活性的评价或测定的方法有：上述抗体依赖性细胞介导性细胞毒(ADCC)活性、补体依赖性细胞毒(CDC)活性等的测定方法。抗紧密连接蛋白3抗体是否具有ADCC活性或是否具有CDC活性，可通过公知的方法测定(例如Current protocols in Immunology，7章.人类的免疫学研究，Editor，John E.Coligan等人，John Wiley & Sons，Inc.，(1993)等)。活性测定时，与抗紧密连接蛋白3抗体同样地使用具有与紧密连接蛋白3抗体相同的同型、但不具有该细胞毒活性的结合抗体作为对照抗体，通过抗紧密连接蛋白3抗体显示比对照抗体强的细胞毒活性来判断活性。
抗体的同型由该抗体的氨基酸序列的H链恒定区的序列规定。在生物体内，通过在生成抗体的B细胞成熟时发生的染色体上的基因重组而产生的类别转换最终确定抗体的同型。同型的不同反映为抗体的生理、病理机能的不同。具体来说，例如已知细胞毒活性的强度与抗原的表达量一起受到抗体的同型影响。因此，上述所述细胞毒活性测定时，作为对照使用的抗体优选使用与受试抗体相同的同型。
为了在生物体内评价或测定细胞毒活性，例如将表达紧密连接蛋白3的癌细胞移植到非人受试动物的皮内或皮下，然后由当天或第二天起每天或间隔数天将受试抗体给予静脉或腹腔内。每天测定肿瘤的大小，由此可确定细胞毒活性。与试管内的评价同样，给予具有同一亚型的对照抗体，抗紧密连接蛋白3抗体给予组中肿瘤大小比对照抗体给予组中肿瘤的大小显著减小，由此可判定细胞毒活性。使用小鼠作为非人受试动物时，优选使用胸腺遗传缺损、其T淋巴细胞功能缺失的裸(nu/nu)小鼠。通过使用该小鼠评价所给予的抗体的细胞毒活性进行评价、测定时，可以排除受试动物中T淋巴细胞的参与。
通过抗紧密连接蛋白3抗体的接触评价或测定对表达紧密连接蛋白3的细胞的增殖的抑制效果的方法可以优选采用同位素标记的胸苷向细胞中的摄取的测定或者MTT法。
生物体内评价或测定细胞增殖抑制活性的方法可以优选采用与上述所述的生物体内评价或测定细胞毒活性的方法相同的方法。
本说明书中引用的所有的现有技术文献均作为参照援引到本说明书中。
实施例
以下通过实施例详细说明本发明，这些实施例并不限于本发明。
[实施例1]基因克隆和强制表达细胞的制备
克隆人紧密连接蛋白3、紧密连接蛋白1、紧密连接蛋白4、紧密连接蛋白6和小鼠紧密连接蛋白3的基因，制备哺乳动物细胞表达载体，建立强制表达细胞。以各自的GenBank参照序列为基础制备引物，以基因表达组织cDNA文库作为模板，分别进行基因的PCR扩增，分离目标基因。通过DNA序列分析确认所得基因的序列。在基因克隆中使用的引物、cDNA文库(クロ一ンテツク制备的マラソンcDNA文库)如表1所示。
将所得各基因掺入到通过小鼠CMV启动子转录的表达载体中，制备哺乳动物表达载体。表达载体构建中使用的cDNA碱基序列如SEQ IDNO.1、3、5、7、9所示。这些表达载体除了人和小鼠的紧密连接蛋白3，均是在重组蛋白的C末端附加编码FLAG标志的碱基序列。通过电穿孔法将表达载体导入到以下的细胞株中。Ba/F3是来自小鼠的淋巴细胞的癌细胞株。而DG44是来自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的二氢叶酸还原酶缺损(dhfr-)株。各转化细胞是使用表达载体的选择标记——遗传霉素(Geneticin)(Invitrogen制备)来进行选择。
Ba/F3(理化学研究所生物资源中心制备，细胞编号RCB0805)
DG44(Invitrogen制备，12613014)
遗传霉素抗性株中的重组蛋白质表达的有无可通过SDS-PAGE·蛋白质印迹法检测。利用在蛋白质C末端遗传工程学附加的FLAG序列作为表达标志，通过抗FLAG M2抗体(Sigma制备)检测人紧密连接蛋白1、紧密连接蛋白4、紧密连接蛋白6蛋白。人和小鼠紧密连接蛋白3蛋白表达通过抗紧密连接蛋白3抗体(Zymed，34-1700)检测。分别筛选确认有高蛋白质表达量的克隆，培养保持细胞，用于以后的分析。
[实施例2]抗紧密连接蛋白3单克隆抗体杂交瘤的建立
通过使用Helios基因枪系统(Bio-Rad制备)的DNA免疫法免疫小鼠，建立生成抗紧密连接蛋白3单克隆抗体的杂交瘤。
首先，用于DNA免疫的表达载体如下构建。通过PCR，从肾cDNA文库(Clontech制备)中扩增人紧密连接蛋白3的cDNA。PCR使用LA TaqDNA聚合酶反应溶液(Takara)。cDNA扩增用的引物使用克隆引物1、克隆引物2(表1表示)。将扩增的cDNA片段掺入到pGEM-T Easy载体中，确定碱基序列。通过EcoRI切取含有紧密连接蛋白3的cDNA片段，将该片段掺入到作为动物细胞表达载体的pMC的EcoRI位点，得到DNA免疫用的表达载体(人紧密连接蛋白3全长表达载体)。人紧密连接蛋白3全长表达载体的碱基序列如SEQ ID NO.159所示。SEQ ID NO.159的碱基序列中，836-1498碱基的碱基序列编码紧密连接蛋白3的氨基酸序列。
金-DNA(人紧密连接蛋白3全长表达载体)颗粒在外筒管上的涂布是按照Helios基因枪的操作手册进行。测取50mg 1.0μm的金颗粒，用0.1mL 0.05M亚精胺溶液悬浮并混合，加入0.1mL 1mg/mL的质粒溶液，涡轮搅拌。进一步加入0.1mL 1M CaCl2，放置10分钟，轻轻离心后除去上清，用乙醇悬浮并离心。将乙醇的脱水操作重复3次，然后最终悬浮于6mL 0.05mg/mL聚乙烯基吡咯烷酮/乙醇溶液中。将该溶液吸入到涂布用管中，涂布管并干燥，用管切刀切成0.5英寸的长度。
对达到4-5周龄的小鼠(日本チヤ一ルスリバ一，MRL/MpJ-Tnfrsf6lpr/Crlj)以1-3次/周的间隔进行DNA免疫(最高200psi氦压)，该期间断续地进行血清中抗紧密连接蛋白3抗体滴度的监测。对于确认其血清抗体滴度升高的个体，将紧密连接蛋白3强制表达细胞株(5×106个细胞/每只)给予腹腔内。饲养2-3天后摘除脾脏，分离含有抗体生成细胞的单核细胞。将来自脾脏的细胞用P3-X63Ag8U.1(ATCCCRL-1597)以约2∶1的比例混合，缓慢加入PEG1500(Roche Diagnostics制备)，由此进行细胞融合。小心地加入RPMI1640培养基(GIBCO BRL制备)，稀释PEG1500，通过离心操作除去PEG1500。然后将含有下述组成的RPMI1640培养基(以下称为HAT培养基)播种于96孔培养板中，浓度为200μL/孔，在37℃、5％CO2下大约培养1周。
10％FBS
1×HAT培养基添加液(SIGMA制备)、和
0.5×BM-CondimedH1杂交瘤克隆添加液(Roche Diagnostics制备)
通过显微镜下确认杂交瘤集落的形成，然后通过使用紧密连接蛋白3强制表达细胞的流式细胞术筛选培养上清中是否有紧密连接蛋白3结合抗体。与强制表达细胞结合的小鼠抗体使其与FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体(Beckman Coulter制备)结合，使用FASCalibur(BectonDickinson)检测。在强制表达细胞和非重组的母株的比较中，确认了抗体与紧密连接蛋白3的结合选择性的阳性孔的杂交瘤通过极限稀释法进行克隆。
通过腹腔内给予紧密连接蛋白3强制表达细胞进行免疫的小鼠中几乎无法获得生成紧密连接蛋白3结合性抗体的杂交瘤。而预先进行DNA免疫后腹腔内给予紧密连接蛋白3强制表达细胞的小鼠中，可以高效率获得生成紧密连接蛋白3结合性抗体的杂交瘤。
克隆的杂交瘤所生产的抗体亚型通过小鼠单克隆抗体分型试剂盒(Roche Diagnostics制备)进行分析。
为了纯化单克隆抗体，通过使用FBS、Ultra low IgG(Invitrogen)制备的HAT培养基培养杂交瘤，回收其上清。属于亚型IgG1、IgG2a、以及IgG2b的抗体是使用HiTrap ProteinG HP(Amersham Biosciences制备)，按照制备者的指示纯化。属于亚型IgG3和IgM的抗体是使用ProteinL琼脂糖(Sigma)柱，按照与Protein G同样的条件纯化。洗脱组分是使用PD-10柱(Amersham Biosciences制备)置换成PBS，然后超滤浓缩，在4℃下保存。纯化抗体的浓度通过以小鼠IgG为标准的Bradford法计算。
[实施例3]单克隆抗体的结合特异性分析
在人染色体上存在24种紧密连接蛋白基因家族。在氨基酸全长区域内与紧密连接蛋白3同源性高的分子是紧密连接蛋白4。为了掌握通过单克隆抗体识别的细胞表面表位的重复度和特异性特征，制作了紧密连接蛋白3的预想胞外区部分序列和与其相当的同源性高的家族分子序列的分群以及序列比对图(图1)。在胞外环1区中同源性最高的家族分子是紧密连接蛋白4(51个残基中48个残基相同)。接着是紧密连接蛋白6以及紧密连接蛋白9(51个残基中的41个残基相同)与紧密连接蛋白3的同一性高。胞外环2区与胞外环1区相比，同源性不太高(紧密连接蛋白6和紧密连接蛋白8是22个残基中有15个残基同一)。人-小鼠种间的紧密连接蛋白3序列保存性高，胞外环1区显示46/51残基，环2区显示22/23残基的同一性(图2)。
为了验证单克隆抗体的特异性、对表位进行分类，通过流式细胞术，与人紧密连接蛋白3强制表达细胞一起，对与同一性高的、以下的紧密连接蛋白家族分子的强制表达细胞的结合活性进行评价。
小鼠紧密连接蛋白3、
人紧密连接蛋白1、
人紧密连接蛋白4、和
人紧密连接蛋白6
向各强制表达细胞中添加单克隆抗体，在4℃下温育30分钟。温育后的细胞用含有1％胎牛血清的PBS溶液清洗1次，接着添加稀释为150倍的FITC-山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体(Beckman Coulter制备)，进一步在4℃下温育30分钟。每个细胞的结合抗体量通过FACSCalibur测定，使用FACSCalibur附带的分析软件CELLQuest Pro计算单位细胞荧光强度和平均值下的X几何平均值。结果汇总于表2。
向强制表达紧密连接蛋白3的DG44中添加抗体，使终浓度为5、1、0.1μg/mL时，均观察到各种抗体的结合量伴随着浓度的增加而增加。使用在Ba/F3上强制表达的人紧密连接蛋白3、人紧密连接蛋白1、人紧密连接蛋白4、人紧密连接蛋白6、小鼠紧密连接蛋白3，评价抗体终浓度为2μg/mL时的交叉反应性。与强制表达株的母株Ba/F3细胞相比，分离的所有抗体均与人紧密连接蛋白3强制表达细胞强烈结合。另外，任何抗体均与序列同一性不高的人紧密连接蛋白1、人紧密连接蛋白6强制表达细胞几乎不结合。显示紧密连接蛋白3选择性高结合性的抗体如下所述。
CDN08、CDN16、CDN14、CDN28、CDN29、
CDN30、CDN32、CDN33、和CDN36
CDN16、CDN35对于人和小鼠紧密连接蛋白3几乎显示同等高的结合性。识别动物种间共通表位的特异抗体可用作分析在病态模型动物中的药效与毒性的差分的工具使用。即，将特异性识别动物种间其序列保存的表位的抗体给予病态模型动物并观察其药物动力时，该抗体有望显示与作为该病态的治疗对象的动物种之间的的动力同样的表现。与人紧密连接蛋白3结合的CDN02、CDN05、CDN17、CDN24、CDN27和CDN31显示与人紧密连接蛋白4也结合，这显示两者是识别共通或者极为相似的序列结构的肽。
通过细胞流术对抗体与内源性表达紧密连接蛋白3的乳腺癌细胞株MCF7(ATCC，HTB-22)的结合性进行研究。与强制表达细胞同样，可见抗体浓度依赖性的结合量的增强，而与MCF7结合的强弱与强制表达细胞的结果未必相关(图3)。显示表位暴露的形式在强制表达细胞和癌细胞株中有不同。
[实施例4]单克隆抗体与胞外环区序列肽的结合性
通常，即使将多个跨膜蛋白的短环作为线状的肽进行免疫、可顺利获得抗体，也几乎未见与天然型蛋白具有高亲和性并结合的情况。相反，如果是与牢固的立体结构部分结合的抗体，则有几乎不与线状肽结合的可能性。使用GST-胞外肽环融合蛋白，对于与在细胞上表达的紧密连接蛋白3结合的单克隆抗体同相当于胞外环区的线状化肽序列的结合性进行评价。预想为人紧密连接蛋白3的胞外区的部分如下所述。
环1：相当于SEQ ID NO.2中的氨基酸残基号为30-80的序列
环2：相当于SEQ ID NO.2中的氨基酸残基号为137-159的序列
利用大肠杆菌表达载体pGEX-4T2，构建表达单元，在环序列的N末端一侧附着GST融合蛋白，在C末端一侧附着His标志，通过大肠杆菌表达系统进行蛋白质表达诱导，纯化融合蛋白。环1、环2融合蛋白的氨基酸序列分别由SEQ ID NO.116和SEQ ID NO.117表示。环1融合蛋白质以不溶性蛋白质的形式聚集在大肠杆菌内，因此在大肠杆菌破碎后回收不溶性组分，用7M尿素使其溶解，在尿素存在下使用镍亲和柱进行纯化。用咪唑洗脱后，用50mM Tris-HCl(pH8)进行透析，除去尿素。环2融合蛋白以可溶性蛋白的形式表达，因此通过谷胱甘肽亲和柱纯化融合蛋白。纯化的融合蛋白质涂布在Nunc免疫板上，用含有BSA的溶液阻断，然后分析单克隆抗体的结合反应性。与涂布的融合蛋白结合的阳性抗体是使用抗His小鼠单克隆抗体(Santa Cruz制备)。
反应1小时后清洗板，添加碱性磷酸酶标志的抗小鼠IgG(H+L)抗体并反应，清洗后加入检测试剂Sigma104，分析抗体结合量(图4)。阳性对照抗His抗体与涂布在板上的融合蛋白结合，而抗紧密连接蛋白3单克隆抗体几乎不与环1、和环2的任何肽片段结合。即使仅见微少结合的抗体也与环1和环2融合蛋白同等结合，未观察到结合特异性。由以上结果显示，此次分离的抗体完全与紧密连接蛋白3蛋白的刚性结构部分结合。
用目前唯一报道的与紧密连接蛋白3结合的多克隆抗体是用肽进行免疫、经由肽亲和纯化获得的，很明确，已报道的抗体与此次分离的抗体与抗原的结合方式不同。证明在可以以更高效率与在细胞上表达的紧密连接蛋白3结合方面，本发明的单克隆抗体有效。
[实施例5]通过单克隆抗体诱导细胞毒性
使用幼兔补体对单克隆抗体产生的表达紧密连接蛋白3的细胞的选择性补体依赖性细胞毒活性进行评价。使用人强制表达紧密连接蛋白3的DG44细胞作为表达人紧密连接蛋白3的细胞，使用母株DG44细胞作为对照，添加纯化的单克隆抗体，使终反应浓度为5μg/mL，然后在4℃下温育30分钟。添加幼兔补体(Cederlane，Cat.No.CL3441)，使终浓度为1％，在37℃、5％CO2下温育90分钟。
温育后添加DNA结合荧光试剂7-氨基放线菌素D(7-AAD，Invitrogen制备)，使终浓度为1μg/mL，遮光放置10分钟。离心后除去上清，将细胞悬浮于含1％胎牛血清的PBS中，通过流式细胞仪测定细胞的染色荧光强度。预先设定机器和测定域值条件，使抗体、补体均为非添加状态下的7-AAD阳性染色细胞为5％以下，然后测定抗体的补体依赖性细胞毒活性。
对于母株DG44细胞，与未添加抗体的情形同样，几乎不诱导细胞毒，而亚型IgG1的抗体以外的抗体均对强制表达人紧密连接蛋白3的DG44细胞显示细胞毒活性(图5)。CDN28、CDN32的抗体亚型是IgG1，显示细胞毒诱导活性。以上显示，此次分离的抗体的大部分具有抗原表达依赖性的补体依赖性细胞毒活性诱导能力。
接着，通过铬游离法研究单克隆抗体的对乳腺癌细胞株MCF7的补体依赖性细胞毒活性。MCF7的培养是使用含有10％胎牛血清、10μg/mL人胰岛素的RPMI1640培养基(Invitrogen制备)。将MCF7细胞铺于96孔板中，培养过夜，然后添加铬-51(规格：CJS4，Amersham Biosciences)，进一步持续培养数小时。将该细胞用培养基清洗，然后重新添加培养基。接着，向各孔中添加抗紧密连接蛋白3单克隆抗体和对照小鼠IgG2a抗体。抗体是终浓度为10μg/mL。接着添加幼兔补体，使终浓度为2％，将板在5％CO2培养箱中、在37℃下静置1.5小时。静置后将板离心(1000rpm，5分钟，4℃)，由各孔中分别回收100μL上清，通过γ射线计数仪(1480WIZARD3”，Wallac制备)测定放射活性。通过下式求出特异性铬游离率。
特异性铬游离率(％)＝(A-C)×100/(B-C)
式中，A、B和C分别表示以下数值。
A：各孔中的放射活性(cpm)
B：添加100μL细胞、100μL2％NP-40溶液(Nonidet P-40，CodeNo.252-23，Nacalai Tesque制备)的孔中的放射活性(cpm)的平均值
C：添加100μL细胞、100μL培养基的孔中的放射活性(cpm)的平均值
在各实验条件下分别测定3次，对于特异性铬游离率是计算平均值和标准偏差(图6)。下面的单克隆抗体对于MCF7显示强烈的补体依赖性细胞毒活性。
CDN27、CDN31、CDN35、CDN02、
CDN08、CDN16、CDN17、和CDN24
毒活性的强度与通过流式细胞术法测定的抗体结合量大致成相关性。而对照小鼠IgG2a抗体在相同浓度下不显示补体依赖性的细胞毒活性。
按照铬游离法测定以MCF7细胞为靶的抗体依赖性细胞性毒活性。即，用96孔平底板培养细胞，与铬-51反应，然后用RPMI1640培养基清洗，添加新的100μL的培养基。接着添加抗紧密连接蛋白3单克隆抗体和对照(无抗体)，使终浓度为0.1μg/mL。接着，向各孔中添加MCF7的约50倍细胞数的效应细胞溶液，将板在5％二氧化碳培养箱中、在37℃下培养。将C3H/HeNCrlCrlj小鼠(日本チヤ一ルス·リバ一株式会社)的脾细胞作为效应细胞，用含有50ng/mL重组人白细胞介素-2(CatNo.200-02，Peprotech)的培养基培养。静置6小时后测定特异性的铬游离率，分别计算平均和标准偏差(图7)。
与未添加抗体的和对照抗体(亚型IgG2a)相比，通过添加CDN04、CDN27、CDN35、CDN16，诱导了铬游离，确认是对表达紧密连接蛋白3的细胞显示抗体依赖性的细胞毒活性的抗体。
[实施例6]抗体可变区的克隆和重组抗体的制备
利用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clonetech制备)，克隆编码抗体可变区的cDNA，确定其碱基序列。使用RNeasy Mini(Qiagen制备)，由培养的杂交瘤细胞中回收总RNA。以此为基础，按照SMART RACEcDNA扩增试剂盒手册，合成cDNA，使用亚型特异性引物，通过PCR扩增抗体基因可变区的cDNA。扩增中使用的亚型特异性引物序列如表3所示。
[表3]
抗体亚型 引物序列 IgG1 5’-CCATGGAGTTAGTTTGGGCAGCAGATCC-3’(SEQ ID NO：129) IgG2a 5’-CAGGGGCCAGTGGATAGACCGATG-3’(SEQ ID NO：130) IgG2b 5’-CAGGGGCCAGTGGATAGACTGATG-3’(SEQ ID NO：131) IgG3 5’-ATGTGTCACTGCAGCCAGGGACCAA-3’(SEQ ID NO：188) IgK 5’-GGCACCTCCAGATGTTAACTGCTCACT-3’(SEQ ID NO：132) IgL 5’-TCGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGGAAAC-3’(SEQ ID NO：133)
将使用Takara Ex Taq DNA聚合酶(タカラ制备)扩增的片段克隆到pGEM-T Easy载体上，确定碱基序列。根据确定的抗体可变区，制备重组抗体表达载体。即，在人抗体IgG1恒定区和人Igκ恒定区上分别连接克隆的重链、轻链可变序列，使翻译读框一致。制备上述构建的小鼠-人嵌合抗体基因通过小鼠CMV启动子转录的表达载体。表达载体导入到COS7细胞中，得到瞬时性重组抗体表达细胞。通过采用培养2天后的上清和抗人IgG(H+L)-FITC作为二次抗体的该流式细胞术，确认重组抗体显示紧密连接蛋白3强制表达细胞特异性的结合(图8)。
[实施例7]单克隆抗体与在细胞上表达、呈递的环的结合分析
如之前所述，本发明的单克隆抗体对于与GST蛋白融合得到的直链状的预想胞外环肽未见结合性。为了获得该单克隆抗体的表位相关信息，对于各抗体与环1和环2哪一个结合进行了分析。此次分离的单克隆抗体几乎不与人紧密连接蛋白1结合。使具有紧密连接蛋白3的环1和紧密连接蛋白1的环2的嵌合分子(CLD1/3)、具有紧密连接蛋白1的环1和紧密连接蛋白3的环2的嵌合分子(CLD3/1)在细胞上表达，通过流式细胞术法分析抗体与细胞的结合性。如果与表达CLD1/3的细胞结合、但不与表达CLD3/1的细胞结合，则抗体与环2结合；如果不与表达CLD1/3的细胞结合，但与表达CLD3/1的细胞结合，则抗体与环1结合。
对紧密连接蛋白3和紧密连接蛋白1的氨基酸序列进行比较，则在第3号的预想跨膜区中存在共通的序列基序FLLA。以该部分为分界，设计为其前后的氨基酸序列置换连接而成的嵌合结构。设计的嵌合分子的氨基酸信息如下。
CLD1/3蛋白：紧密连接蛋白1氨基酸序列1-127和紧密连接蛋白3氨基酸序列126-220
CLD3/1蛋白：紧密连接蛋白3氨基酸序列1-125和紧密连接蛋白1氨基酸序列128-211
各嵌合分子的碱基序列和氨基酸序列由如下SEQ ID NO.所示。
碱基序列 氨基酸序列
CLD1/3蛋白：SEQ ID NO.160 SEQ ID NO.161
CLD3/1蛋白：SEQ ID NO.162 SEQ ID NO.163
具体来说，如下进行基因构建。以紧密连接蛋白1、3cDNA序列为模板，PCR扩增基因部分片段，并且通过PCR装配连接基因片段，形成具有嵌合分子结构。将其符合翻译读框地掺入到动物细胞表达载体中，在C末端上附加FLAG标志。向Ba/F3细胞中导入载体，获得抗药性细胞株。抗药性株中的蛋白质表达通过使用抗FLAG抗体的蛋白质印迹法确认，选择表达量高的株，建立了嵌合分子表达细胞。
使用嵌合分子表达细胞株的单克隆抗体结合表位分析显示了另人以外的结果。所分析的单克隆抗体的大部分是与具有天然型氨基酸序列的紧密连接蛋白3(CLD3/3)强烈结合。即，在图9的FACS的结果中，可以确认检测出荧光信号的明确的峰。而几乎所有的单克隆抗体与实验中所使用的两种嵌合蛋白表达细胞完全不结合。对于一部分抗体虽然可见弱的荧光峰，也只是可见结合倾向的程度。例如，在CDN16和CLD1/3、CDN35和CLD1/3之间可见弱的结合。对于抗紧密连接蛋白3小鼠抗血清也观察到显示同样倾向的结果。由这些结果可以推断，在杂交瘤筛选的阶段，不是由于筛选偏倚的问题；为了抗体与在细胞上表达的紧密连接蛋白3强烈结合，必须有环1和环2两者。
[实施例8]抗紧密连接蛋白3嵌合抗体恒定表达细胞株的制备
使用人嵌合抗体表达载体，通过电穿孔法转化DG44细胞。以遗传霉素抗性为指标，进行重组细胞克隆选择，其中，所述遗传霉素抗性由存在于人嵌合抗体表达载体上的选择标记获得。通过使用抗人抗体的夹层ELISA法检测所克隆的重组细胞培养上清中的抗体量，筛选重组抗体表达细胞。使用HiTrap蛋白A柱(Amersham Bioscience制备)，按照所附说明书，由筛选的重组细胞的培养上清进行人嵌合抗体的纯化。
通过流式细胞术对强制表达紧密连接蛋白3的DG44细胞、人嵌合抗体与紧密连接蛋白3强制表达Ba/F3的结合性进行分析。向强制表达紧密连接蛋白3的细胞中添加嵌合抗体并反应后，使用抗人IgG(H+L)-FITC检测结合的嵌合抗体。如图11所示，通过添加嵌合抗体可观察到直方图的显著的位移，确定了嵌合抗体与紧密连接蛋白3的结合。
[实施例9]添加抗紧密连接蛋白3抗体导致软琼脂中集落的形成和抑制细胞迁移能力
Agarwal等人由使用紧密连接蛋白3、4强制表达以及小干扰RNA的分析，报道了紧密连接蛋白3、紧密连接蛋白4的过量表达与卵巢癌细胞的存活能力提高、浸润性的获得有关(Agarwal等人(2005)CancerRes 65，7378-7385)。而Michl等人报道了通过紧密连接蛋白4过量表达可抑制胰腺癌细胞的转移、浸润能力(Michl等人(2003)Cancer Res 63，6265-6271)。
上述报道中对于有否表达或者增减带来的影响进行了研究，而与紧密连接蛋白3蛋白结合的抗体显示可改变细胞的功能的文献报道至今尚未见。对于抗紧密连接蛋白3抗体的结合是否会使癌细胞的存活能力或浸润性变化、抗体的添加对MCF7细胞在软琼脂中集落的形成、和对细胞迁移能力的影响进行了分析。
抗体添加对软琼脂中集落形成的影响是使用CytoSlect 96孔体外癌细胞感受性测定(Cell Biolabs，Inc.制备)进行评价。每孔中添加5000个MCF7细胞，与小鼠抗体一起散入软琼脂中，在37℃下、在5％CO2下培养7天。培养后通过MTT法对细胞数进行定量(图12)。通过添加抗紧密连接蛋白3抗体，可抑制集落的形成，在CDN04中其效果特别强。
抗体添加对细胞迁移能力的影响是按照以下的方法(wound-healing测定)进行评价。将MCF7细胞铺于12孔塑料板中，持续培养至可附着增殖的细胞密度饱和。用移液管的头将细胞单层划成线状。更换新培养液，然后添加抗体，终浓度为10μg/mL，持续培养4天。培养后可见，不添加抗体的对照孔中细胞移动，覆盖划痕区域，而在添加CDN04抗体的孔(10μg/mL)中，几乎未见细胞向划痕区域移动(图13)。在添加CDN16、CDN27、CDN28、CDN35、CDN38的孔中，未观察到显著的细胞迁移抑制。
本实施例首次确认了：通过紧密连接蛋白3结合抗体，可以进行癌症细胞特征性的无贴壁依赖性增殖、细胞移动等细胞功能的控制。
产业实用性
本发明提供抗紧密连接蛋白3单克隆抗体。紧密连接蛋白3在种间的同一性高，因此不容易通过常规免疫方法获得抗体。因此，本发明提供识别紧密连接蛋白3的抗体，其意义非常大。特别是在优选的方案中，由本发明提供的单克隆抗体可以与在细胞表面表达的紧密连接蛋白3结合，同时基本上未并观察到与相当于紧密连接蛋白3胞外结构域的、含氨基酸序列的线状肽的反应性。即，可以预测本发明的单克隆抗体是在利用相当于胞外结构域的氨基酸序列的结构域肽免疫中无法获得的抗体。
并且，属于紧密连接蛋白家族的很多分子结构类似。并且胞外结构域的长度短，可以预测是较难获得可以互相识别在细胞表面上表达的紧密连接蛋白家族分子的抗体的。但是在优选的实施方案中，由本发明提供的单克隆抗体可以免疫学识别紧密连接蛋白3和紧密连接蛋白6。构成紧密连接蛋白3胞外环1的氨基酸序列51个残基中，41个残基与紧密连接蛋白6的胞外环1的氨基酸序列同一。这样，可以免疫学识别同一性高的分子的抗体可以称为特异性优异的抗体。
因此，本发明提供特异性识别在癌细胞的细胞表面上表达的紧密连接蛋白3并可结合的抗体。根据本发明的抗体，可以检测出高表达紧密连接蛋白3的癌症。例如已确认卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌和结肠癌等中的紧密连接蛋白3表达亢进。即，本发明的单克隆抗体可用作卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌和结肠癌等紧密连接蛋白3表达亢进的癌症的诊断。
在优选方案中，已证实本发明的单克隆抗体对表达紧密连接蛋白3的细胞显示细胞毒作用。具体来说，例如可提供具有对乳腺癌的CDC作用、ADCC作用的单克隆抗体。并且在优选的方案中，本发明的单克隆抗体不仅识别紧密连接蛋白3，还识别紧密连接蛋白4。已报道紧密连接蛋白4是子宫癌患者的在具有化疗药物抗性的复发部位表达亢进的基因。
因此，本发明的单克隆抗体显示对于高表达紧密连接蛋白3或紧密连接蛋白4的癌症的治疗有效。并且本发明的单克隆抗体在进行了将恒定区置换为来自人的氨基酸序列的嵌合化之后，仍保持对紧密连接蛋白3的结合活性。这证实：本发明提供的单克隆抗体可作可为嵌合化、可以给予人的癌症治疗用的抗体。即，本发明的单克隆抗体对于卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌和结肠癌等紧密连接蛋白3和紧密连接蛋白4其中一种或者两种表达亢进的癌症的治疗有效。
<110>FORERUNNER PHARMA RESEARCH CO.，LTD.
<120>抗紧密连接蛋白3单克隆抗体以及使用该抗体的癌症的治疗和诊断
<130>C1-A0621P
<140>PCT/JP2007/074081
<141>2007-12-14
<150>JP 2006-336555
<151>2006-12-14
<160>188
<170>PatentIn version 3.3
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<213>智人
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<213>智人
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1 5 10 15
Trp Leu Gly Thr Ile Val Cys Cys Ala Leu Pro Met Trp Arg Val Ser
20 25 30
Ala Phe Ile Gly Ser Asn Ile Ile Thr Ser Gln Asn Ile Trp Glu Gly
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50 55 60
Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala Arg
65 70 75 80
Ala Leu Ile Val Val Ala Ile Leu Leu Ala Ala Phe Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ala Leu Val Gly Ala Gln Cys Thr Asn Cys Val Gln Asp Asp Thr Ala
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<213>小鼠
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<213>小鼠
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Leu Trp Met Asn Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys Lys
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Met Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala Arg
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Lys Ala Lys Ile Thr Ile Val Ala Gly Val Leu Phe Leu Leu Ala Ala
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Leu Leu Thr Leu Val Pro Val Ser Trp Ser Ala Asn Thr Ile Ile Arg
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Gly Ala Leu Leu Cys Cys Ser Cys Pro Pro Arg Asp Lys Tyr Ala Pro
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<213>智人
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<213>智人
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<213>小鼠
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<213>小鼠
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<222>(1)..(84)
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acctgcatga taacagactt cttccctgaa gacattactg tggagtggca gtggaatggg 1200
cagccagcgg agaactacaa gaacactcag cccatcatga acacgaatgg ctcttacttc 1260
gtctacagca agctcaatgt gcagaagagc aactgggagg caggaaatac tttcacctgc 1320
tctgtcttac atgagggcct gcacaaccac catactgaga agagcctctc ccactctcct 1380
ggtaaataa 1389
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<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<221>信号
<222>(1)..(28)
<400>20
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
35 40 45
Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Met Lys Gln Gly His Gly Lys Asn Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Leu Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
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100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Tyr Gly Ser Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro
130 135 140
Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met
145 150 155 160
Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
165 170 175
Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro
180 185 190
Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val
195 200 205
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Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys
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Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe
245 250 255
Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro
260 265 270
Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val
275 280 285
Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr
290 295 300
Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu
305 310 315 320
Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys
325 330 335
Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
340 345 350
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Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile
370 375 380
Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly
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<213>智人
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<212>PRT
<213>智人
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Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
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Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
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Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
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Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<213>小鼠
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Ala
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<212>DNA
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<213>小鼠
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<212>DNA
<213>小鼠
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<213>小鼠
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Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
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Lys Arg
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<213>小鼠
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tag 723
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<221>信号
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Leu Leu Tyr Gly Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg
65 70 75 80
Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
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Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr
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<213>智人
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<213>智人
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<213>小鼠
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Gly
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<213>小鼠
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<213>小鼠
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<213>小鼠
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aactctggat ccctgtccag cagtgtgcac accctctccc aggctctcct gcagtctgga 600
ctctacacta tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggccaag tcagaccgtc 660
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Asn Ser Phe Val Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro
130 135 140
Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser
145 150 155 160
Ser Val Thr Ser Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Ser Val
165 170 175
Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Ser Val His Thr Leu
180 185 190
Ser Gln Ala Leu Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Met Ser Ser Ser Val
195 200 205
Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Ser Val
210 215 220
Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Thr Val Asp Lys Lys Leu Glu Pro Ser
225 230 235 240
Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Cys Pro Pro Cys Lys Glu Cys His
245 250 255
Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe
260 265 270
Pro Pro Asn Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Thr Pro Lys Val
275 280 285
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile
290 295 300
Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr
305 310 315 320
His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro
325 330 335
Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val
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Glu Glu Asn Tyr Lys Asp Thr Ala Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
420 425 430
Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys Leu Asn Met Lys Thr Ser Lys Trp Glu Lys
435 440 445
Thr Asp Ser Phe Ser Cys Asn Val Arg His Glu Gly Leu Lys Asn Tyr
450 455 460
Tyr Leu Lys Lys Thr Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys
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<211>45
<212>DNA
<213>小鼠
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<213>小鼠
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<212>DNA
<213>小鼠
<400>47
cgtgcatcca acctagaatc t 21
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<212>PRT
<213>小鼠
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<213>小鼠
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<210>50
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<213>小鼠
<400>50
Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Trp Thr
1 5
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<213>小鼠
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aaaattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctaaggca gagggccacc 60
atatcctgca gagccagtga aagtgttgat agttatggca atagttttat gcactggtac 120
cagcagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc gtgcatccaa cctagaatct 180
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattgat 240
cctgtggagg ctgatgatgc tgcaacctat tactgtcagc aaaataatga ggatccgtgg 300
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgg 336
<210>52
<211>112
<212>PRT
<213>小鼠
<400>52
Lys Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Arg
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210>53
<211>717
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>信号肽
<222>(1)..(60)
<400>53
atggagacag agacactcct gctatgggtg ctactgctct gggttccagg ttccacaggt 60
aaaattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctaaggca gagggccacc 120
atatcctgca gagccagtga aagtgttgat agttatggca atagttttat gcactggtac 180
cagcagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc gtgcatccaa cctagaatct 240
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattgat 300
cctgtggagg ctgatgatgc tgcaacctat tactgtcagc aaaataatga ggatccgtgg 360
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420
atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 480
aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 540
aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 600
agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 660
actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgttag 717
<210>54
<211>238
<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<221>信号
<222>(1)..(20)
<400>54
Met Glu Thr Glu Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Lys Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Leu Arg Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser
35 40 45
Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro
130 135 140
Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu
145 150 155 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly
165 170 175
Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser
180 185 190
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp
195 200 205
Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr
210 215 220
Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225 230 235
<210>55
<211>15
<212>DNA
<213>小鼠
<400>55
ggctacttta tgaac 15
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<211>5
<212>PRT
<213>小鼠
<400>56
Gly Tyr Phe Met Asn
1 5
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<211>51
<212>DNA
<213>小鼠
<400>57
cgtattaatc cttacaatgg tgatactttc tacaaccaga agttcaaggg c 51
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<211>17
<212>PRT
<213>小鼠
<400>58
Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210>59
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<212>DNA
<213>小鼠
<400>59
agtggtgact ggtacttcga tgtc 24
<210>60
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<212>PRT
<213>小鼠
<400>60
Ser Gly Asp Trp Tyr Phe Asp Val
1 5
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<211>351
<212>DNA
<213>小鼠
<400>61
gaggttcagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
tcctgcaagg cttctggtta ctcatttact ggctacttta tgaactgggt gaagcagagc 120
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aaccagaagt tcaagggcaa ggccacatta actgtagaca aatcctctag cacagcccac 240
atggagctcc ggagcctgac atctgaggac tctgcagtct attattgtgc aagaagtggt 300
gactggtact tcgatgtctg gggcgcaggg accacggtca ccgtctcctc a 351
<210>62
<211>117
<212>PRT
<213>小鼠
<400>62
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala His
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>63
<211>1416
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>信号肽
<222>(1)..(57)
<400>63
atgggatgga gctggatctt tctctttctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt gttctctgag 60
gttcagctgc agcagtctgg acctgagctg gtgaagcctg gggcttcagt gaagatatcc 120
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ggaaagagcc ttgagtggat tggacgtatt aatccttaca atggtgatac tttctacaac 240
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gagctccgga gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt attgtgcaag aagtggtgac 360
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<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<221>信号
<222>(1)..(19)
<400>64
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val Phe Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
35 40 45
Thr Gly Tyr Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala His Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala
115 120 125
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val
130 135 140
Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Gly Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr
145 150 155 160
Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr
165 170 175
Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Leu
180 185 190
Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser
195 200 205
Asn Thr Trp Pro Ser Gln Thr Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala
210 215 220
Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Val Pro Ile Thr
225 230 235 240
Gln Asn Pro Cys Pro Pro Leu Lys Glu Cys Pro Pro Cys Ala Ala Pro
245 250 255
Asp Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys
260 265 270
Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Met Val Thr Cys Val Val Val
275 280 285
Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn
290 295 300
Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr
305 310 315 320
Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp
325 330 335
Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Arg Ala Leu
340 345 350
Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Pro Arg Gly Pro Val Arg
355 360 365
Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Ala Glu Glu Met Thr Lys
370 375 380
Lys Glu Phe Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Gly Phe Leu Pro Ala Glu
385 390 395 400
Ile Ala Val Asp Trp Thr Ser Asn Gly Arg Thr Glu Gln Asn Tyr Lys
405 410 415
Asn Thr Ala Thr Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser
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Lys Leu Arg Val Gln Lys Ser Thr Trp Glu Arg Gly Ser Leu Phe Ala
435 440 445
Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His Leu Thr Thr Lys Thr
450 455 460
Ile Ser Arg Ser Leu Gly Lys
465 470
<210>65
<211>45
<212>DNA
<213>小鼠
<400>65
agggccagca aaagtgtcag tacatctagc tatagttaca tgcac 45
<210>66
<211>15
<212>PRT
<213>小鼠
<400>66
Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His
1 5 10 15
<210>67
<211>21
<212>DNA
<213>小鼠
<400>67
tttgcatcct acctagaatc t 21
<210>68
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠
<400>68
Phe Ala Ser Tyr Leu Glu Ser
1 5
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<211>27
<212>DNA
<213>小鼠
<400>69
caacacagta gggagtttcc tcggacg 27
<210>70
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>70
Pro Val Glu Glu Glu Phe Pro Arg Thr
1 5
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<212>DNA
<213>小鼠
<400>71
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60
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cctgtggagg aggaggatgc tgcaacatat tactgtcaac acagtaggga gtttcctcgg 300
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<210>72
<211>112
<212>PRT
<213>小鼠
<400>72
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
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65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
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100 105 110
<210>73
<211>717
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>信号肽
<222>(1)..(60)
<400>73
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gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 120
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caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatcaagt ttgcatccta cctagaatct 240
ggggttcctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 300
cctgtggagg aggaggatgc tgcaacatat tactgtcaac acagtaggga gtttcctcgg 360
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420
atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 480
aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 540
aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 600
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<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<221>信号
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<400>74
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Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
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35 40 45
Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Lys Phe Ala Ser Tyr Leu Glu Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
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Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
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Gln His Ser Arg Glu Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
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Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro
130 135 140
Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu
145 150 155 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly
165 170 175
Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser
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Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp
195 200 205
Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr
210 215 220
Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225 230 235
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<211>15
<212>DNA
<213>小鼠
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ggctacttta tgaac 15
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<212>PRT
<213>小鼠
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Gly Tyr Phe Met Asn
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<213>小鼠
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aaccagaagt tcaagggcaa ggccacatta actgtagaca aatcctctaa cacagcccac 240
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<211>120
<212>PRT
<213>小鼠
<400>82
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1 5 10 15
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
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<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>信号肽
<222>(1)..(57)
<400>83
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gagctccgga gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt attgtgcaag aggagatggt 360
tactacgtga cgagtcttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgcagcc 420
aaaacgacac ccccatctgt ctatccactg gcccctggat ctgctgccca aactaactcc 480
atggtgaccc tgggatgcct ggtcaagggc tatttccctg agccagtgac agtgacctgg 540
aactctggat ccctgtccag cggtgtgcac accttcccag ctgtcctgca gtctgacctc 600
tacactctga gcagctcagt gactgtcccc tccagcacct ggcccagcga gaccgtcacc 660
tgcaacgttg cccacccggc cagcagcacc aaggtggaca agaaaattgt gcccagggat 720
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ccaaagccca aggatgtgct caccattact ctgactccta aggtcacgtg tgttgtggta 840
gacatcagca aggatgatcc cgaggtccag ttcagctggt ttgtagatga tgtggaggtg 900
cacacagctc agacgcaacc ccgggaggag cagttcaaca gcactttccg ctcagtcagt 960
gaacttccca tcatgcacca ggactggctc aatggcaagg agttcaaatg cagggtcaac 1020
agtgcagctt tccctgcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg cagaccgaag 1080
gctccacagg tgtacaccat tccacctccc aaggagcaga tggccaagga taaagtcagt 1140
ctgacctgca tgataacaga cttcttccct gaagacatta ctgtggagtg gcagtggaat 1200
gggcagccag cggagaacta caagaacact cagcccatca tgaacacgaa tggctcttac 1260
ttcgtctaca gcaagctcaa tgtgcagaag agcaactggg aggcaggaaa tactttcacc 1320
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cctggtaaat aa 1392
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<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<221>信号
<222>(1)..(19)
<400>84
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35 40 45
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115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro
130 135 140
Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser
145 150 155 160
Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165 170 175
Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe
180 185 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr
195 200 205
Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala
210 215 220
His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp
225 230 235 240
Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val
245 250 255
Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr
260 265 270
Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu
275 280 285
Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln
290 295 300
Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser
305 310 315 320
Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys
325 330 335
Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
340 345 350
Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro
355 360 365
Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met
370 375 380
Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn
385 390 395 400
Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asn Thr
405 410 415
Asn Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn
420 425 430
Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu
435 440 445
His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
450 455 460
<210>85
<211>33
<212>DNA
<213>小鼠
<400>85
aaggccagtg agaatgtggt tagttatgta tcc 33
<210>86
<211>11
<212>PRT
<213>小鼠
<400>86
Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Ser Tyr Val Ser
1 5 10
<210>87
<211>21
<212>DNA
<213>小鼠
<400>87
ggggcatcca accggtacac t 21
<210>88
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠
<400>88
Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
1 5
<210>89
<211>27
<212>DNA
<213>小鼠
<400>89
ggacagagtt acagctatcc tctcacg 27
<210>90
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>90
Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210>91
<211>324
<212>DNA
<213>小鼠
<400>91
aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcacc 60
ttgagctgca aggccagtga gaatgtggtt agttatgtat cctggtttca acagaaacca 120
gagcagtctc ctaaactgct gatatatggg gcatccaacc ggtacactgg ggtccccgat 180
cgcttcacag gcagtggatc tgcaacagat ttcactctga ccatcagcag tgtgcaggct 240
gaagaccttg cagattatta ctgtggacag agttacagct atcctctcac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggagctgaa acgg 324
<210>92
<211>108
<212>PRT
<213>小鼠
<400>92
Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Ser Tyr
20 25 30
Val Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100 105
<210>93
<211>717
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>信号肽
<222>(1)..(72)
<400>93
atgggcatca agatggaatc acagactctg gtcttcatat ccatactgct ctggttatat 60
ggtgctgatg ggaacattgt aatgacccaa tctcccaaat ccatgtccat gtcagtagga 120
gagagggtca ccttgagctg caaggccagt gagaatgtgg ttagttatgt atcctggttt 180
caacagaaac cagagcagtc tcctaaactg ctgatatatg gggcatccaa ccggtacact 240
ggggtccccg atcgcttcac aggcagtgga tctgcaacag atttcactct gaccatcagc 300
agtgtgcagg ctgaagacct tgcagattat tactgtggac agagttacag ctatcctctc 360
acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420
atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 480
aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 540
aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 600
agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 660
actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgttag 717
<210>94
<211>238
<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<221>信号
<222>(1)..(24)
<400>94
Met Gly Ile Lys Met Glu Ser Gln Thr Leu Val Phe Ile Ser Ile Leu
1 5 10 15
Leu Trp Leu Tyr Gly Ala Asp Gly Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro
20 25 30
Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys
35 40 45
Ala Ser Glu Asn Val Val Ser Tyr Val Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Tyr Cys
100 105 110
Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro
130 135 140
Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu
145 150 155 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly
165 170 175
Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser
180 185 190
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp
195 200 205
Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr
210 215 220
Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225 230 235
<210>95
<211>15
<212>DNA
<213>小鼠
<400>95
gactactaca tgaac 15
<210>96
<211>5
<212>PRT
<213>小鼠
<400>96
Asp Tyr Tyr Met Asn
1 5
<210>97
<211>51
<212>DNA
<213>小鼠
<400>97
cgtgttaatc ctagcaatgg tggtactagc tacaaccaga agttcaaggg c 51
<210>98
<211>17
<212>PRT
<213>小鼠
<400>98
Arg Val Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210>99
<211>33
<212>DNA
<213>小鼠
<400>99
ggcctagcct actatagtaa ctcctttact tac 33
<210>100
<211>11
<212>PRT
<213>小鼠
<400>100
Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Asn Ser Phe Thr Tyr
1 5 10
<210>101
<211>360
<212>DNA
<213>小鼠
<400>101
gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagatg 60
tcctgtaagg cttctggata cacattcact gactactaca tgaactgggt gaagcagagt 120
catggaaaga gccttgagtg gattggacgt gttaatccta gcaatggtgg tactagctac 180
aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg acagtagaca aatccctcag cacagcctac 240
atgcagctca acagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaggccta 300
gcctactata gtaactcctt tacttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 360
<210>102
<211>120
<212>PRT
<213>小鼠
<400>102
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Val Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Leu Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Asn Ser Phe Thr Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210>103
<211>1425
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>信号肽
<222>(1)..(57)
<400>103
atgggatgga gctgggtctt tctcttcctc ctgtcaggaa ctgcaggtgt ccactctgag 60
gtccagctgc aacagtctgg acctgagctg gtgaagcctg gggcttcagt gaagatgtcc 120
tgtaaggctt ctggatacac attcactgac tactacatga actgggtgaa gcagagtcat 180
ggaaagagcc ttgagtggat tggacgtgtt aatcctagca atggtggtac tagctacaac 240
cagaagttca agggcaaggc cacattgaca gtagacaaat ccctcagcac agcctacatg 300
cagctcaaca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag aggcctagcc 360
tactatagta actcctttac ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgcagcc 420
aaaacaacag ccccatcggt ctatccactg gcccctgtgt gtggaggtac aactggctcc 480
tcggtgactc taggatgcct ggtcaagggt tatttccctg agccagtgac cttgacctgg 540
aactctggat ccctgtccag tggtgtgcac accttcccag ctctcctgca gtctggcctc 600
tacaccctca gcagctcagt gactgtaacc tcgaacacct ggcccagcca gaccatcacc 660
tgcaatgtgg cccacccggc aagcagcacc aaagtggaca agaaaattga gcccagagtg 720
cccataacac agaacccctg tcctccactc aaagagtgtc ccccatgcgc agctccagac 780
ctcttgggtg gaccatccgt cttcatcttc cctccaaaga tcaaggatgt actcatgatc 840
tccctgagcc ccatggtcac atgtgtggtg gtggatgtga gcgaggatga cccagacgtc 900
cagatcagct ggtttgtgaa caacgtggaa gtacacacag ctcagacaca aacccataga 960
gaggattaca acagtactct ccgggtggtc agtgccctcc ccatccagca ccaggactgg 1020
atgagtggca aggagttcaa atgcaaggtc aacaacagag ccctcccatc ccccatcgag 1080
aaaaccatct caaaacccag agggccagta agagctccac aggtatatgt cttgcctcca 1140
ccagcagaag agatgactaa gaaagagttc agtctgacct gcatgatcac aggcttctta 1200
cctgccgaaa ttgctgtgga ctggaccagc aatgggcgta cagagcaaaa ctacaagaac 1260
accgcaacag tcctggactc tgatggttct tacttcatgt acagcaagct cagagtacaa 1320
aagagcactt gggaaagagg aagtcttttc gcctgctcag tggtccacga gggtctgcac 1380
aatcacctta cgactaagac catctcccgg tctctgggta aatga 1425
<210>104
<211>474
<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<221>信号
<222>(1)..(19)
<400>104
Met Gly Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Arg Val Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Leu Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Asn Ser Phe Thr Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Ala
130 135 140
Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Gly Thr Thr Gly Ser
145 150 155 160
Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165 170 175
Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe
180 185 190
Pro Ala Leu Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr
195 200 205
Val Thr Ser Asn Thr Trp Pro Ser Gln Thr Ile Thr Cys Asn Val Ala
210 215 220
His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Val
225 230 235 240
Pro Ile Thr Gln Asn Pro Cys Pro Pro Leu Lys Glu Cys Pro Pro Cys
245 250 255
Ala Ala Pro Asp Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
260 265 270
Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Met Val Thr Cys
275 280 285
Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp
290 295 300
Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg
305 310 315 320
Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln
325 330 335
His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
340 345 350
Arg Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Pro Arg Gly
355 360 365
Pro Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Ala Glu Glu
370 375 380
Met Thr Lys Lys Glu Phe Ser Leu Thr Cys MetIle Thr Gly Phe Leu
385 390 395 400
Pro Ala Glu Ile Ala Val Asp Trp Thr Ser Asn Gly Arg Thr Glu Gln
405 410 415
Asn Tyr Lys Asn Thr Ala Thr Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe
420 425 430
Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Gln Lys Ser Thr Trp Glu Arg Gly Ser
435 440 445
Leu Phe Ala Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His Leu Thr
450 455 460
Thr Lys Thr Ile Ser Arg Ser Leu Gly Lys
465 470
<210>105
<211>45
<212>DNA
<213>小鼠
<400>105
agagccagtg aaagtgttga tagttatggc aatagtttta tgcac 45
<210>106
<211>15
<212>PRT
<213>小鼠
<400>106
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His
1 5 10 15
<210>107
<211>21
<212>DNA
<213>小鼠
<400>107
cgtgcatcca acctagaatc t 21
<210>108
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠
<400>108
Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210>109
<211>27
<212>DNA
<213>小鼠
<400>109
cagcaaaata atgaggatcc gtggacg 27
<210>110
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>110
Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Trp Thr
1 5
<210>111
<211>336
<212>DNA
<213>小鼠
<400>111
aaaattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctaaggca gagggccacc 60
atatcctgca gagccagtga aagtgttgat agttatggca atagttttat gcactggtac 120
cagcagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc gtgcatccaa cctagaatct 180
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattgat 240
cctgtggagg ctgatgatgc tgcaacctat tactgtcagc aaaataatga ggatccgtgg 300
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgg 336
<210>112
<211>112
<212>PRT
<213>小鼠
<400>112
Lys Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Arg
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210>113
<211>717
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>信号肽
<222>(1)..(60)
<400>113
atggagacag agacactcct gctatgggtg ctactgctct gggttccagg ttccacaggt 60
aaaattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctaaggca gagggccacc 120
atatcctgca gagccagtga aagtgttgat agttatggca atagttttat gcactggtac 180
cagcagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc gtgcatccaa cctagaatct 240
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattgat 300
cctgtggagg ctgatgatgc tgcaacctat tactgtcagc aaaataatga ggatccgtgg 360
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420
atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 480
aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 540
aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 600
agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 660
actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgttag 717
<210>114
<211>238
<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<221>信号
<222>(1)..(20)
<400>114
Met Glu Thr Glu Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Lys Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Leu Arg Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser
35 40 45
Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro
130 135 140
Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu
145 150 155 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly
165 170 175
Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser
180 185 190
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp
195 200 205
Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr
210 215 220
Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225 230 235
<210>115
<211>867
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的核苷酸序列
<400>115
atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60
ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120
tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180
ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240
atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300
gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360
gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420
acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480
gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540
aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600
tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660
ctggttccgc gtggatcccc aggaattcgc gtgtcggcct tcatcggcag caacatcatc 720
acgtcgcaga acatctggga gggcctgtgg atgaactgcg tggtgcagag caccggccag 780
atgcagtgca aggtgtacga ctcgctgctg gcactgccac aggaccttca ggcggcccgg 840
tcgactcacc atcatcatca tcattaa 867
<210>116
<211>288
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>116
Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu
20 25 30
Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu
35 40 45
Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys
50 55 60
Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn
65 70 75 80
Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu
85 90 95
Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser
100 105 110
Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu
115 120 125
Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn
130 135 140
Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp
145 150 155 160
Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu
165 170 175
Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr
180 185 190
Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala
195 200 205
Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg
210 215 220
Gly Ser Pro Gly Ile Arg Val Ser Ala Phe Ile Gly Ser Asn Ile Ile
225 230 235 240
Thr Ser Gln Asn Ile Trp Glu Gly Leu Trp Met Asn Cys Val Val Gln
245 250 255
Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu
260 265 270
Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala Arg Ser Thr His His His His His His
275 280 285
<210>117
<211>261
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>117
Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu
20 25 30
Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu
35 40 45
Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys
50 55 60
Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn
65 70 75 80
Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu
85 90 95
Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser
100 105 110
Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu
115 120 125
Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn
130 135 140
Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp
145 150 155 160
Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu
165 170 175
Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr
180 185 190
Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala
195 200 205
Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg
210 215 220
Gly Ser Pro Gly Ile Pro Trp Ser Ala Asn Thr Ile Ile Arg Asp Phe
225 230 235 240
Tyr Asn Pro Val Val Pro Glu Ala Gln Lys Arg Glu Met Ser Thr His
245 250 255
His His His His His
260
<210>118
<211>786
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的核苷酸序列
<400>118
atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60
ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120
tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180
ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240
atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300
gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360
gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420
acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480
gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540
aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600
tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660
ctggttccgc gtggatcccc aggaattccc tggtcggcca acaccattat ccgggacttc 720
tacaaccccg tggtgcccga ggcgcagaag cgcgagatgt cgactcacca tcatcatcat 780
cattaa 786
<210>119
<211>30
<212>DNA
<213>智人
<400>119
cggccaccat gtccatgggc ctggagatca 30
<210>120
<211>30
<212>DNA
<213>智人
<400>120
gtctgtccct tagacgtagt ccttgcggtc 30
<210>121
<211>34
<212>DNA
<213>小鼠
<400>121
gcgaattcca ccatgtccat gggcctggag atca 34
<210>122
<211>33
<212>DNA
<213>小鼠
<400>122
gcgatatctg tcctcttcca gcctagcaag cag 33
<210>123
<211>30
<212>DNA
<213>智人
<400>123
atggccaacg cggggctgca gctgttgggc 30
<210>124
<211>30
<212>DNA
<213>智人
<400>124
tgtgtcacac gtagtctttc ccgctggaag 30
<210>125
<211>27
<212>DNA
<213>智人
<400>125
gaacaatggc ctccatgggg ctacagg 27
<210>126
<211>29
<212>DNA
<213>智人
<400>126
aggagggtgg actctgttct tgctagcag 29
<210>127
<211>27
<212>DNA
<213>智人
<400>127
catggcctct gccggaatgc agatcct 27
<210>128
<211>27
<212>DNA
<213>智人
<400>128
cccaaagctg ttgggcactg ccacttc 27
<210>129
<211>28
<212>DNA
<213>小鼠
<400>129
ccatggagtt agtttgggca gcagatcc 28
<210>130
<211>24
<212>DNA
<213>小鼠
<400>130
caggggccag tggatagacc gatg 24
<210>131
<211>24
<212>DNA
<213>小鼠
<400>131
caggggccag tggatagact gatg 24
<210>132
<211>27
<212>DNA
<213>小鼠
<400>132
ggcacctcca gatgttaact gctcact 27
<210>133
<211>27
<212>DNA
<213>小鼠
<400>133
tcgagctctt cagaggaagg tggaaac 27
<210>134
<211>51
<212>PRT
<213>智人
<400>134
Arg Val Thr Ala Phe Ile Gly Ser Asn Ile Val Thr Ser Gln Thr Ile
1 5 10 15
Trp Glu Gly Leu Trp Met Asn Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met
20 25 30
Gln Cys Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln
35 40 45
Ala Ala Arg
50
<210>135
<211>51
<212>PRT
<213>智人
<400>135
Lys Val Thr Ala Phe Ile Gly Asn Ser Ile Val Val Ala Gln Val Val
1 5 10 15
Trp Glu Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met
20 25 30
Gln Cys Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln
35 40 45
Ala Ala Arg
50
<210>136
<211>51
<212>PRT
<213>智人
<400>136
Lys Val Thr Ala Phe Ile Gly Asn Ser Ile Val Val Ala Gln Val Val
1 5 10 15
Trp Glu Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met
20 25 30
Gln Cys Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln
35 40 45
Ala Ala Arg
50
<210>137
<211>51
<212>PRT
<213>智人
<400>137
Arg Val Ser Ala Phe Ile Glu Asn Asn Ile Val Val Phe Glu Asn Phe
1 5 10 15
Trp Glu Gly Leu Trp Met Asn Cys Val Arg Gln Ala Asn Ile Arg Met
20 25 30
Gln Cys Lys Ile Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Ser Pro Asp Leu Gln
35 40 45
Ala Ala Arg
50
<210>138
<211>51
<212>PRT
<213>智人
<400>138
Gln Val Thr Ala Phe Leu Asp His Asn Ile Val Thr Ala Gln Thr Thr
1 5 10 15
Trp Lys Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Val Gln Ser Thr Gly His Met
20 25 30
Gln Cys Lys Val Tyr Asp Ser Val Leu Ala Leu Ser Thr Glu Val Gln
35 40 45
Ala Ala Arg
50
<210>139
<211>51
<212>PRT
<213>智人
<400>139
Arg Val Ser Ala Phe Val Gly Ser Asn Ile Ile Val Phe Glu Arg Leu
1 5 10 15
Trp Glu Gly Leu Trp Met Asn Cys Ile Arg Gln Ala Arg Val Arg Leu
20 25 30
Gln Cys Lys Phe Tyr Ser Ser Leu Leu Ala Leu Pro Pro Ala Leu Glu
35 40 45
Thr Ala Arg
50
<210>140
<211>51
<212>PRT
<213>智人
<400>140
Arg Ile Tyr Ser Tyr Ala Gly Asp Asn Ile Val Thr Ala Gln Ala Met
1 5 10 15
Tyr Glu Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Ser Gln Ser Thr Gly Gln Ile
20 25 30
Gln Cys Lys Val Phe Asp Ser Leu Leu Asn Leu Ser Ser Thr Leu Gln
35 40 45
Ala Thr Arg
50
<210>141
<211>51
<212>PRT
<213>智人
<400>141
Gln Met Ser Ser Tyr Ala Gly Asp Asn Ile Ile Thr Ala Gln Ala Met
1 5 10 15
Tyr Lys Gly Leu Trp Met Asp Cys Val Thr Gln Ser Thr Gly Met Met
20 25 30
Ser Cys Lys Met Tyr Asp Ser Val Leu Ala Leu Ser Ala Ala Leu Gln
35 40 45
Ala Thr Arg
50
<210>142
<211>51
<212>PRT
<213>智人
<400>142
Arg Arg Thr Ala His Val Gly Thr Asn Ile Leu Thr Ala Val Ser Tyr
1 5 10 15
Leu Lys Gly Leu Trp Met Glu Cys Val Trp His Ser Thr Gly Ile Tyr
20 25 30
Gln Cys Gln Ile Tyr Arg Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln
35 40 45
Ala Ala Arg
50
<210>143
<211>49
<212>PRT
<213>智人
<400>143
Ser Ser Tyr Ala Gly Asp Ala Ile Ile Thr Ala Val Gly Leu Tyr Glu
1 5 10 15
Gly Leu Trp Met Ser Cys Ala Ser Gln Ser Thr Gly Gln Val Gln Cys
20 25 30
Lys Leu Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Asp Gly His Ile Gln Ser Ala
35 40 45
Arg
<210>144
<211>51
<212>PRT
<213>智人
<400>144
Lys Thr Ser Ser Tyr Val Gly Ala Ser Ile Val Thr Ala Val Gly Phe
1 5 10 15
Ser Lys Gly Leu Trp Met Glu Cys Ala Thr His Ser Thr Gly Ile Thr
20 25 30
Gln Cys Asp Ile Tyr Ser Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Asp Ile Gln
35 40 45
Ala Ala Gln
50
<210>145
<211>51
<212>PRT
<213>智人
<400>145
Lys Val Asn Val Asp Val Asp Ser Asn Ile Ile Thr Ala Ile Val Gln
1 5 10 15
Leu His Gly Leu Trp Met Asp Cys Thr Trp Tyr Ser Thr Gly Met Phe
20 25 30
Ser Cys Ala Leu Lys His Ser Ile Leu Ser Leu Pro Ile His Val Gln
35 40 45
Ala Ala Arg
50
<210>146
<211>22
<212>PRT
<213>智人
<400>146
Val Ala Asn Ala Ile Ile Arg Asp Phe Tyr Asn Ser Ile Val Asn Val
1 5 10 15
Ala Gln Lys Arg Glu Leu
20
<210>147
<211>22
<212>PRT
<213>智人
<400>147
Thr Ala His Ala Ile Ile Gln Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Glu
1 5 10 15
Ala Leu Lys Arg Glu Leu
20
<210>148
<211>22
<212>PRT
<213>智人
<400>148
Thr Ala Asn Ile Ile Ile Arg Asp Phe Tyr Asn Pro Ala Ile His Ile
1 5 10 15
Gly Gln Lys Arg Glu Leu
20
<210>149
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>149
Gly Gly Gly Ser
1
<210>150
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>150
Ser Gly Gly Gly
1
<210>151
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>151
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210>152
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>152
Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210>153
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>153
Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210>154
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>154
Ser Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210>155
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>155
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210>156
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>156
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210>157
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>157
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210>158
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>158
Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210>159
<211>3876
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的核苷酸序列
<220>
<221>CDS
<222>(836)..(1498)
<400>159
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgtg agtcattagg gactttccaa tgggttttgc ccagtacata aggtcaatgg 240
gaggtaagcc aatgggtttt tcccattact ggcacctagc tgagtcatta gggactttcc 300
aatgggtttt gcccagtaca taaggtcaat aggggtgaat caacaggaaa gtcccattgg 360
agccaagtac actgagtcaa tagggacttt ccattgggtt ttgcccagta caaaaggtca 420
atagggggtg agtcaatggg tttttcccat tattggcacg tacataaggt caataggggt 480
gagtcattgg gtttttccag ccaatttaat taaaacgcca tgtactttcc caccattgac 540
gtcaatgggc tattgaaact aatgcaacgt gacctttaaa cggtactttc ccatagctga 600
ttaatgggaa agtaccgttc tcgagccaat acacgtcaat gggaagtgaa agggcagcca 660
aaacgtaaca ccgccccggt tttcccctgg aaattccata ttggcacgca ttctattggc 720
tgagctgcgt tctacgtggg tataagaggc gcgaccagcg tcggtaccgt cgcagtcttc 780
ggtctgacca ccgtagaacg caaagcttgc ccgggcgaat tcgattcggg ccacc atg 838
Met
1
tcc atg ggc ctg gag atc acg ggc acc gcg ctg gcc gtg ctg ggc tgg 886
Ser Met Gly Leu Glu Ile Thr Gly Thr Ala Leu Ala Val Leu Gly Trp
5 10 15
ctg ggc acc atc gtg tgc tgc gcg ttg ccc atg tgg cgc gtg tcg gcc 934
Leu Gly Thr Ile Val Cys Cys Ala Leu Pro Met Trp Arg Val Ser Ala
20 25 30
ttc atc ggc agc aac atc atc acg tcg cag aac atc tgg gag ggc ctg 982
Phe Ile Gly Ser Asn Ile Ile Thr Ser Gln Asn Ile Trp Glu Gly Leu
35 40 45
tgg atg aac tgc gtg gtg cag agc acc ggc cag atg cag tgc aag gtg 1030
Trp Met Asn Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys Lys Val
50 55 60 65
tac gac tcg ctg ctg gca ctg cca cag gac ctt cag gcg gcc cgc gcc 1078
Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala Arg Ala
70 75 80
ctc atc gtg gtg gcc atc ctg ctg gcc gcc ttc ggg ctg cta gtg gcg 1126
Leu Ile Val Val Ala Ile Leu Leu Ala Ala Phe Gly Leu Leu Val Ala
85 90 95
ctg gtg ggc gcc cag tgc acc aac tgc gtg cag gac gac acg gcc aag 1174
Leu Val Gly Ala Gln Cys Thr Asn Cys Val Gln Asp Asp Thr Ala Lys
100 105 110
gcc aag atc acc atc gtg gca ggc gtg ctg ttc ctt ctc gcc gcc ctg 1222
Ala Lys Ile Thr Ile Val Ala Gly Val Leu Phe Leu Leu Ala Ala Leu
115 120 125
ctc acc ctc gtg ccg gtg tcc tgg tcg gcc aac acc att atc cgg gac 1270
Leu Thr Leu Val Pro Val Ser Trp Ser Ala Asn Thr Ile Ile Arg Asp
130 135 140 145
ttc tac aac ccc gtg gtg ccc gag gcg cag aag cgc gag atg ggc gcg 1318
Phe Tyr Asn Pro Val Val Pro Glu Ala Gln Lys Arg Glu Met Gly Ala
150 155 160
ggc ctg tac gtg ggc tgg gcg gcc gcg gcg ctg cag ctg ctg ggg ggc 1366
Gly Leu Tyr Val Gly Trp Ala Ala Ala Ala Leu Gln Leu Leu Gly Gly
165 170 175
gcg ctg ctc tgc tgc tcg tgt ccc cca cgc gag aag aag tac acg gcc 1414
Ala Leu Leu Cys Cys Ser Cys Pro Pro Arg Glu Lys Lys Tyr Thr Ala
180 185 190
acc aag gtc gtc tac tcc gcg ccg cgc tcc acc ggc ccg gga gcc agc 1462
Thr Lys Val Val Tyr Ser Ala Pro Arg Ser Thr Gly Pro Gly Ala Ser
195 200 205
ctg ggc aca ggc tac gac cgc aag gac tac gtc taa gggtcagaca 1508
Leu Gly Thr Gly Tyr Asp Arg Lys Asp Tyr Val
210 215 220
atcactagtg aattcgtcga cgctagcgat atcgcggccg ctctagagtc ggggcggccg 1568
gccgcttcga gcagacatga taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat 1628
gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat 1688
tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa caattgcatt cattttatgt ttcaggttca 1748
gggggaggtg tgggaggttt tttaaagcaa gtaaaacctc tacaaatgtg gtaaaatcga 1808
taaggatccc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt 1868
gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga 1928
gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca 1988
ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg 2048
ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt 2108
cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc 2168
ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct 2228
tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc 2288
gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta 2348
tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca 2408
gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag 2468
tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag 2528
ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt 2588
agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa 2648
gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg 2708
attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga 2768
agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta 2828
atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc 2888
cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg 2948
ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga 3008
agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt 3068
tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt 3128
gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc 3188
caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc 3248
ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca 3308
gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag 3368
tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg 3428
tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa 3488
cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa 3548
cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga 3608
gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga 3668
atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg 3728
agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt 3788
ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa accattatta tcatgacatt aacctataaa 3848
aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtc 3876
<210>160
<211>714
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的核苷酸序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(714)
<400>160
atg gcc aac gcg ggg ctg cag ctg ttg ggc ttc att ctc gcc ttc ctg 48
Met Ala Asn Ala Gly Leu Gln Leu Leu Gly Phe Ile Leu Ala Phe Leu
1 5 10 15
gga tgg atc ggc gcc atc gtc agc act gcc ctg ccc cag tgg agg att 96
Gly Trp Ile Gly Ala Ile Val Ser Thr Ala Leu Pro Gln Trp Arg Ile
20 25 30
tac tcc tat gcc ggc gac aac atc gtg acc gcc cag gcc atg tac gag 144
Tyr Ser Tyr Ala Gly Asp Asn Ile Val Thr Ala Gln Ala Met Tyr Glu
35 40 45
ggg ctg tgg atg tcc tgc gtg tcg cag agc acc ggg cag atc cag tgc 192
Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Ser Gln Ser Thr Gly Gln Ile Gln Cys
50 55 60
aaa gtc ttt gac tcc ttg ctg aat ctg agc agc aca ttg caa gca acc 240
Lys Val Phe Asp Ser Leu Leu Asn Leu Ser Ser Thr Leu Gln Ala Thr
65 70 75 80
cgt gcc ttg atg gtg gtt ggc atc ctc ctg gga gtg ata gca atc ttt 288
Arg Ala Leu Met Val Val Gly Ile Leu Leu Gly Val Ile Ala Ile Phe
85 90 95
gtg gcc acc gtt ggc atg aag tgt atg aag tgc ttg gaa gac gat gag 336
Val Ala Thr Val Gly Met Lys Cys Met Lys Cys Leu Glu Asp Asp Glu
100 105 110
gtg cag aag atg agg atg gct gtc att ggg ggc gcg ata ttt ctt ctc 384
Val Gln Lys Met Arg Met Ala Val Ile Gly Gly Ala Ile Phe Leu Leu
115 120 125
gcc gcc ctg ctc acc ctc gtg ccg gtg tcc tgg tcg gcc aac acc att 432
Ala Ala Leu Leu Thr Leu Val Pro Val Ser Trp Ser Ala Asn Thr Ile
130 135 140
atc cgg gac ttc tac aac ccc gtg gtg ccc gag gcg cag aag cgc gag 480
Ile Arg Asp Phe Tyr Asn Pro Val Val Pro Glu Ala Gln Lys Arg Glu
145 150 155 160
atg ggc gcg ggc ctg tac gtg ggc tgg gcg gcc gcg gcg ctg cag ctg 528
Met Gly Ala Gly Leu Tyr Val Gly Trp Ala Ala Ala Ala Leu Gln Leu
165 170 175
ctg ggg ggc gcg ctg ctc tgc tgc tcg tgt ccc cca cgc gag aag aag 576
Leu Gly Gly Ala Leu Leu Cys Cys Ser Cys Pro Pro Arg Glu Lys Lys
180 185 190
tac acg gcc acc aag gtc gtc tac tcc gcg ccg cgc tcc acc ggc ccg 624
Tyr Thr Ala Thr Lys Val Val Tyr Ser Ala Pro Arg Ser Thr Gly Pro
195 200 205
gga gcc agc ctg ggc aca ggc tac gac cgc aag gac tac gtc gct agc 672
Gly Ala Ser Leu Gly Thr Gly Tyr Asp Arg Lys Asp Tyr Val Ala Ser
210 215 220
gat atc gcg gcc gct gac tac aaa gac gat gac gac aag tga 714
Asp Ile Ala Ala Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
225 230 235
<210>161
<211>237
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>161
Met Ala Asn Ala Gly Leu Gln Leu Leu Gly Phe Ile Leu Ala Phe Leu
1 5 10 15
Gly Trp Ile Gly Ala Ile Val Ser Thr Ala Leu Pro Gln Trp Arg Ile
20 25 30
Tyr Ser Tyr Ala Gly Asp Asn Ile Val Thr Ala Gln Ala Met Tyr Glu
35 40 45
Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Ser Gln Ser Thr Gly Gln Ile Gln Cys
50 55 60
Lys Val Phe Asp Ser Leu Leu Asn Leu Ser Ser Thr Leu Gln Ala Thr
65 70 75 80
Arg Ala Leu Met Val Val Gly Ile Leu Leu Gly Val Ile Ala Ile Phe
85 90 95
Val Ala Thr Val Gly Met Lys Cys Met Lys Cys Leu Glu Asp Asp Glu
100 105 110
Val Gln Lys Met Arg Met Ala Val Ile Gly Gly Ala Ile Phe Leu Leu
115 120 125
Ala Ala Leu Leu Thr Leu Val Pro Val Ser Trp Ser Ala Asn Thr Ile
130 135 140
Ile Arg Asp Phe Tyr Asn Pro Val Val Pro Glu Ala Gln Lys Arg Glu
145 150 155 160
Met Gly Ala Gly Leu Tyr Val Gly Trp Ala Ala Ala Ala Leu Gln Leu
165 170 175
Leu Gly Gly Ala Leu Leu Cys Cys Ser Cys Pro Pro Arg Glu Lys Lys
180 185 190
Tyr Thr Ala Thr Lys Val Val Tyr Ser Ala Pro Arg Ser Thr Gly Pro
195 200 205
Gly Ala Ser Leu Gly Thr Gly Tyr Asp Arg Lys Asp Tyr Val Ala Ser
210 215 220
Asp Ile Ala Ala Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
225 230 235
<210>162
<211>675
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的核苷酸序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(675)
<400>162
atg tcc atg ggc ctg gag atc acg ggc acc gcg ctg gcc gtg ctg ggc 48
Met Ser Met Gly Leu Glu Ile Thr Gly Thr Ala Leu Ala Val Leu Gly
1 5 10 15
tgg ctg ggc acc atc gtg tgc tgc gcg ttg ccc atg tgg cgc gtg tcg 96
Trp Leu Gly Thr Ile Val Cys Cys Ala Leu Pro Met Trp Arg Val Ser
20 25 30
gcc ttc atc ggc agc aac atc atc acg tcg cag aac atc tgg gag ggc 144
Ala Phe Ile Gly Ser Asn Ile Ile Thr Ser Gln Asn Ile Trp Glu Gly
35 40 45
ctg tgg atg aac tgc gtg gtg cag agc acc ggc cag atg cag tgc aag 192
Leu Trp Met Asn Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys Lys
50 55 60
gtg tac gac tcg ctg ctg gca ctg cca cag gac ctt cag gcg gcc cgc 240
Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala Arg
65 70 75 80
gcc ctc atc gtg gtg gcc atc ctg ctg gcc gcc ttc ggg ctg cta gtg 288
Ala Leu Ile Val Val Ala Ile Leu Leu Ala Ala Phe Gly Leu Leu Val
85 90 95
gcg ctg gtg ggc gcc cag tgc acc aac tgc gtg cag gac gac acg gcc 336
Ala Leu Val Gly Ala Gln Cys Thr Asn Cys Val Gln Asp Asp Thr Ala
100 105 110
aag gcc aag atc acc atc gtg gca ggc gtg ctg ttc ctt ctt gca ggt 384
Lys Ala Lys Ile Thr Ile Val Ala Gly Val Leu Phe Leu Leu Ala Gly
115 120 125
ctg gct att tta gtt gcc aca gca tgg tat ggc aat aga atc gtt caa 432
Leu Ala Ile Leu Val Ala Thr Ala Trp Tyr Gly Asn Arg Ile Val Gln
130 135 140
gaa ttc tat gac cct atg acc cca gtc aat gcc agg tac gaa ttt ggt 480
Glu Phe Tyr Asp Pro Met Thr Pro Val Asn Ala Arg Tyr Glu Phe Gly
145 150 155 160
cag gct ctc ttc act ggc tgg gct gct gct tct ctc tgc ctt ctg gga 528
Gln Ala Leu Phe Thr Gly Trp Ala Ala Ala Ser Leu Cys Leu Leu Gly
165 170 175
ggt gcc cra crt tgc tgt tcc tgt ccc cga aaa aca acc tct tac cca 576
Gly Ala Leu Leu Cys Cys Ser Cys Pro Arg Lys Thr Thr Ser Tyr Pro
180 185 190
aca cca agg ccc tat cca aaa cct gca cct tcc agc ggg aaa gac tac 624
Thr Pro Arg Pro Tyr Pro Lys Pro Ala Pro Ser Ser Gly Lys Asp Tyr
195 200 205
gtg gct agc gat atc gcg gcc gct gac tac aaa gac gat gac gac aag 672
Val Ala Ser Asp Ile Ala Ala Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
210 215 220
tga 675
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<211>224
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>163
Met Ser Met Gly Leu Glu Ile Thr Gly Thr Ala Leu Ala Val Leu Gly
1 5 10 15
Trp Leu Gly Thr Ile Val Cys Cys Ala Leu Pro Met Trp Arg Val Ser
20 25 30
Ala Phe Ile Gly Ser Asn Ile Ile Thr Ser Gln Asn Ile Trp Glu Gly
35 40 45
Leu Trp Met Asn Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys Lys
50 55 60
Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala Arg
65 70 75 80
Ala Leu Ile Val Val Ala Ile Leu Leu Ala Ala Phe Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ala Leu Val Gly Ala Gln Cys Thr Asn Cys Val Gln Asp Asp Thr Ala
100 105 110
Lys Ala Lys Ile Thr Ile Val Ala Gly Val Leu Phe Leu Leu Ala Gly
115 120 125
Leu Ala Ile Leu Val Ala Thr Ala Trp Tyr Gly Asn Arg Ile Val Gln
130 135 140
Glu Phe Tyr Asp Pro Met Thr Pro Val Asn Ala Arg Tyr Glu Phe Gly
145 150 155 160
Gln Ala Leu Phe Thr Gly Trp Ala Ala Ala Ser Leu Cys Leu Leu Gly
165 170 175
Gly Ala Leu Leu Cys Cys Ser Cys Pro Arg Lys Thr Thr Ser Tyr Pro
180 185 190
Thr Pro Arg Pro Tyr Pro Lys Pro Ala Pro Ser Ser Gly Lys Asp Tyr
195 200 205
Val Ala Ser Asp Ile Ala Ala Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
210 215 220
<210>164
<211>351
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(351)
<400>164
gag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gag ctg gtg aag cct ggg gct 48
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct ggt tac tcc ttt act ggc tac 96
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
ttt atg aac tgg gtg aag cag agc cat gga aag agc ctt gag tgg att 144
Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
gga cgt att aat cct tac aat ggt gat act ttc tac aac cag aag ttc 192
Gly Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
aag ggc aag gcc aca ttg act gta gac aaa tcc tct agc aca gcc cac 240
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala His
65 70 75 80
atg gag ctc cgg agc ctg aca tct gag gac tct gca ctc tat tat tgt 288
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
gca aga tct ggt aac tat gtt atg gac tac tgg ggt caa gga acc tca 336
Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
gtc acc gtc tcc tca 351
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>165
<211>117
<212>PRT
<213>小鼠
<400>165
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala His
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>166
<211>15
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(15)
<400>166
ggc tac ttt atg aac 15
Gly Tyr Phe Met Asn
1 5
<210>167
<211>5
<212>PRT
<213>小鼠
<400>167
Gly Tyr Phe Met Asn
1 5
<210>168
<211>51
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(51)
<400>168
cgt att aat cct tac aat ggt gat act ttc tac aac cag aag ttc aag 48
Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
ggc 51
Gly
<210>169
<211>17
<212>PRT
<213>小鼠
<400>169
Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210>170
<211>24
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(24)
<400>170
tct ggt aac tat gtt atg gac tac 24
Ser Gly Asn Tyr Val Met Asp Tyr
1 5
<210>171
<211>8
<212>PRT
<213>小鼠
<400>171
Ser Gly Asn Tyr Val Met Asp Tyr
1 5
<210>172
<211>1401
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1398)
<220>
<221>信号肽
<222>(1)..(57)
<220>
<221>成熟肽
<222>(58)..(1398)
<400>172
atg gga tgg agc tgg atc ttt ctc ttc ctt atg tca gga acg gca ggt 48
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Met Ser Gly Thr Ala Gly
-15 -10 -5
gtc ctc tct gag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gag ctg gtg aag 96
Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
-1 1 5 10
cct ggg gct tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct ggt tac tcc ttt 144
Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
15 20 25
act ggc tac ttt atg aac tgg gtg aag cag agc cat gga aag agc ctt 192
Thr Gly Tyr Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu
30 35 40 45
gag tgg att gga cgt att aat cct tac aat ggt gat act ttc tac aac 240
Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn
50 55 60
cag aag ttc aag ggc aag gcc aca ttg act gta gac aaa tcc tct agc 288
Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
65 70 75
aca gcc cac atg gag ctc cgg agc ctg aca tct gag gac tct gca ctc 336
Thr Ala His Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Leu
80 85 90
tat tat tgt gca aga tct ggt aac tat gtt atg gac tac tgg ggt caa 384
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln
95 100 105
gga acc tca gtc acc gtc tcc tca gct aca aca aca gcc cca tct gtc 432
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Thr Thr Thr Ala Pro Ser Val
110 115 120 125
tat ccc ttg gtc cct ggc tgc agt gac aca tct gga tcc tcg gtg aca 480
Tyr Pro Leu Val Pro Gly Cys Ser Asp Thr Ser Gly Ser Ser Val Thr
130 135 140
ctg gga tgc ctt gtc aaa ggc tac ttc cct gag ccg gta act gta aaa 528
Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Lys
145 150 155
tgg aac tat gga gcc ctg tcc agc ggt gtg cgc aca gtc tca tct gtc 576
Trp Asn Tyr Gly Ala Leu Ser Ser Gly Val Arg Thr Val Ser Ser Val
160 165 170
ctg cag tct ggg ttc tat tcc ctc agc agc ttg gtg act gta ccc tcc 624
Leu Gln Ser Gly Phe Tyr Ser Leu Ser Ser Leu Val Thr Val Pro Ser
175 180 185
agc acc tgg ccc agc cag act gtc atc tgc aac gta gcc cac cca gcc 672
Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Ile Cys Asn Val Ala His Pro Ala
190 195 200 205
agc aag act gag ttg atc aag aga atc gag cct aga ata ccc aag ccc 720
Ser Lys Thr Glu Leu Ile Lys Arg Ile Glu Pro Arg Ile Pro Lys Pro
210 215 220
agt acc ccc cca ggt tct tca tgc cca cct ggt aac atc ttg ggt gga 768
Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Cys Pro Pro Gly Asn Ile Leu Gly Gly
225 230 235
cca tcc gtc ttc atc ttc ccc cca aag ccc aag gat gca ctc atg atc 816
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ala Leu Met Ile
240 245 250
tcc cta acc ccc aag gtt acg tgt gtg gtg gtg gat gtg agc gag gat 864
Ser Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp
255 260 265
gac cca gat gtc cat gtc agc tgg ttt gtg gac aac aaa gaa gta cac 912
Asp Pro Asp Val His Val Ser Trp Phe Val Asp Asn Lys Glu Val His
270 275 280 285
aca gcc tgg aca cag ccc cgt gaa gct cag tac aac agt acc ttc cga 960
Thr Ala Trp Thr Gln Pro Arg Glu Ala Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg
290 295 300
gtg gtc agt gcc ctc ccc atc cag cac cag gac tgg atg agg ggc aag 1008
Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Arg Gly Lys
305 310 315
gag ttc aaa tgc aag gtc aac aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag 1056
Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
320 325 330
aga acc atc tca aaa ccc aaa gga aga gcc cag aca cct caa gta tac 1104
Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Arg Ala Gln Thr Pro Gln Val Tyr
335 340 345
acc ata ccc cca cct cgt gaa caa atg tcc aag aag aag gtt agt ctg 1152
Thr Ile Pro Pro Pro Arg Glu Gln Met Ser Lys Lys Lys Val Ser Leu
350 355 360 365
acc tgc ctg gtc acc aac ttc ttc tct gaa gcc atc agt gtg gag tgg 1200
Thr Cys Leu Val Thr Asn Phe Phe Ser Glu Ala Ile Ser Val Glu Trp
370 375 380
gaa agg aac gga gaa ctg gag cag gat tac aag aac act cca ccc atc 1248
Glu Arg Asn Gly Glu Leu Glu Gln Asp Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Ile
385 390 395
ctg gac tca gat ggg acc tac ttc ctc tac agc aag ctc act gtg gat 1296
Leu Asp Ser Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
400 405 410
aca gac agt tgg ttg caa gga gaa att ttt acc tgc tcc gtg gtg cat 1344
Thr Asp Ser Trp Leu Gln Gly Glu Ile Phe Thr Cys Ser Val Val His
415 420 425
gag gct ctc cat aac cac cac aca cag aag aac ctg tct cgc tcc cct 1392
Glu Ala Leu His Asn His His Thr Gln Lys Asn Leu Ser Arg Ser Pro
430 435 440 445
ggt aaa tga 1401
Gly Lys
<210>173
<211>466
<212>PRT
<213>小鼠
<400>173
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Met Ser Gly Thr Ala Gly
-15 -10 -5
Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
-1 1 5 10
Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
15 20 25
Thr Gly Tyr Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu
30 35 40 45
Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn
50 55 60
Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
65 70 75
Thr Ala His Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Leu
80 85 90
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln
95 100 105
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Thr Thr Thr Ala Pro Ser Val
110 115 120 125
Tyr Pro Leu Val Pro Gly Cys Ser Asp Thr Ser Gly Ser Ser Val Thr
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Lys
145 150 155
Trp Asn Tyr Gly Ala Leu Ser Ser Gly Val Arg Thr Val Ser Ser Val
160 165 170
Leu Gln Ser Gly Phe Tyr Ser Leu Ser Ser Leu Val Thr Val Pro Ser
175 180 185
Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Ile Cys Asn Val Ala His Pro Ala
190 195 200 205
Ser Lys Thr Glu Leu Ile Lys Arg Ile Glu Pro Arg Ile Pro Lys Pro
210 215 220
Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Cys Pro Pro Gly Asn Ile Leu Gly Gly
225 230 235
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ala Leu Met Ile
240 245 250
Ser Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp
255 260 265
Asp Pro Asp Val His Val Ser Trp Phe Val Asp Asn Lys Glu Val His
270 275 280 285
Thr Ala Trp Thr Gln Pro Arg Glu Ala Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg
290 295 300
Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Arg Gly Lys
305 310 315
Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
320 325 330
Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Arg Ala Gln Thr Pro Gln Val Tyr
335 340 345
Thr Ile Pro Pro Pro Arg Glu Gln Met Ser Lys Lys Lys Val Ser Leu
350 355 360 365
Thr Cys Leu Val Thr Asn Phe Phe Ser Glu Ala Ile Ser Val Glu Trp
370 375 380
Glu Arg Asn Gly Glu Leu Glu Gln Asp Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Ile
385 390 395
Leu Asp Ser Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
400 405 410
Thr Asp Ser Trp Leu Gln Gly Glu Ile Phe Thr Cys Ser Val Val His
415 420 425
Glu Ala Leu His Asn His His Thr Gln Lys Asn Leu Ser Arg Ser Pro
430 435 440 445
Gly Lys
<210>174
<211>1401
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的核苷酸序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1398)
<220>
<221>信号肽
<222>(1)..(57)
<220>
<221>成熟肽
<222>(58)..(1398)
<400>174
atg gga tgg agc tgg atc ttt ctc ttc ctt atg tca gga acg gca ggt 48
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Met Ser Gly Thr Ala Gly
-15 -10 -5
gtc ctc tct gag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gag ctg gtg aag 96
Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
-1 1 5 10
cct ggg gct tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct ggt tac tcc ttt 144
Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
15 20 25
act ggc tac ttt atg aac tgg gtg aag cag agc cat gga aag agc ctt 192
Thr Gly Tyr Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu
30 35 40 45
gag tgg att gga cgt att aat cct tac aat ggt gat act ttc tac aac 240
Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn
50 55 60
cag aag ttc aag ggc aag gcc aca ttg act gta gac aaa tcc tct agc 288
Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
65 70 75
aca gcc cac atg gag ctc cgg agc ctg aca tct gag gac tct gca ctc 336
Thr Ala His Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Leu
80 85 90
tat tat tgt gca aga tct ggt aac tat gtt atg gac tac tgg ggt caa 384
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln
95 100 105
gga acc tca gtc acc gtc tcc tca gct agc acc aag ggc cca tcg gtc 432
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
110 115 120 125
ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc 480
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155
tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc 576
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
160 165 170
cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc 624
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
175 180 185
tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac aag 672
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
190 195 200 205
ccc agc aac acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt gac 720
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga 768
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235
ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc 816
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
240 245 250
tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa 864
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
255 260 265
gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat 912
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
270 275 280 285
aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt 960
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag 1008
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315
gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag 1056
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
320 325 330
aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac 1104
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
335 340 345
acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg 1152
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
350 355 360 365
acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg 1200
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg 1248
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395
ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac 1296
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
400 405 410
aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat 1344
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
415 420 425
gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg 1392
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
430 435 440 445
ggt aaa tga 1401
Gly Lys
<210>175
<211>466
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>175
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Met Ser Gly Thr Ala Gly
-15 -10 -5
Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
-1 1 5 10
Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
15 20 25
Thr Gly Tyr Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu
30 35 40 45
Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn
50 55 60
Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
65 70 75
Thr Ala His Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Leu
80 85 90
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln
95 100 105
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
110 115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
160 165 170
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
175 180 185
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
190 195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val G1u Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
240 245 250
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
255 260 265
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
270 275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
320 325 330
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
335 340 345
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
350 355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
400 405 410
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
415 420 425
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
430 435 440 445
Gly Lys
<210>176
<211>336
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(336)
<400>176
gac att gtg ctc acc caa tct cca gct tct ttg gct gtg tct cta ggg 48
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
cag agt gtc acc atc tcc tgc aga gcc agt gaa agt gtt gaa tat tat 96
Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr
20 25 30
ggc act agt tta atg cag tgg tac caa cag aaa cca gga cag cca ccc 144
Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
aaa ctc ctc atc tat ggt gca tcc aac gta gaa tct ggg gtc cct gcc 192
Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
agg ttt agt ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc agc ctc aac atc cat 240
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65 70 75 80
cct gtg gag gag gat gat att gca atg tat ttc tgt cag caa agt agg 288
Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg
85 90 95
aag gtt ccg tgg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa cgg 336
Lys Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210>177
<211>112
<212>PRT
<213>小鼠
<400>177
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg
85 90 95
Lys Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210>178
<211>45
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(45)
<400>178
aga gcc agt gaa agt gtt gaa tat tat ggc act agt tta atg cag 45
Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu Met Gln
1 5 10 15
<210>179
<211>15
<212>PRT
<213>小鼠
<400>179
Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu Met Gln
1 5 10 15
<210>180
<211>21
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(21)
<400>180
ggt gca tcc aac gta gaa tct 21
Gly Ala Ser Asn Val Glu Ser
1 5
<210>181
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠
<400>181
Gly Ala Ser Asn Val Glu Ser
1 5
<210>182
<211>27
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(27)
<400>182
cag caa agt agg aag gtt ccg tgg acg 27
Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Trp Thr
1 5
<210>183
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>183
Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Trp Thr
1 5
<210>184
<211>717
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(714)
<220>
<221>信号肽
<222>(1)..(60)
<220>
<221>成熟肽
<222>(61)..(714)
<400>184
atg gag aca gac aca ctc ctg cta tgg gtg ctg ctg ctc tgg gtt cca 48
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
-20 -15 -10 -5
ggc tcc act ggt gac att gtg ctc acc caa tct cca gct tct ttg gct 96
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
-1 1 5 10
gtg tct cta ggg cag agt gtc acc atc tcc tgc aga gcc agt gaa agt 144
Val Ser Leu Gly Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser
15 20 25
gtt gaa tat tat ggc act agt tta atg cag tgg tac caa cag aaa cca 192
Val Glu Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
30 35 40
gga cag cca ccc aaa ctc ctc atc tat ggt gca tcc aac gta gaa tct 240
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Val Glu Ser
45 50 55 60
ggg gtc cct gcc agg ttt agt ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc agc 288
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser
65 70 75
ctc aac atc cat cct gtg gag gag gat gat att gca atg tat ttc tgt 336
Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys
80 85 90
cag caa agt agg aag gtt ccg tgg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg 384
Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
95 100 105
gaa atc aaa cgg gct gat gct gca cca act gta tcc atc ttc cca cca 432
Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro
110 115 120
tcc agt gag cag tta aca tct gga ggt gcc tca gtc gtg tgc ttc ttg 480
Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu
125 130 135 140
aac aac ttc tac ccc aaa gac atc aat gtc aag tgg aag att gat ggc 528
Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly
145 150 155
agt gaa cga caa aat ggc gtc ctg aac agt tgg act gat cag gac agc 576
Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser
160 165 170
aaa gac agc acc tac agc atg agc agc acc ctc acg ttg acc aag gac 624
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp
175 180 185
gag tat gaa cga cat aac agc tat acc tgt gag gcc act cac aag aca 672
Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr
190 195 200
tca act tca ccc att gtc aag agc ttc aac agg aat gag tgt tag 717
Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
205 210 215
<210>185
<211>238
<212>PRT
<213>小鼠
<400>185
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
-20 -15 -10 -5
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
-1 1 5 10
Val Ser Leu Gly Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser
15 20 25
Val Glu Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
30 35 40
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Val Glu Ser
45 50 55 60
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser
65 70 75
Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys
80 85 90
Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
95 100 105
Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro
110 115 120
Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu
125 130 135 140
Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly
145 150 155
Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser
160 165 170
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp
175 180 185
Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr
190 195 200
Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
205 210 215
<210>186
<211>717
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的核苷酸序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(714)
<220>
<221>信号肽
<222>(1)..(60)
<220>
<221>成熟肽
<222>(61)..(714)
<400>186
atg gag aca gac aca ctc ctg cta tgg gtg ctg ctg ctc tgg gtt cca 48
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
-20 -15 -10 -5
ggc tcc act ggt gac att gtg ctc acc caa tct cca gct tct ttg gct 96
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
-1 1 5 10
gtg tct cta ggg cag agt gtc acc atc tcc tgc aga gcc agt gaa agt 144
Val Ser Leu Gly Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser
15 20 25
gtt gaa tat tat ggc act agt tta atg cag tgg tac caa cag aaa cca 192
Val Glu Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
30 35 40
gga cag cca ccc aaa ctc ctc atc tat ggt gca tcc aac gta gaa tct 240
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Val Glu Ser
45 50 55 60
ggg gtc cct gcc agg ttt agt ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc agc 288
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser
65 70 75
ctc aac atc cat cct gtg gag gag gat gat att gca atg tat ttc tgt 336
Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys
80 85 90
cag caa agt agg aag gtt ccg tgg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg 384
Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
95 100 105
gaa atc aaa cgt acg gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca 432
Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
110 115 120
tct gat gag cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg 480
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
125 130 135 140
aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac 528
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
145 150 155
gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc 576
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
160 165 170
aag gac agc acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca 624
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
175 180 185
gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc 672
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
190 195 200
ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tga 717
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
205 210 215
<210>187
<211>238
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>187
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
-20 -15 -10 -5
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
-1 1 5 10
Val Ser Leu Gly Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser
15 20 25
Val Glu Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
30 35 40
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Val Glu Ser
45 50 55 60
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser
65 70 75
Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys
80 85 90
Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
95 100 105
Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
110 115 120
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
125 130 135 140
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
145 150 155
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
160 165 170
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
175 180 185
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
190 195 200
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
205 210 215
<210>188
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>188
atgtgtcact gcagccaggg accaa 25