人工心脏瓣膜及生物修补材料的加工方法 【技术领域】
本发明涉及一种医学上生物材料的加工方法，具体为一种人工心脏瓣膜及生物修补材料的加工方法。
背景技术
2007年度，我国人工生物瓣膜的使用比率达到19.7％，在这些生物瓣膜中，应用最多的异种生物组织材料是牛心包和猪主动脉瓣。经国内外报导取得了一定的临床效果；但是，据英国政府海绵状脑病顾问委员会的一位科学家警告说：由于西方疯牛病的影响，因疯牛病死亡的人数将以每年30％左右的速度逐年上升，最终每年可造成成千上万人丧生。我国已禁止了牛心包生物心脏瓣膜及其它生物修补材料的进口，因此急需研究开发新型的生物材料，以此满足巨大的市场需求。而毛驴为纯食草动物，与牛比较而言传染病较少见，迄今为止未发现有人畜共患疾病。经实验研究与牛心包对比，在生物力学、生物稳定性、生物毒性、免疫原性、抗钙化等方面，都无大的差距，完全可以替代牛心包用作心脏人工生物瓣膜及其它生物修补材料。
【发明内容】
本发明为克服现有技术的不足，提供一种驴心包心脏人工生物瓣膜及生物修补材料的加工方法。
本发明的目的是采用下述技术方案实现的：人工心脏瓣膜及生物修补材料的加工方法，用驴心包经预处理、鞣制及后处理等工序加工而成。
所述方法是先将驴心包去除表面脂肪、去细胞预处理后；使用双醛类鞣剂、环氧类鞣剂、多酚类鞣剂中的任意一类鞣剂进行鞣制，或使用前述鞣剂中的任意两类鞣剂复合鞣制或使用前述鞣剂中的三类鞣剂复合鞣制；驴心包经鞣制后再经氨基酸类、糖胺聚糖类或醇类化合物进行后处理。
具体方法为：
A.驴心包的准备：取新鲜驴心包，置入Hank’s液，在1-28℃的温度下保存6小时以内；
B.将驴心包从Hank’s液中取出，去除驴心包表面脂肪，冰盐水漂洗后，裁剪成片状；
C.将驴心包片依次浸入以下溶液，去除细胞免疫原性：
(1)浸入含浓度为8-12mmol/L的Tris-HCl、0.06-0.09mol/L的KCl和0.25-5mg/L的苯甲磺酰氟，pH值为7.0-8.5的低渗Tris-HCl缓冲液，在1-28℃下保存20-28小时；
(2)浸入含浓度为8-12mmol/L的Tris-HCl、0.06-0.09mol/L的KCl、0.25-5mg/L的苯甲磺酰氟和质量比为0.5-1.5％的Triton X-100，pH值为7.2-8.5的Triton X-100低渗Tris-HCl缓冲液，在1-28℃下保存20-28小时；
(3)浸入含10-100U/mL的Dnase和0.5-5U/mL的RDnase，pH值为7.2-7.8的Dnase和Rnase Hank’s液，在32-42℃下保存0.5-1.5小时；
(4)浸入含浓度为8-12mmol/L的Tris-HCl、0.06-0.09mol/L的KCl、0.25-5mg/L的苯甲磺酰氟和质量比为0.5-1.5％的Triton X-100，pH值为7.2-8.5的Triton X-100低渗Tris-HCl缓冲液，在1-28℃下保存20-28小时；
(5)浸入Hank’s液，在1-28℃下保存40-56小时；
D.鞣制：
将经过上述步骤的驴心包，浸入浓度为0.3％-0.9％(质量比)的戊二醛，或0.3％-1％(质量比)的京尼平，或1％-5％(质量比)的环氧化合物，或以上三种鞣剂复合使用，鞣制48-200小时；
E.后处理：
将鞣制后的驴心包经氨基酸类、糖胺聚糖类或醇类化合物进行后处理，以增强驴心包的使用性能。
其较佳加工方法为：
A.驴心包的准备：取新鲜驴心包，置入Hank’s液，在3-5℃的温度下保存6小时以内；
B.将驴心包从Hank’s液中取出，去除驴心包表面脂肪，冰盐水漂洗后，裁剪成片状；
C.将驴心包片依次浸入以下溶液，去除细胞免疫原性：
(1)浸入含浓度为9-11mmol/L的Tris-HCl、0.07-0.08mol/L的KCl和0.3-0.4mg/L的苯甲磺酰氟，pH值为7.0-8.2的低渗Tris-HCl缓冲液，在3-5℃下保存22-26小时；
(2)浸入含浓度为9-11mmol/L的Tris-HCl、0.07-0.08mol/L的KCl、0.3-0.4mg/L的苯甲磺酰氟和质量比为0.8-1.2％的Triton X-100，pH值为7.2-8.2的Triton X-100低渗Tris-HCl缓冲液，在3-5℃下保存22-26小时；
(3)浸入含40-60U/mL的Dnase和0.5-1.5U/mL的RDnase，pH值为7.4-7.6的Dnase和Rnase Hank’s液，在35-39℃下保存0.75-1.25小时；
(4)浸入含浓度为9-11mmol/L的Tris-HCl、0.07-0.08mol/L的KCl、0.3-0.4mg/L的苯甲磺酰氟和质量比为0.8-1.2％的Triton X-100，pH值为7.2-8.2地Triton X-100低渗Tris-HCl缓冲液，在3-5℃下保存22-26小时；(5)浸入Hank’s液，在3-5℃下保存45-51小时；
D.鞣制：
将经过上述步骤的驴心包，浸入浓度为0.4％-0.8％(质量比)的戊二醛，或0.3％-0.8％(质量比)的京尼平，或1％-4％(质量比)的环氧化合物，或以上三种鞣剂复合使用，鞣制48-160小时；
E.后处理：
将鞣制后的驴心包转入下列任一溶液进行后处理：
pH值为10-12、浓度为1-3％(质量比)的精氨酸PBS溶液中，在3-5℃下保存40-56小时；或
pH值为7.2-7.6、浓度为5-40％(质量比)的乙醇PBS溶液中，在3-5℃反复漂洗40-56h后，转入pH值为7.2-7.6的PBS溶液3-5℃反复漂洗40-56h；或
pH值为11-13、浓度为2-4％(质量比)的组氨酸PBS溶液中，在室温下保存50-62小时；或
pH值为7.2-7.6、浓度为2-3％(质量比)的肝素纳PBS溶液中，在3-5℃下保存40-56小时。
其最佳加工方法为：
A.驴心包的准备：取新鲜驴心包，置入Hank’s液，在4℃的温度下保存4小时以内；
B.去除驴心包表面脂肪，冰盐水漂洗后，裁剪成片状；
C.将驴心包片依次浸入以下溶液，去除细胞免疫原性：
(1)浸入含浓度为10mmol/L的Tris-HCl、0.075mol/L的KCl和0.35mg/L的苯甲磺酰氟，pH值为8.0的低渗Tris-HCl缓冲液，在4℃下保存24小时；
(2)浸入含浓度为10mmol/L的Tris-HCl、0.075mol/L的KCl、0.35mg/L的苯甲磺酰氟和质量比为1％的Triton X-100，pH值为8.0的1％Triton X-100低渗Tris-HCl缓冲液，在4℃下保存24小时；
(3)浸入含浓度为50U/mL的Dnase和1U/mL的RDnase，pH值为7.5的Dnase和Rnase Hank’s液，在37℃下保存1小时；
(4)浸入含浓度为10mmol/L的Tris-HCl、0.075mol/L的KCl、0.35mg/L的苯甲磺酰氟和质量比为1％的Triton X-100，pH值为8.0的1％Triton X-100低渗Tris-HCl缓冲液，在4℃下保存24小时；
(5)浸入Hank’s液，在4℃下保存48小时。
D.鞣制：
将经过上述步骤的驴心包，浸入浓度为0.6％(质量比)的戊二醛，37℃鞣制72小时；或0.5％(质量比)的京尼平，室温下鞣制72小时；或2％(质量比)的乙二醇缩水甘油醚，室温下鞣制48小时；或以上三种鞣剂复合使用。
E.后处理：
将鞣制后的驴心包转入下列任一溶液进行后处理：
pH值为11、浓度为2％(质量比)的精氨酸PBS溶液中，在4℃下保存48小时；或
pH值为7.4、浓度为5％-40％(质量比)的乙醇PBS溶液中，在4℃反复漂洗48h后，转入pH值为7.4的PBS溶液4℃反复漂洗48h；或
pH值为12、浓度为3％(质量比)的组氨酸PBS溶液中，在室温下保存56小时；或
pH值为7.4、浓度为2.5％(质量比)的肝素纳PBS溶液中，在4℃下保存48小时。
驴心包的基本结构是由胶原纤维形式的网状结构，其间填充着以蛋白聚糖为主的组织基质及各类细胞。组织基质及细胞的抗原性是引起生物材料钙化及免疫反应的原因之一。心包组织用去污剂处理和酶消化可以获得理想的脱细胞效果，而基质的三维结构基本不变，胶原纤维完好，是一种更为理想的脱细胞方法。
胶原纤维内含有氨基、羧基等官能团，这是其可以与鞣剂发生交联反应的化学基础。双醛类鞣剂、环氧类鞣剂及多酚类鞣剂可以和胶原纤维的游离氨基，羧基、羟基等官能团反应产生化学交联，增强胶原纤维的化学稳定性和物理机械强度。
鞣剂引入的一些活性基团(比如双醛类鞣剂的醛基)是引起生物材料钙化的另一潜在原因，通过加入后处理试剂可以封闭这些活性基团以达到减轻生物材料钙化的目的。另外，有些后处理试剂不但可以封闭这些活性基团，而且本身具有防止生物材料钙化的性能。
本发明的有益效果是：经证实经上述方法处理后的驴心包是一种良好的生物材料，能够用作生物人工心脏瓣膜及生物修补材料。
【具体实施方式】
实施例1：
人工心脏瓣膜及生物修补材料的加工方法：
A.驴心包的准备：取新鲜驴心包，置入Hank’s液，在4℃的温度下保存不超过4小时；
B.去除驴心包表面脂肪，冰盐水漂洗后，裁剪成片状；
C.将驴心包片依次浸入以下溶液，去除细胞免疫原性：
(1)浸入含浓度为10mmol/L的Tris-HCl、0.075mol/L的KCl和0.35mg/L的苯甲磺酰氟，pH值为8.0的低渗Tris-HCl缓冲液，在4℃下保存24小时；
(2)浸入含浓度为10mmol/L的Tris-HCl、0.075mol/L的KCl、0.35mg/L的苯甲磺酰氟和质量比为1％的Triton X-100，pH值为8.0的1％Triton X-100低渗Tris-HCl缓冲液，在4℃下保存24小时；
(3)浸入含浓度为50U/mL的Dnase和1U/mL的RDnase，pH值为7.5的Dnase和Rnase Hank’s液，在37℃下保存1小时；
(4)浸入含浓度为10mmol/L的Tris-HCl、0.075mol/L的KCl、0.35mg/L的苯甲磺酰氟和质量比为1％的Triton X-100，pH值为8.0的1％Triton X-100低渗Tris-HCl缓冲液，在4℃下保存24小时；
(5)浸入Hank’s液，在4℃下保存48小时。
D.鞣制：
将经过上述步骤的驴心包，浸入浓度为0.6％(质量比)的戊二醛，37℃鞣制72小时；
E.后处理：
将鞣制后的驴心包转入pH值为11、浓度为2％(质量比)的精氨酸PBS溶液中，在4℃下保存48小时。
实施例2：
人工心脏瓣膜及生物修补材料的加工方法：
A.驴心包的准备：取新鲜驴心包，置入Hank’s液，在1℃的温度下保存6小时；
B.将驴心包从Hank’s液中取出，去除驴心包表面脂肪，冰盐水漂洗后，裁剪成片状；
C.将驴心包片依次浸入以下溶液，去除细胞免疫原性：
(1)浸入含浓度为8mmol/L的Tris-HCl、0.06mol/L的KCl和5mg/L的苯甲磺酰氟，pH值为8.5的低渗Tris-HCl缓冲液，在1℃下保存28小时；
(2)浸入含浓度为8mmol/L的Tris-HCl、0.06mol/L的KCl、5mg/L的苯甲磺酰氟和质量比为0.5％的Triton X-100，pH值为8.5的Triton X-100低渗Tris-HCl缓冲液，在1℃下保存28小时；
(3)浸入含10U/mL的Dnase和0.5U/mL的RDnase，pH值为7.2的Dnase和Rnase Hank’s液，在32℃下保存1.5小时；
(4)浸入含浓度为8mmol/L的Tris-HCl、0.06mol/L的KCl、5mg/L的苯甲磺酰氟和质量比为0.5％的Triton X-100，pH值为8.5的Triton X-100低渗Tris-HCl缓冲液，在1℃下保存28小时；
(5)浸入Hank’s液，在1℃下保存56小时；
D.鞣制：
将经过上述步骤的驴心包，浸入浓度为0.5％(质量比)的京尼平，37℃鞣制48小时；
E.后处理：
将京尼平鞣制后的驴心包转入pH值为7.4、浓度为25％(质量比)的乙醇PBS溶液中，在4℃反复漂洗48h后，转入pH值为7.4的PBS溶液4℃反复漂洗48h。
实施例3：
人工心脏瓣膜及生物修补材料的加工方法：
A.驴心包的准备：取新鲜驴心包，置入Hank’s液，在28℃的温度下保存4小时；
B.将驴心包从Hank’s液中取出，去除驴心包表面脂肪，冰盐水漂洗后，裁剪成片状；
C.将驴心包片依次浸入以下溶液，去除细胞免疫原性：
(1)浸入含浓度为12mmol/L的Tris-HCl、0.09mol/L的KCl和0.25mg/L的苯甲磺酰氟，pH值为7.0的低渗Tris-HCl缓冲液，在28℃下保存20小时；
(2)浸入含浓度为12mmol/L的Tris-HCl、0.09mol/L的KCl、0.25mg/L的苯甲磺酰氟和质量比为1.5％的Triton X-100，pH值为7.2的Triton X-100低渗Tris-HCl缓冲液，在28℃下保存20小时；
(3)浸入含100U/mL的Dnase和5U/mL的RDnase，pH值为7.8的Dnase和Rnase Hank’s液，在42℃下保存0.5小时；
(4)浸入含浓度为12mmol/L的Tris-HCl、0.09mol/L的KCl、0.25mg/L的苯甲磺酰氟和质量比为1.5％的Triton X-100，pH值为7.2的Triton X-100低渗Tris-HCl缓冲液，在28℃下保存20小时；
(5)浸入Hank’s液，在28℃下保存40小时；
D.鞣制：
将经过上述步骤的驴心包，浸入浓度为0.4％(质量比)的戊二醛，室温保存56小时；
E.后处理：
经上述步骤处理的驴心包，转入pH值为12、浓度为3％(质量比)的组氨酸PBS溶液中，在室温下保存56小时。
实施例4：
人工心脏瓣膜及生物修补材料的加工方法：
A.驴心包的准备：取新鲜驴心包，置入Hank’s液，在3℃的温度下保存5小时；
B.将驴心包从Hank’s液中取出，去除驴心包表面脂肪，冰盐水反复漂洗后，裁剪成片状；
C.将驴心包片依次浸入以下溶液，去除细胞免疫原性：
(1)浸入含浓度为9mmol/L的Tris-HCl、0.07mol/L的KCl和0.3mg/L的苯甲磺酰氟，pH值为7.0的低渗Tris-HCl缓冲液，在3℃下保存22小时；
(2)浸入含浓度为9mmol/L的Tris-HCl、0.07mol/L的KCl、0.3mg/L的苯甲磺酰氟和质量比为0.8％的Triton X-100，pH值为7.2的Triton X-100低渗Tris-HCl缓冲液，在3℃下保存22小时；
(3)浸入含40U/mL的Dnase和0.5U/mL的RDnase，pH值为7.4的Dnase和Rnase Hank’s液，在35℃下保存0.75小时；
(4)浸入含浓度为9mmol/L的Tris-HCl、0.07mol/L的KCl、0.3mg/L的苯甲磺酰氟和质量比为0.8％的Triton X-100，pH值为7.2的Triton X-100低渗Tris-HCl缓冲液，在3℃下保存22小时；
(5)浸入Hank’s液，在3℃下保存45小时；
D.鞣制：
将经过上述步骤的驴心包，浸入浓度为2％(质量比)的乙二醇缩水甘油醚，室温保存48小时。
E.后处理：
转入pH值为7.4、浓度为10％(质量比)的乙醇PBS溶液中，在4℃反复漂洗48h后，转入pH值为7.4PBS溶液4℃反复漂洗48h。
实施例5：
人工心脏瓣膜及生物修补材料的加工方法：
A.驴心包的准备：取新鲜驴心包，置入Hank’s液，在5℃的温度下保存3小时；
B.将驴心包从Hank’s液中取出，去除驴心包表面脂肪，冰盐水反复漂洗后，裁剪成片状；
C.将驴心包片依次浸入以下溶液，去除细胞免疫原性：
(1)浸入含浓度为11mmol/L的Tris-HCl、0.08mol/L的KCl和0.4mg/L的苯甲磺酰氟，pH值为8.2的低渗Tris-HCl缓冲液，在5℃下保存26小时；
(2)浸入含浓度为11mmol/L的Tris-HCl、0.08mol/L的KCl、0.4mg/L的苯甲磺酰氟和质量比为1.2％的Triton X-100，pH值为8.2的Triton X-100低渗Tris-HCl缓冲液，在5℃下保存26小时；
(3)浸入含60U/mL的Dnase和1.5U/mL的RDnase，pH值为7.6的Dnase和Rnase Hank’s液，在39℃下保存1.25小时；
(4)浸入含浓度为11mmol/L的Tris-HCl、0.08mol/L的KCl、0.4mg/L的苯甲磺酰氟和质量比为1.2％的Triton X-100，pH值为8.2的Triton X-100低渗Tris-HCl缓冲液，在5℃下保存26小时；
(5)浸入Hank’s液，在5℃下保存51小时；
D.鞣制
将经过上述步骤的驴心包，浸入浓度为0.5％(质量比)的京尼平，室温保存72小时；
E.后处理
转入pH值为7.4、浓度为2.5％(质量比)的肝素纳PBS溶液中，在4℃下处理48小时。
实施例6：
鞣制前步骤同实施例1；
D.鞣制：
将经过上述步骤的驴心包，浸入浓度为0.3％(质量比)的戊二醛，室温保存200小时；
E.后处理：
将鞣制后的驴心包转入pH值为10、浓度为3％(质量比)的精氨酸PBS溶液中，在5℃下保存40小时；
实施例7：
鞣制前步骤同实施例1；
D.鞣制：
将经过上述步骤的驴心包，浸入浓度为0.5％(质量比)的戊二醛，室温保存48小时；
E.后处理：
将鞣制后的驴心包转入pH值为12、浓度为1％(质量比)的精氨酸PBS溶液中，在3℃下保存56小时。
实施例8：
鞣制前步骤同实施例1；
D.鞣制：
将经过上述步骤的驴心包，浸入浓度为0.9(质量比)％的戊二醛，室温保存48小时；
E.后处理：
将鞣制后的驴心包转入pH值为12、浓度为1％(质量比)的精氨酸PBS溶液中，在3℃下保存56小时。
实施例9：
鞣制前步骤同实施例1；
D.鞣制：
将经过上述步骤的驴心包，浸入浓度为0.8％(质量比)的戊二醛，室温保存160小时；
E.后处理：
将鞣制后的驴心包转入pH值为7.6、浓度为40％(质量比)的乙醇PBS溶液中，在3℃反复漂洗40h后，转入pH值为7.6的PBS溶液3℃反复漂洗40h。
实施例10：
鞣制前步骤同实施例1；
D.鞣制：
将经过上述步骤的驴心包，浸入浓度为0.3％(质量比)的京尼平，室温保存100小时；
E.后处理：
将鞣制后的驴心包转入pH值为7.2、浓度为5％(质量比)的乙醇PBS溶液中，在5℃反复漂洗56h后，转入pH值为7.2的PBS溶液5℃反复漂洗56h。
实施例11：
鞣制前步骤同实施例1；
D.鞣制：
将经过上述步骤的驴心包，浸入浓度为0.8％(质量比)的京尼平，室温保存60小时；
E.后处理：
将鞣制后的驴心包转入pH值为11、浓度为4％(质量比)的组氨酸PBS溶液中，在室温下保存50小时。
实施例12：
鞣制前步骤同实施例1；
D.鞣制：
将经过上述步骤的驴心包，浸入浓度为1％(质量比)的京尼平，室温保存50小时；
E.后处理：
将鞣制后的驴心包转入pH值为13、浓度为2％(质量比)的组氨酸PBS溶液中，在室温下保存62小时。
实施例13：
鞣制前步骤同实施例1；
D.鞣制：
将经过上述步骤的驴心包，浸入浓度为1％(质量比)的乙二醇缩水甘油醚，室温保存80小时；
E.后处理：
将鞣制后的驴心包转入pH值为7.6、浓度为2％(质量比)的肝素纳PBS溶液中，在3℃下保存40小时。
实施例14：
鞣制前步骤同实施例1；
D.鞣制：
将经过上述步骤的驴心包，浸入浓度为4％(质量比)的乙二醇缩水甘油醚，室温保存80小时；
E.后处理：
将鞣制后的驴心包转入pH值为7.2、浓度为3％(质量比)的肝素纳PBS溶液中，在5℃下保存56小时。
实施例15：
鞣制前步骤同实施例1；
D.鞣制：
将经过上述步骤的驴心包，浸入浓度为5％(质量比)的乙二醇缩水甘油醚，室温保存48小时；
E.后处理：
将鞣制后的驴心包转入pH值为11、浓度为2％(质量比)的精氨酸PBS溶液中，在4℃下保存48小时。
实施例16：
鞣制前步骤同实施例1；
D.复合鞣制：
将经过上述步骤的驴心包，先浸入浓度为0.6％(质量比)的戊二醛，37℃鞣制72小时；再浸入0.5％(质量比)的京尼平，室温下鞣制72小时；
E.后处理：
将鞣制后的驴心包转入pH值为11、浓度为2％(质量比)的精氨酸PBS溶液中，在4℃下保存48小时。
实施例17：
鞣制前步骤同实施例1；
D.复合鞣制：
将经过上述步骤的驴心包，先浸入浓度为0.6％(质量比)的戊二醛，37℃鞣制72小时；再浸入浓度为2％(质量比)的乙二醇缩水甘油醚，室温下鞣制48小时；
E.后处理：
将鞣制后的驴心包转入pH值为11、浓度为2％(质量比)的精氨酸PBS溶液中，在4℃下保存48小时。
实施例18：
鞣制前步骤同实施例1；
D.复合鞣制：
将经过上述步骤的驴心包，先浸入浓度为0.5％(质量比)的京尼平，室温下鞣制72小时；再浸入浓度为2％(质量比)的乙二醇缩水甘油醚，室温下鞣制48小时；
E.后处理：
将鞣制后的驴心包转入pH值为11、浓度为2％(质量比)的精氨酸PBS溶液中，在4℃下保存48小时。
实施例19：
鞣制前步骤同实施例1；
D.复合鞣制：
将经过上述步骤的驴心包，先浸入浓度为0.6％(质量比)的戊二醛，再浸入0.5％(质量比)的京尼平，室温下鞣制72小时；再浸入浓度为2％(质量比)的乙二醇缩水甘油醚，室温下鞣制48小时；
E.后处理：
将鞣制后的驴心包转入pH值为11、浓度为2％的精氨酸PBS溶液中，在4℃下保存48小时。