对虾白斑综合征病毒VP37p多肽片段与应用 【技术领域】
本发明涉及一种对虾白斑综合征病毒(WSSV)基因的核苷酸序列。具体地说，本发明涉及对虾白斑综合征病毒VP37的核苷酸序列片段(VP37p)，还涉及由该核苷酸部分序列编码的一种具有粘附活性的多肽。本发明还涉及这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和多肽的生产方法。
背景技术
对虾白斑杆状病毒(WSSV)是近年来危害我国及亚洲太平洋地区人工养殖对虾的主要病毒原之一，它能高致死率地侵染绝大多数种类的对虾，此外还可侵染淡水及海洋生态系统中多种蟹类、龙虾类、端足类、水蝇类等甲壳纲动物，具有较广泛的宿主范围，因此它不仅严重危害对虾养殖，还对海洋生态造成了影响。WSSV是双链DNA病毒，基因组全长305Kb，是迄今为止发现的最大的动物病毒(J Virol 200175：11811-11820)。基因组序列遗传及形态学特征都表明WSSV是一种新病毒，它不属于目前已知的任一种病毒家族，因此国际病毒分类委员会将WSSV归属为新的Whispovirus属，Nimaviridae种(www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/Ictv/index.htm)。由于这是一个全新的病毒，而且WSSV基因组较大，所以绝大多数WSSV病毒结构蛋白与其他病毒没有同源性，因此这些蛋白的功能无法通过与其他病毒蛋白的同源性分析进行预测，因而使WSSV功能研究具有极大的难度。已有20余个基因初步确证其功能，尚有许多基因的功能未知。目前还难以对WSSV进进预防和控制，一方面由于WSSV能在自然环境中存活长时间，更重要的是人们对此病毒分子水平的了解还很少。粘附是病毒粘附蛋白与细胞受体的结合过程，粘附启动病毒与宿主细胞的相互作用，是建立感染、损伤细胞的必然途径。病毒入侵宿主细胞前的识别和粘附是引发感染的关键步骤，病毒只有与细胞受体结合才能进入扩增循环。近期的研究结果表明，WSSV感染宿主细胞的初期，必须具有完整囊膜结构，表明WSSV感染宿主细胞初期必须首先经过一个亲和吸附和相互作用的过程。阻断这一过程，将可能达到抑制WSSV感染的目的。目前已有应用WSSV囊膜蛋白作为疫苗防止WSSV的专利，包括利用WSSV的VP28，VP26，VP24，VP19等。WSV254编码的多肽片段活性分析表明VP37p不仅是WSSV的一种囊膜蛋白，而且为WSSV感染虾体的粘附蛋白片段，更进一步指出是RGD位点在起作用。本发明的创新处在于，应用粘附蛋白多肽片段从阻断WSSV与宿主相互作用控制WSSV的感染。
【发明内容】
本发明中的编码VP37p序列是如此获得的。以纯化的WSSV基因组DNA作为模板。根据WSV254序列的一部分(133bp-299bp)设计合成SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的序列作为引物，经PCR扩增获得了WSV254的部分序列SED ID No.1的序列。然后通过重组表达VP37p基因，纯化VP37p基因的表达产物，通过ELISA方法与荧光标记的方法，确定其与对虾细胞的结合活性，动物活体实验分析其在甲壳动物抗WSSV感染抑制的作用。在本发明被公布之前，尚没有任何人公开过本申请中涉及的VP37p序列。
本发明的目的是提供一种新的WSSV多肽，它包括：具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽，或者其活性片段，或其活性衍生物。较佳，该多肽是具有SEQ ID No.1序列的多肽。此蛋白被命名为VP37p。
本发明的另一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的VP37p的方法。
本发明还提供了VP37p的应用，即蛋白疫苗，其含有VP37p编码序列，以及药学上可接受的载体。更明确的，本发明的这种疫苗含有SEQ ID No.2中所述的氨基酸序列或其衍生序列。
此外，本发明的核酸序列可以被用来制造核酸疫苗，对甲壳动物进行接种，以抗WSSV感染。载体疫苗包括活的减毒细菌或病毒疫苗，以及药学上可接受的载体。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明中分离的多核苷酸全长为167个核苷酸，其详细序列见SEQID No.1，其中开放阅读框位于1-167位核苷酸。
另一方面，本发明还包括对VP37p DNA或是其片段编码的多肽能特异性相互作用地多克隆抗体、单克隆抗体及其它能抑制VP37p基因产物或片段。
本发明的技术方案如下：
1.WSSV-VP37p基因的制备：
(1)WSSV病毒基因组的制备：将提纯的病毒置于0.2mg/ml蛋白酶K和1％月桂酰肌氨酸钠中，在65℃中静置2h。用氯仿和苯酚抽提后将得到的产物溶于50μl TE。-20℃保存，作为PCR扩增模板。
(2)PCR扩增VP37p基因：以病毒DNA为模板，PCR扩增目的基因VP37p。PCR反应条件为：50μl反应体系中含50μL 10xPCR buffer，4μL 25mmol/L MgC12，1μL dNTPs，上、下游引物各0.5μL，0.5μL Taq DNA聚合酶(5U/L)，0.5μL模板。PCR反应条件：94℃ 10min，94℃ 30s，51.0℃ 30s 72℃ 1min(8个循环)，94℃ 30s，56.2℃ 30s，72℃ 1min(30个循环)，72℃ 10min。取2μl PCR产物作1％琼脂糖凝胶电泳，PCR产物应在约170bp处有一条扩增带。
2.重组体的构建：
(1)表达载体的构建：用Xho I和Hind III对VP37p基因片段和质粒pBAD/gIIIA进行双酶切，酶切片段经过16℃连接过夜，然后转化到大肠杆菌Top10中，筛选重组体，提取重组载体质粒，进行双酶切并对该重组载体质粒进行测序鉴定。
(2)目的产物VP37p的表达：挑单菌落接种到含Amp的新鲜丰富LB液体培养基中，37℃培养8～10h，之后按1％接种到新鲜的LB液体培养基中，37℃培养到OD值为0.6时加终浓度为0.4mmol/L的阿拉伯糖诱导，离心收集菌体。将菌体裂解后分别收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE和Western-blot。
(3)纯化VP37p：将得到的裂解物沉淀收集，镍琼脂糖凝胶装柱，用缓冲液平衡2-5个床体积，将收集的沉淀重悬(50mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl)0.45μm滤膜过滤，上样流速1ml/min，选择在50mM的咪唑缓冲液的阶段选择洗脱，收集。
3.荧光显微镜观察VP37p与对虾血细胞的作用：
(1)荧光素标记纯化VP37p：荧光素FITC溶于DMSO中之后混合于1mg VP37p蛋白。将混合物在室温下轻微振荡2h后，过G-50葡聚糖凝胶柱，使得没有标记的荧光素和与VP37p蛋白结合的荧光素分离。用相同的方法标记BSA作为对照组。
(2)对虾血细胞原代培养：将健康的克氏原螯虾用75％的乙醇拭擦，采用心脏取血。离心分离后，取血细胞重悬于L-15培养基中。将细胞培养板密封后置于28℃直到有70％-80％的单层贴壁细胞出现。将培养基和培养的血细胞分离之后，用PBS缓冲液洗涤细胞。
(3)显微镜方法：每个孔内加入100μl用FITC标记好的VP37p(约5μg)，在室温下经过1h后用PBS洗2次，同时用DAPI(4’，6’-diamidino-2-phenylindole，Invitrogen)染核，荧光显微镜观察。FITC-BSA做对照。
4.动物活体实验分析VP37p在甲壳动物抗WSSV感染抑制的作用：将表达的VP37p多肽片段以2-5％(W/W)的比例均匀加入普通饵料中制成药饵，挑选体重15-20g的健康螯虾，随机分为4个处理组，(a.VP37p组，b.空载体组，c.阳性对照组，d.阴性对照组)，各实验组分别投喂各种饲料，连续喂3或9天，然后分别投喂(除阴性对照组外)WSSV感染致死的剪碎螯虾，记录各组死亡率。
在本发明中，术语“编码VP37p序列”是指编码具有WSV254蛋白活性的多肽的核苷酸序列的一部分(133bp-299bp)。
该术语还包括能编码具有与VP37p相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.1序列的变异形式。这些形式包括：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5‘和/或3’添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地10个以内，最佳的5个以内)核苷酸。
在本发明中，“纯化”VP37p是指其至少占样品总物质的至少50％，较佳地至少75％，更佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯化可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC测量多肽的纯度。
在本发明中，术语“VP37p”指具有基因调控活性的SEQ ID NO.2的多肽。该术语还包括具有基因调控功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳的1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为30个以内，较佳地为10个以内，更佳地5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括VP37p多肽的活性片段和活性衍生物。
在本发明中，术语“WSSV感染抑制”是指在易感WSSV的动物中，WSSV感染的发生率和严重程度的降低，如降低动物死亡数量。如果相对于对照群体，VP37p降低感染性至少10％，通常至少20％，较好至少50％或更高时即达到WSSV感染抑制。
在本发明中，术语“甲壳动物”，通常指“虾”，“螃蟹”和“龙虾”甲壳动物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、修饰形式、在高或低的严谨度条件下能与WSV254 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗VP37p多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其它多肽，如包含VP37p多肽或片段的融合蛋白。
本发明还提供VP37p蛋白多肽的类似物，这些类似物与天然VP37p多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传突变体，诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生的随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知的分子生物学技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如-氨基酸)类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述列举的代表性多肽。
本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。
本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。
在本申请的说明书和附图中，用于表示碱基(核苷酸)，氨基酸等的缩写是由生化命名IUPAC-IUB委员会推荐的那些和本领域常用的那些，说明如下：
DNA：脱氧核糖核酸；A：腺嘌呤；T：胸腺嘧啶；G：鸟嘌呤；C：胞嘧啶；
G，Gly：苷氨酸；A，Ala：丙氨酸；V，Val：缬氨酸；L，Leu：亮氨酸；I，Ile：异亮氨酸；S，Ser：丝氨酸；T，Thr：苏氨酸；C，Cys：半胱氨酸；M，Met：甲硫氨酸；E，Glu：谷氨酸；D，Asp：天门冬氨酸；K，Lys：赖氨酸；R，A：g：精氨酸；H，His：组氨酸；F，Phe：苯丙氨酸；Y，Tyr：酪氨酸；W，Trp：色氨酸；P，Pro：脯氨酸；N，Asn：天冬酰胺；Q，Gin：谷酰胺。
附图说明：
图1PCR扩增WSSV-VP37p
图1说明如下：Lane 1，2.PCR扩增VP37p；Lane M：DNA Marker
图2重组质粒的双酶切核酸电泳图
图2说明如下：Lane M1，M2，分别为DNA marker DL15000和DL2000
1，空质粒；2，重组质粒；3，重组质粒双酶切；
图3重组VP37p及表达纯化的SDS-PAGE图谱
图3说明如下：1，空载体；2.重组体上清；3，4.重组体；5，Marker；6.纯化VP37p；
图4FITC-VP37p与对虾血细胞特异结合FITC-VP37.荧光素际记VP37；FITC-BSA荧光素标记牛血清白蛋白
图5使用VP37p蛋白片段对WSSV感染的抑制
【具体实施方式】
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等，分子克隆：实验室手册New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的实验条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 WSV254基因片段的克隆和测序
以WSSV基因组DNA为模板，用引物P1、P2扩增WSV254基因部分片段(133bp-299bp)。
P1：5’-AGACTCGAGATGAGACGTCAAGTTG-3’；
P2：5’-GAGAAGCTTGTCAATGAGGGAGTTA-3’；
划线部分CTCGAG为Xhol酶切位点，AAGCTT为Hind酶切位点，PCR反应条件为：
94℃ 10分钟
94℃ 30秒
44.2℃ 30秒
72℃ 1分钟(8个循环)
94℃ 30秒
51.7℃ 30秒
72℃ 1分钟(30个循环)
72℃ 10分钟
琼脂糖凝胶电泳纯化扩增片段后，克隆到原核表达质粒载体pBADg A，获得重组表达质粒pBADg A-rVP37p，进行测序，测序所得WSV254部分基因序列详见SEQIDNo.1.
根据得到的核苷酸序列推导出的WSV254的氨基酸序列，共55个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQIDNo.2.
图1PCR扩增WSSV-VP37p 图1说明如下：Lane 1，2.PCR扩增VP37p；Lane M DNA Marker
实施例2 重组VP37p片段的表达与纯化
将含有WSV254基因的重组表达质粒pBADg A-rVP37p转化大肠杆菌TOP 10，选取阳性克隆在含100mg/L氨苄霉素的LB培养基中37℃摇培至OD600＝0.6时，加入L-阿拉伯糖至终浓度0.2％，37℃诱导5h后收集菌体。加入冰冷的裂解缓冲液(1×PBS，10mM NaHPO4，140mM NaCl，2.7mM KCL，1.8mM KH2HPO4)，超声裂解细菌(300W×10s×10次)，4℃ 15,000rpm离心20min，装镊柱(Ni-nitriloaceticacid resins)，用5-10个柱床体积的洗涤缓冲液(1×PBS)洗去杂蛋白；洗脱缓冲液(50mM Tris-HCL，100mM，米唑，pH 8.0)洗脱目的蛋白。用SDS-PAGE鉴定纯化的蛋白的分子量约为12.09kD，纯度达90％以上。结果见图1。
图2重组质粒的双酶切核酸电泳图，图1说明如下：Lane M1，M2，分别为DNA marker DL15000和DL20001，空质粒；2，重组质粒；3，重组质粒双酶切；
图3重组VP37p表达纯化的SDS-PAGE图谱，图1说明如下：1，阿拉伯糖诱导的空载质粒菌株；2，诱导细胞的可溶性蛋白；3和4，诱导细胞的不可溶性蛋白；5，Marker；6，经Ni-nitriloacetic acid resins柱纯化所得到的目的蛋白；
实施例3 重组VP37p片段与虾细胞结合活性
选择贴壁良好的细胞置于4℃预冷1h，倒掉培养基，用冷PBS缓冲液小心洗涤2次，加入荧光素标记的VP37p，在4℃条件下结合2h，然后用PBS缓冲液小心洗涤2次，DAPI染细胞核后，直接在荧光显微镜下(0lympus)观察结果。同时以未标记的VP37p和FITC标记的牛血清白蛋白(BSA)做空白对照。
FITC标记的VP37p与贴壁细胞作用后，在荧光显微镜下可见绿色荧光，同一视野可观察到DAPI染色的蓝色的细胞核，两个视野叠加后可见绿色荧光恰好与蓝色荧光叠加，而对照只观察到细胞核染色的蓝色荧光，未观察到绿色荧光，表明FITC标记的VP37p可与对虾血细胞特异结合。
图4FITC-VP37p与对虾血细胞特异结合
实施例4 重组VP37p片段的抗体制备
将实施例2中获得的纯化的重组蛋白用等体积的完全Freund’s佐剂乳化，用0.25-0.5mg/mL乳化过的蛋白对小鼠进行皮下注射，每只0.2mL。2周后用不完全Freund’s佐剂乳化的同样剂量的相同抗原再注射以加强免疫产生抗体，之后每隔10天加强免疫一次，至少进行2次。分析所获抗血清的滴度和特异性。
在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动和修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例5：使用VP37p蛋白片段对WSSV感染的抑制
(1)药饵制作：将表达的VP37p多肽片段以2-5％(W/W)的比例均匀加入普通饵料中制成药饵，晾干后封存，备用。
(2)实验动物分组：a VP37p组，b.空载体组，饵料中加入2-5％空载体发酵液；c.阳性对照组，投喂普通饵料；d.阴性对照组，投喂普通饵料。挑选体重15-20g的健康螯虾，随机分为4个处理组，每个实验组3个重复，每组10尾，实验前暂养7天。
(3)动物实验：各实验组分别投喂各种饲料，连续喂3或9天，然后分别投喂(除阴性对照组外)WSSV感染致死的剪碎螯虾，记录各组死亡率。
图5使用VP37p蛋白片段对WSSV感染的抑制.
图5说明如下：VP37p组(×)，空载体组(▲)，阳性对照组(■)，阴性对照组(◆).
【序列表】
1.SEQ ID No.1的信息
(1)序列特征
A.长度：167bp
B.类型：核酸
C.链性：双链
D.拓扑结构：线性
(2)分子类型：DNA
(3)序列描述：SEQ ID No.1
1 atgagacgtc aagttgaagc tgcattatat gaagcaatat ccaaaaagaa agaaaaggcc
61 ataaaggcat tcgatgagct catacaagaa agaggtgatg aaattacacc tttgactaca
121 atgcagtatg aagagtgggt aaaccgtaca ataactccct cattgac
2.SEQ ID No.2的信息
(1)序列特征
A.长度：55个氨基酸
B.类型：氨基酸
C.拓扑结构：线性
(2)分子类型：蛋白质
(3)序列描述：SEQ ID No.2
1 MRRQVEAALY EAISKKKEKA IKAFDELIQE RGDEITPLTT
41 MQYEEWVNRT ITPSL
3.SEQ IDNo.3的信息
(1)序列特征
E.长度：25bp
F.类型：核酸
G.链性：单链
H.拓扑结构：线性
(2)分子类型：寡核苷酸
(3)序列描述：SEQ ID No.3
AGACTCGAGATGAGACGTCAAGTTG
4.SEQ ID No.4的信息
(1)序列特征
I.长度：25bp
J.类型：核酸
K.链性：单链
L.拓扑结构：线性
(2)分子类型：寡核苷酸
(3)序列描述：SEQ ID No.4
GAGAAGCTTGTCAATGAGGGAGTTA