一类水溶性紫杉烷类药物的制备方法和应用 技术领域 ：
本发明涉及一种水溶性药物制备方法与应用， 特别涉及一种水溶性紫杉烷类药 物， 它们的制备方法及其在临床肿瘤治疗中的应用。 背景技术 ：
紫杉烷类药物一般包括紫杉醇及其衍生物， 多烯紫杉醇及其衍生物。紫杉醇是白 色或类白色粉末， 其分子式为 C47H51NO14， 分子量为 853.9， 脂溶性强， 易溶于氯仿、 乙醇等有 机溶剂 ； 多烯紫杉醇是白色或类白色粉末， 其分子式为 C43H55NO13， 脂溶性较强， 易溶于氯仿、 乙醇、 丙酮等有机溶剂 ； 紫杉烷类药物的溶解度非常低， 其中紫杉醇的溶解度小于 0.004g/ L， 而多西紫杉醇的溶解度小于 0.01g/L。
紫杉醇 (Taxol ) 和多烯紫杉醇 (Taxotere ) 分别在 1992 年及 1996 年经美 国药物食品管理局批准为抗癌新药， 用于治疗卵巢癌、 乳腺癌、 皮肤癌、 肺癌以及头颈部癌， 其临床使用剂型均采用静脉注射。紫杉醇和多烯紫杉醇的作用机制相似， 主要是与游离的 微管次体结合， 并且不断促进微管聚合， 进而干扰有丝分裂和细胞复制的进行 ； 在一些组织 培养中可以发现， 多烯紫杉醇比紫杉醇具有更强的有丝分裂抑制作用。 紫杉醇和多烯紫杉醇的水溶性非常差， 这给开发注射剂带来了很大的问题。为 了改善紫杉醇在水溶液中的溶解度， 一些静脉滴注用的紫杉醇组合物中应用了 Cremophor EL( 聚乙氧基蓖麻油和环氧乙烷的缩合产物 )。 Cremophor EL 已被证实是有较大毒副作用， 在给狗静脉给药后会产生血管舒张、 呼吸困难、 昏睡、 低血压和死亡， 而且该溶媒具有血管 高致敏性， 使得紫杉醇注射剂在临床上的应用受到很多限制。同样， 多烯紫杉醇 (Taxotere ) 注射液中含有聚山梨酯 -80(Tween-80) 作为增溶剂， 静脉注射也可能产生溶血等反应。 所以人们一直想用新技术来提供更好的临床用药方式。 显然， 开发更多水溶性好、 而且安全 和有效 的新型紫杉烷类注射剂， 是非常必要的。
通过制备水溶性前药可以较好地解决紫杉烷类药物的水溶性问题。 在此领域已有 一些研究和报导。包括 ： 2’ 端成盐 ( 磺化、 酰化、 鎓盐、 硫代硫酸盐 )， 2’ 或 7’ 端连接聚氨 基酸， 连接臂连接水溶性的高分子 (PEG 作为载体， 氨基酸或寡肽， 苹果酸或柠檬酸作为连 接臂 )。有专利 ( 中国专利公开号 CN1895676) 报道合成以聚乙二醇为载体， 羟基乙酸或乳 酸作为连接臂的紫杉烷类水溶性前药， 与紫杉醇相比， 水溶性和抑瘤率明显增强。另有报 道 ( 中国专利公开号 CN101724021A) 在紫杉醇 2’ 或 7’ 羟基上连接多肽 ( 奥曲肽或其类似 物 )， 可以增加药物的水溶性， 同时复合物具有良好的靶向作用。
但另一方面， 如何让前药在体内适时地降解成原型药是另一个重要的问题。目前 关于肿瘤环境靶向给药的研究思路引人注目， 一般包括 pH 敏感和酶敏感二种策略。后者是 利用肿瘤组织中特有的酶系统， 选择一些此类酶的底物作为联结剂， 并联结到水溶性大分 子和抗癌药物之间， 由于联系剂对肿瘤组织有选择性， 可以在肿瘤组织中被肿瘤组织特有 的酶所降解， 并释放出抗癌药物的原型分子， 从而发挥特异性的抗肿瘤效果。这种靶向给 药的思路可以提高疗效， 并且降低药物的毒性。有专利 ( 中国专利公开号 CN1629150) 报道
合成了一种聚乙二醇脂肪族聚酯嵌段共聚物的紫杉醇前药， 其高分子载体具有生物可降解 性， 进入体内后， 在脂肪酶的作用下， 药物很容易从结合部位解离。
组织蛋白酶 B(CB) 是一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶， 其分子量为 30KDa。在多种肿瘤 中， 由于 CB 可以催化多种细胞外基质元件降解， 其与肿瘤的发生和转移密切相关。CB 也直 接激活溶酶体介导的细胞基质降解。 只有在如肿瘤、 风湿性关节炎一类的病理情况下， CB 才 存在于细胞外。CB 可以特异性识别多肽中 -HN-Val-Cit-CONH 片段 ( 红色部分 ) 并切断 Cit 羧基端的酰胺键， 产生的中间体 PABC-X-Drug 会进一步发生电子迁移， 发生 1， 6- 消除， 从而 释放出药物。
本发明通过大量的研究工作证明， 在 PTX 和 PEG 中间联结 VC 或 VC-PABC，化合物 的水溶性大幅度提高， 可以很容易地制备紫杉烷类的水溶性注射剂 ； 而且通过研究， 意外发 现， 此类偶联物的毒性明显降低， 体内抗肿瘤作用与 PTX 没有显著性差异， 这意味着临床应 用时可以提高剂量， 增加疗效。
发明内容 ：
本发明涉及一种水溶性药物制备方法与应用， 特别涉及一种水溶性紫杉烷类药 物， 它们的制备方法及其在临床肿瘤治疗中的应用。
本发明提供一种具有式 I 结构的水溶性紫杉烷类化合物，
其中 R1 为苯基或者叔丁氧基， R2 为乙酰基或者氢原子， R3 为直接连接或者 4- 氨基 苄氧甲酰基。
本发明的化合物， 在主要活性基团为 PTX， 和 DTX 时， 可表述为 ：
PEG-VC-PTX ： R1 ＝ Ph， R2 ＝ Ac， R3 ＝ none PEG-VC-DTX ： R1 ＝ Me3CO， R2 ＝ H， R3 ＝ none PEG-VC-PABC-PTX ： R1 ＝ Ph， R2 ＝ Ac， R3 ＝ PABC PEG-VC-PABC-DTX ： R1 ＝ Me3CO， R2 ＝ H， R3 ＝ PABC 其中
本发明的紫杉烷类化合物， 优选以下结构的化合物 PEG-VC-PTX ：
PEG-VC-PABC-PTX ：
PEG-VC-DTX ：
PEG-VC-PABC-DTX ：
本发明还包括， 提供含有本发明的紫杉烷类化合物的药物组合物。 本发明所述的药物组合物， 可以是任何可药用的剂型， 优选注射剂。 本发明的药物组合物， 可以加入常规的药用辅料， 如冻干支架剂、 稳定剂、 pH 调节剂、 渗透压调节剂， 其中冻干支架剂选自甘露醇、 海藻糖、 蔗糖、 乳糖、 葡萄糖、 麦芽糖、 山梨 醇、 氯化钠的一种或者任意混合物。作为注射剂， 可用注射用水、 注射用生理盐水或注射用 葡萄糖溶液稀释或复溶后， 进行静脉输注或静脉注射。
本发明还包括本发明所述的紫杉烷类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明还包括本发明所述的紫杉烷类化合物的制备方法， 其特征在于， 包括以下 步骤 ：
其中 R1 为苯基或者叔丁氧基， R2 为乙酰基或者氢原子， R3 为直接连接或者 4- 氨基 苄氧甲酰基。
其中反应在 DMF 或 CHCl3 溶剂中进行， 以 Et3N、 DIEA 或 DBU 为催脱保护剂和缚酸 剂， 在 DCC， EDC·HCl 缩合剂的作用下发生缩合反应， 生成目标产物。
其中式Ⅲ化合物通过以下步骤制备，
a. 化合物Ⅶ和Ⅷ在缩合剂的作用下生成化合物Ⅵ
b. 化合物在缩合剂的作用下与对氨基苄醇反应生成化合物Ⅴ
c. 化合物在有机碱的作用下与氯甲酸对硝基苯酯发生酯交换生成化合物Ⅳd. 化合物Ⅳ与紫杉醇或多西紫杉醇在 DMAP， 吡啶， 三乙胺等有机碱催化作用下生 成化合物Ⅲ -a
e. 化合物Ⅵ与紫杉醇或多西紫杉醇在缩合剂的作用下反应生成化合物Ⅲ -b本发明最优选的制备方法在实施例中。
本发明的优点在于 ： 1) 本发明通过在化学结构上引入水溶性大分子聚乙二醇 (PEG)， 很好地解决了紫杉烷类药物的溶解度低的问题， 由于药物具有水溶性， 可以直接 制备成注射液或注射用无菌粉末， 处方可不含大量的表面活性剂 ( 区别于现有制剂中的 Cremophor EL 和 Tween-80)， 因此不产生相关的毒副作用， 特别是过敏反应和溶血作用等 ； 也不需要含有机溶剂 ( 区别于现有制剂中的乙醇 )， 避免了有机溶剂带来的毒副作用和刺 激性等 ； 2) 本发明采用了肿瘤环境靶向给药的思路， 在 PEG 和紫杉烷类药物分子之间化学 联结上了联结剂缬氨酸 - 胍氨酸二肽 (Val-Cit)， 而联系剂 VC 对肿瘤组织有选择性， 可以在 肿瘤组织中被肿瘤组织特有的酶组织蛋白酶 B(CB) 所降解， 并释放出紫杉烷类药物的原型 分子， 从而发挥特异性的抗肿瘤效果。 这种靶向给药的思路可以提高疗效， 并且降低此类药 物的毒性。
附图说明 ：
图 1 PEG-VC-PTX 的结构图
图 2 PEG-VC-PABC-PTX 的结构图
图 3 PEG-VC-DTX 的结构图图 4 PEG-VC-PABC-DTX 的结构图 图 5 注射给药后本发明所述化合物的抗肿瘤药效学实验结果 1 图 6 注射给药后本发明所述化合物的抗肿瘤药效学实验结果 2 图 7 注射给药后裸鼠的体重变化结果 1 图 8 注射给药后本发明所述化合物的抗肿瘤药效学实验结果 4 图 9 注射给药后本发明所述化合物的抗肿瘤药效学实验结果 5 图 10 注射给药后裸鼠的体重变化结果 2具体实施方式 ：
以下通过实施例进一步说明本发明， 但不作为本发明的限制。
实施例 1 ： PEG-VC-PTX 的制备
PEG- 丁二酸的制备 ：
将 PEG(20gl)， 丁二酸酐 (0.40g) 和三乙胺 (1mL) 加入 CH2Cl2(100mL)， 回流 2h， 加 入 100mL 蒸馏水， 以 CH2Cl2 萃取 (50mL×2)， 合并 CH2Cl2 层， 无水硫酸钠干燥， 过滤， 浓缩， 加 入大量乙醚使析出固体， 抽滤， 烘干， 得产物为白色固体， 15.10g， 产率 74.02％。 Fmoc-Val-Cit 的制备 ：
将 Fmoc-Val(5.06g) 和 HOSu(1.72g) 溶于 THF(100mL) 中， 加入 DCC(3.08g)， 反应 1h， 加入 Cit(2.74g) 和 NaHCO3(1.32g)， 反应 4h.。往反应体系中加入柠檬酸水溶液 (30％， 75mL)， 以乙酸乙酯萃取 (50mL×2)， 合并有机相， 水洗 (50mL×2)， 减压蒸去溶剂， 往胶冻状 物质中加入乙醚 (80mL) 使产物析出， 抽滤， 乙醚洗， 烘干得白色固体， 4.64g， 产率 62.67％。
Fmoc-Val-Cit-PTX 的制备 ：
将 Fmoc-Val-Cit(99mg) ，EDC·HCl(77mg) ，PTX(171mg) ，DIEA(66 μ L) 和 DMAP(2.4mgl) 加到 CH2Cl2(10mL) 中， 反应 3h， 以饱和食盐水洗， 无水硫酸钠干燥， 过滤浓缩， 闪柱 (CHCl3 ∶ CH3OH ＝ 50 ∶ 1 → 35 ∶ 1) 得到白色固体 224mg， 产率 84.06％。
PEG-VC-PTX 的制备 ：
将 PEG- 丁 二 酸 (518mg)， EDC·HCl(36mg)， Fmoc-Val-Cit-2 ′ -PTX(123mg， 0.092mmol)， DIEA(28μL) 加到 DMF(10mL)， 反应 6h， 减压蒸去 DMF， 闪柱 (CHCl3 ∶ CH3OH ＝ 10 ∶ 1 → 5 ∶ 1) 分离得到白色固体， 358.mg， 产率 62.63％
实施例 2 ： PEG-VC-PABC-VC-PTX 的制备
Fmoc-Val-Cit-PABOH 的制备 ：
将 Fmoc-Val-Cit(1.04g)， EEDQ(0.52g) 和 PABOH(0.26mg) 加 到 CH2Cl2 中， 反应 10h， 减压减压蒸去溶剂， 加入乙醚， 搅拌， 抽滤， 乙醚洗， 烘干得浅紫红色固体， 1.10g， 产率 81.84％。
Fmoc-Val-Cit-PABC-PNP 的制备 ：
将 Fmoc-Val-Cit-PABOH(0.30g) 和 PNPCOCl(0.10gl) 加到 THF(15mL) 中， 搅拌下 滴加三乙胺 (300uL)， 然后室温下反应过夜。 闪柱分离 (CHCl3 ∶ CH3OH ＝ 20 ∶ 1 → 10 ∶ 1) 得到粉红色泡沫状固体， 0.20g， 产率 52.31％。
Fmoc-Val-Cit-PABC-PTX 的制备 ：
将 Fmoc-Val-Cit-PABC-PNP(160mg)， PTX(214mg) 和 DMAP(31mg， 0.25mmol) 依次加
到 CH2Cl2(20mL) 中， 室温下反应 100h。闪柱 (CHCl3 ∶ CH3OH ＝ 30 ∶ 1 → 20 ∶ 1) 分离得 到粉红色的泡沫状固体 182mg， 产率 58.87％。
PEG-VC-PABC-PTX 的制备 ：
将 PEG- 丁二酸 (689mg)， EDC· HCl(47mg)， Fmoc-Val-Cit-PABC-2′ -PTX(182mg)， DIEA(80μL) 加 到 DMF(10mL)，反 应 6h，减 压 蒸 去 DMF，闪 柱 (CHCl3 ∶ CH3OH ＝ 10 ∶ 1 → 5 ∶ 1) 分离得到白色固体白色固体， 231mg， 产率 29.65％。
实施例 3 ： PEG-VC-DTX 的制备
PEG- 丁二酸的制备 ：
将 PEG(20gl)， 丁二酸酐 (0.40g) 和三乙胺 (1mL) 加入 CH2Cl2(100mL)， 回流 2h， 加 入 100mL 蒸馏水， 以 CH2Cl2 萃取 (50mL×2)， 合并 CH2Cl2 层， 无水硫酸钠干燥， 过滤， 浓缩， 加 入大量乙醚使析出固体， 抽滤， 烘干， 得产物为白色固体， 15.10g， 产率 74％。
Fmoc-Val-Cit 的制备 ：
将 Fmoc-Val(5.06g) 和 HOSu(1.72g) 溶于 THF(100mL) 中， 加入 DCC(3.08g)， 反应 1h， 加入 Cit(2.74g) 和 NaHCO3(1.32g)， 反应 4h.。往反应体系中加入柠檬酸水溶液 (30％， 75mL)， 以乙酸乙酯萃取 (50mL×2)， 合并有机相， 水洗 (50mL×2)， 减压蒸去溶剂， 往胶冻状 物质中加入乙醚 (80mL) 使产物析出， 抽滤， 乙醚洗， 烘干得白色固体， 4.64g， 产率 63％。
Fmoc-Val-Cit-DTX 的制备 ：
依 次 Fmoc-Val-Cit(99mg)， EDC·HCl(77mg)， DIEA(66μL)， DMAP(2.4mgl)，和 DTX(167mg) 加到 CH2Cl2(10mL) 中， 反应 6h， 以饱和食盐水洗， 无水硫酸钠干燥， 过滤浓缩， 闪 柱 (CHCl3 ∶ CH3OH ＝ 50 ∶ 1 → 35 ∶ 1) 得到白色固体 210mg， 产率 79％。
PEG-VC-DTX 的制备 ：
将 PEG- 丁 二 酸 (518mg)， EDC·HCl(36mg)， Fmoc-Val-Cit-2 ′ -DTX(123mg， 0.092mmol)， DIEA(28μL) 加到 DMF(10mL)， 反应 6h， 减压蒸去 DMF， 闪柱 (CHCl3 ∶ CH3OH ＝ 10 ∶ 1 → 5 ∶ 1) 分离得到白色固体， 337mg， 产率 59％
实施例 4 ： PEG-VC-PABC-VC-DTX 的制备
Fmoc-Val-Cit-PABOH 的制备 ：
将 Fmoc-Val-Cit(1.04g)， EEDQ(0.52g) 和 PABOH(0.26mg) 加 到 CH2Cl2 中， 反应 10h， 减压减压蒸去溶剂， 加入乙醚， 搅拌， 抽滤， 乙醚洗， 烘干得浅紫红色固体， 1.10g， 产率 82％。
Fmoc-Val-Cit-PABC-PNP 的制备 ：
将 Fmoc-Val-Cit-PABOH(0.30g) 和 PNPCOCl(0.10g) 加到 THF(15mL) 中， 搅拌下滴 加三乙胺 (300uL)， 然后室温下反应过夜。闪柱分离 (CHCl3 ∶ CH3OH ＝ 20 ∶ 1 → 10 ∶ 1) 得到粉红色泡沫状固体， 0.20g， 产率 52％。
Fmoc-Val-Cit-PABC-DTX 的制备 ：
将 Fmoc-Val-Cit-PABC-PNP(160mg)， DTX(210mg) 和 DMAP(31mg， 0.25mmol) 依次加 到 CH2Cl2(20mL) 中， 室温下反应 100h。闪柱 (CHCl3 ∶ CH3OH ＝ 30 ∶ 1 → 20 ∶ 1) 分离得 到粉红色的泡沫状固体 190mg， 产率 62％。
PEG-VC-PABC-DTX 的制备 ：
将 PEG- 丁二酸 (689mg)， EDC· HCl(47mg)， Fmoc-Val-Cit-PABC-2′ -DTX(176mg)，DIEA(80μL) 加 到 DMF(10mL)，反 应 6h，减 压 蒸 去 DMF，闪 柱 (CHCl3 ∶ CH3OH ＝ 10 ∶ 1 → 5 ∶ 1) 分离得到白色固体， 263mg， 产率 34％。
实施例 5 注射剂的制备 ( 以 PEG-VC-PABC-PTX 为例 )
取本品 0.22g， 溶解于 50ml 生理盐水或 5％葡萄糖溶液中， 调节等渗。溶液经微孔 滤膜过滤后， 封口， 既得每瓶含以紫杉醇记 30mg 的无色至微黄色透明溶液。
实施例 6 ： 冻干粉针的制备 ( 以 PEG-VC-PABC-PTX 为例 )
取 0.22g 本品， 溶解于 10ml 蒸馏水中， 加入 0.1g 的乳糖， 溶液经微孔滤膜滤过， 置 -70℃冰箱中预冻 4 小时以上， 然后置冷冻干燥机内冻干， 封口， 既得每瓶含以紫杉醇记 30mg 的白色至微黄色水溶性粉针剂。
实施例 7
采用两种不同的细胞系 MCF-7 和 Hela， 通过 SRB 方法进行样品的细胞毒的测定， 计 算 IC50 值， 结果见表 1( 单位为 nmol/L)。 其中 PTX 按市售制剂处方配制剂 ( 含有 Cremophor EL 和乙醇， 下同 )。结果可见， 三种 PTX 前药的细胞毒性小于对照 PTX 组。
表 1 体外细胞毒试验结果
实施例 8
选用 MCF-7 细胞， 在雌性裸鼠的左侧腋下进行接种， 每只鼠接种 106 细胞， 接 种 9 天 后 给 药。 给 药 组 分 为 5 组， 分别为： 5 ％ 葡 萄 糖， PTX， PEG-PTX， PEG-VC-PTX， PEG-VC-PABC-PTX， 给药量为 15mg PTX/Kg， 每组 5 只。共给药 5 次， 给药间隔时间为 1 天。 隔天测体重和瘤体积。于第 6 次给药时处死， 取瘤组织， 称重， 拍照， 称去瘤体重。结果见图 5， 图 6 和图 7。结果可见， 三种 PTX 前药在整体动物上的毒性小于对照 PTX 组。三种 PTX 前 药中 PEG-VC-PABC-PTX 的抗肿瘤作用最强， 与 PTX 组没有显著差异。
实施例 9
选用 MCF-7 细胞， 在雌性裸鼠的左侧腋下进行接种， 每只鼠接种 106 细胞， 接种 9 天 后给药。给药组分为 5 组， 分别为 ： 5％葡萄糖， PTX(10mg/kg)， PEG-VC-PABC-PTX(10mg/kg、 15mg/kg、 20mg/kg)， 每组 5 只。共给药 5 次， 给药间隔时间为 1 天。隔天测体重和瘤体积大 小。于第 6 次给药时处死， 取瘤组织， 称重， 拍照， 称去瘤体重。结果见图 8， 图 9 和图 10。结 果可见， 当 PEG-VC-PABC-PTX 的剂量提高到 15mg/kg 后， 抗肿瘤作用优于 PTX 组， 而且毒性 低于 PTX 组 ； 当 PEG-VC-PABC-PTX 的剂量提高到 20mg/kg 后， 毒性与 PTX 组相当的情况下， 抗肿瘤作用显著增强。