一种用于治疗流感的肺经草倍半萜提取物 所属技术领域
本发明属于医药制剂技术领域， 涉及一种从中药肺经草中提取的有效部位， 本发 明还涉及该有效部位的制备方法及其医药用途。 背景技术 流行性感冒 (influenza， 流感 ) 由流感病毒 (influenza virus) 呼吸道感染所致， 自 1918 年在美国流行并席卷全球以来， 流行性感冒对人类造成的损失居传染病之首， 而已 发生的流行性感冒中， 80％是甲型 H1N1 流感。当前， 甲型 H1N1 流感作为一种严重危害公众 健康的病毒性传染病， 正席卷全球， 威胁着人类的生命， 据我国卫生部统计， 截至 2010 年 1 月 31 日， 全国 31 个省份累计报告甲型 H1N1 流感确诊病例 12.6 万例， 其中死亡 775 例。
现 有 治 疗 流 感 的 化 学 药 品 有 一 些， 如 金 刚 烷 胺、 金 刚 乙 胺， 扎 那 米 韦、 Oseltamivir( 达菲胶囊 )、 利巴韦林等， 虽有一定的治疗效果， 但副作用大， 同时， 对于变异 和变型的流感病毒没有效果。而中药抗病毒的独特疗效已得到了全世界的公认， 中药治疗 流感是 “多成分、 多途径、 多靶点” 起效， 不管流感病毒如何变异和变型均有效， 因此， 从中药 中寻找和开发治疗流感的药物具有广阔的前景。
中药肺经草收载于 《四川省中草药标准》 试行稿 1979 年版， 为伞形科变豆菜属 (Sanicula) 植物薄片变豆菜 Sanicula lamelligera Hance 的干燥全草， 具有止咳化痰、 行 血通经之功效， 用于感冒咳嗽、 妇女经闭腰痛等症。同时也是苗族和瑶族的习用药， 苗族习 称 “毛芹菜、 木莲、 奶酱闭” ， 瑶族习称 “水黄连、 血经草” 。
肺经草治疗感冒的历史悠久， 清代的 《天宝本草》 ( 西南地区的本草 ) 就有记载 ： “肺经草即半边钱， 专包脐风又化痰哮吼咳嗽， 称第一， 四时感冒” 。肺经草在四川省乃至西 南地区的民间都在使用， 主要用感冒咳嗽， 尤其是治疗流行性感冒， 具有分布面广、 资源丰 富的特点， 同时， 已形成了药材商品。
经检索， 尚未见关于肺经草倍半萜提取物治疗流行性感冒的文献报道。
发明内容 本发明的目的是提供一种高效低毒的的肺经草倍半萜提取物。
本发明的另一个目的是提供上述肺经草倍半萜提取物的制备方法。
本发明还有一个目的是提供上述肺经草倍半萜提取物的的医药用途。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是 ：
一种肺经草倍半萜提取物， 它是从中药肺经草中提取的倍半萜， 其中总倍半萜含 量在 30％以上 ；
并且， 该肺经草倍半萜提取物通过下述两种方法中任意一种从中药肺经草中提取 制得 ：
方法Ⅰ， 包括如下步骤 ：
(1) 制备肺经草粗提物 ： 取肺经草药材， 加 60％～ 95％的乙醇进行提取， 滤过， 得
提取液， 将此提取液浓缩， 即得肺经草粗提物。
(2) 将 (1) 步制得的肺经草粗提物加适量无水乙醇溶解， 与同重量的大孔吸附树 脂拌匀， 加入 10 倍以上无水乙醇量的水， 搅拌， 加于已处理过中低极性大孔吸附树脂柱上， 先用 30％的低浓度乙醇洗脱， 将该低浓度乙醇洗脱液弃去不用， 再用 40％～ 95％的乙醇洗 脱， 收集洗脱液， 回收乙醇， 干燥， 即得肺经草倍半萜提取物。
方法Ⅱ， 包括如下步骤 ：
(1) 制备肺经草粗提物 ： 取肺经草药材， 粉碎成细粉， 放入二氧化碳超临界萃取罐 中， 在一定条件下， 萃取 2 ～ 10 小时， 从分离罐分出得肺经草粗提物。
(2) 将 (1) 步制得的肺经草粗提物加适量无水乙醇溶解， 加于已用水处理的 MCI Gel 树脂柱上， 先用 10％～ 40％的乙醇洗脱， 将该低浓度乙醇洗脱液弃去不用， 再用 50％～ 95％的乙醇洗脱， 收集洗脱液， 回收乙醇， 干燥， 即得肺经草倍半萜提取物。
如有必要， 精制得的肺经草倍半萜提取物， 可用乙酸乙酯进一步纯化处理， 以制得 总倍半萜含量高的肺经草倍半萜提取物。
本发明肺经草倍半萜提取物中， 总倍半萜含量优选在 60％以上更好。
本发明肺经草倍半萜提取物中， 总倍半萜含量更优选在 90 ％以上更好， 100 ％最 好。 上述肺经草倍半萜提取物的医药用途为 ： 治疗流行性感冒。所述治疗流行性感冒 的药物中含有有效剂量的上述肺经草倍半萜提取物。
所述的药物剂型可以是粉针、 滴丸、 片剂、 缓释片、 硬胶囊剂、 软胶囊剂、 颗粒剂等 任何一种现有药物剂型。
与现有技术相比， 本发明的有益效果是 ： 经药效学及毒理学试验证明， 该肺经草倍 半萜提取物能显著抑制流感病毒增殖和对抗小鼠流感病毒性肺炎的作用， 且毒副作用小。 不仅有效成分 ( 倍半萜类 ) 明确， 而且， 总倍半萜的含量越高， 杂质越少， 其效果越好， 这可 减少服用量， 在一定程度上也可减少毒副作用， 更有利于保证药物的安全性和有效性。同 时， 该肺经草倍半萜提取物不同于化学药物单一成分起效， 而是 “多成分、 多途径、 多靶点” 的作用， 且毒副作用小。
本发明对肺经草的有效部位进行了追踪， 以不同含量的肺经草倍半萜提取物为药 物进行试验， 结果证实了肺经草倍半萜提取物治疗流行性感冒的作用。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。
但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。
实施例 1
取 肺 经 草 药 材 100kg， 加 70 ％ 的 乙 醇 回 流 提 取 2 次， 每 次 1 小 时， 第 1 次加 800kg70％的乙醇， 第 2 次加 600kg70％的乙醇， 滤过， 合并提取液， 提取液回收乙醇并浓缩 成稠膏， 加适量无水乙醇溶解， 与同重量的大孔吸附树脂拌匀， 加入 10 倍以上无水乙醇量 的水， 搅拌， 加于已处理过大孔吸附树脂柱上， 先用 30 ％的低浓度乙醇洗脱至无色， 将此 30％乙醇洗脱液弃去， 再用 90％的乙醇洗脱至无色， 收集此 90％乙醇洗脱液， 回收乙醇并 浓缩成相对密度 1.25 的稠膏， 真空干燥， 即得到含总倍半萜 30％的肺经草倍半萜提取物。实施例 2
取 肺 经 草 药 材 100kg， 加 90 ％ 的 乙 醇 回 流 提 取 2 次， 每 次 1.5 小 时， 第 1 次加 700kg90％的乙醇， 第 2 次加 600kg90％的乙醇， 滤过， 合并提取液， 提取液回收乙醇并浓缩 成稠膏， 加适量无水乙醇溶解， 与同重量的大孔吸附树脂拌匀， 加入 10 倍以上无水乙醇量 的水， 搅拌， 加于已处理过大孔吸附树脂柱上， 先用 30 ％的低浓度乙醇洗脱至无色， 将此 30％乙醇洗脱液弃去， 再用 80％的乙醇洗脱至无色， 收集此 80％乙醇洗脱液， 回收乙醇并 浓缩成相对密度 1.10 的清膏， 喷雾干燥， 即得到含总倍半萜 60％的肺经草倍半萜提取物。
实施例 3
取 肺 经 草 药 材 100kg， 加 80 ％ 的 乙 醇 回 流 提 取 2 次， 每 次 2 小 时， 第 1 次加 800kg80％的乙醇， 第 2 次加 600kg80％的乙醇， 滤过， 合并提取液， 提取液回收乙醇并浓缩 成稠膏， 加适量无水乙醇溶解， 与同重量的大孔吸附树脂拌匀， 加入 10 倍以上无水乙醇量 的水， 搅拌， 加于已处理过大孔吸附树脂柱上， 先用 30 ％的低浓度乙醇洗脱至无色， 将此 30％乙醇洗脱液弃去， 再用 90％的乙醇洗脱至无色， 收集此 90％乙醇洗脱液， 回收乙醇， 真 空干燥， 即得干浸膏。将此干浸膏加 5 倍量水使混悬， 用乙酸乙酯萃取 4 次， 每次乙酸乙酯 的用量与样品体积相等， 合并乙酸乙酯层， 回收乙酸乙酯后， 真空干燥， 即得到含总倍半萜 90％的肺经草倍半萜提取物。
实施例 4
取 肺 经 草 药 材 100kg， 加 90 ％ 的 乙 醇 回 流 提 取 3 次， 每 次 1 小 时， 第 1 次加 700kg90％的乙醇， 第 2、 3 次分别加 600kg90％的乙醇， 滤过， 合并提取液， 提取液回收乙醇 并浓缩成稠膏， 加适量无水乙醇溶解， 与同重量的大孔吸附树脂拌匀， 加入 10 倍以上无水 乙醇量的水， 搅拌， 加于已处理过大孔吸附树脂柱上， 先用 30％的低浓度乙醇洗脱至无色， 将此 30％乙醇洗脱液弃去， 再用 75％的乙醇洗脱至无色， 收集此 75％乙醇洗脱液， 回收乙 醇， 真空干燥， 即得到含总倍半萜 60％的肺经草倍半萜提取物。将此肺经草倍半萜提取物 加 5 倍量水使混悬， 用乙酸乙酯萃取 4 次， 每次乙酸乙酯的用量与样品体积相等， 合并乙酸 乙酯层， 回收乙酸乙酯后， 再加 5 倍量水使混悬， 再用乙酸乙酯萃取 3 次， 每次乙酸乙酯的用 量与样品体积相等， 合并乙酸乙酯层， 回收乙酸乙酯， 冷冻干燥， 即得到含总倍半萜 100％的 肺经草倍半萜提取物。
实施例 5
取肺经草药材 20kg， 粉碎成细粉， 过 80 目筛， 放入二氧化碳超临界萃取罐中， 二氧 化碳流量为 12L/min， 当温度达 60℃、 压力过 30Mpa 时开始计时， 萃取 6 小时， 从分离罐分出 得肺经草粗提物， 将此粗提物加适量无水乙醇溶解， 加于已用水处理的 MCI Gel 树脂柱上， 先用 30％的乙醇洗脱， 将该低浓度乙醇洗脱液弃去不用， 再用 80％的乙醇洗脱， 收集洗脱 液， 回收乙醇， 真空干燥， 即得得到含总倍半萜 50％的肺经草倍半萜提取物。
实施例 6
取肺经草药材 20kg， 粉碎成细粉， 过 100 目筛， 放入二氧化碳超临界萃取罐中， 二 氧化碳流量为 15L/min， 当温度达 60℃、 压力过 30Mpa 时开始计时， 萃取 8 小时， 从分离罐分 出得肺经草粗提物， 将此粗提物加适量无水乙醇溶解， 加于已用水处理的 MCI Gel 树脂柱 上， 先用 40％的乙醇洗脱， 将该低浓度乙醇洗脱液弃去不用， 再用 90％的乙醇洗脱， 收集洗 脱液， 回收乙醇， 真空干燥， 即得得到含总倍半萜 65％的肺经草倍半萜提取物。实施例 7
取所述的肺经草倍半萜提取物 300g， 糊精 700g， 混合均匀， 采用现有硬胶囊剂制 备工艺， 即制得含肺经草倍半萜提取物的硬胶囊剂型的药物。
实施例 8
取所述的肺经草倍半萜提取物 3kg， 植物油 7kg， 混合均匀， 用明胶作囊壳材料， 采 用现有软胶囊剂制备工艺， 即制得含肺经草倍半萜提取物的软胶囊剂型的药物。
实施例 9
取所述的肺经草倍半萜提取物 300g， 聚乙二醇 6000700g， 混合均匀， 采用现有滴丸 剂制备工艺， 即制得含肺经草倍半萜提取物的滴丸剂型的药物。
实施例 10
取所述的肺经草倍半萜提取物 300g， 可溶性淀粉 500g， 蔗糖 200g， 混合均匀， 制 粒， 过筛， 干燥， 即制得含肺经草倍半萜提取物的颗粒剂型的药物。或将制得的颗粒进一步 压片， 即制得含肺经草倍半萜提取物的片剂的药物。
实施例 11
取所述的肺经草倍半萜提取物 420g， 羟丙甲纤维素 60g， 羧甲基淀粉钠 8g， 微晶纤 维素 10g， 混合均匀， 再加硬脂酸镁 1g 作为润滑剂， 压片， 即制得含肺经草倍半萜提取物的 缓释片剂型的药物。 实施例 12
取所述的肺经草倍半萜提取物 300g， 溶于 10000ml 注射用水中 ( 加少许乙醇使溶 解 )， 采用粉针剂冷冻干燥制备工艺， 即制得含肺经草倍半萜提取物的粉针剂型的药物。
为考察本发明肺经草倍半萜提取物的有效性和安全性， 发明人分别以上述部分实 施例所述的提取物为试验药物， 进行了药效学试验和毒理学试验考察， 试验方法和结果等 分别如下 ：
药效学试验 ：
试验一、 抗流感病毒试验
鸡胚 ： 10 日龄鸡胚购自湖南亚华种业股份有限公司。
病毒株 ： 甲型 H1N1 流感病毒株由湖南省疾病预防控制中心提供， 经 10 日龄鸡胚尿 囊腔接种培养传代， 微量血凝试验滴点病毒， 血凝效价 1 ∶ 640 以上， -70℃保存， 实验时以 无菌生理盐水 1 ∶ 10 稀释后使用。
药物 ： 肺经草倍半萜提取物 ( 含倍半萜 30％的由实施例 1 制得、 含总倍半萜 60％ 的由实施例 2 制得、 含总倍半萜 90％的由实施例 3 制得 ) ； 阳性对照药 ： 病毒唑注射剂 ( 批 号 010523， 上海禾丰制药有限公司 )。
试验方法 ：
1、 药物对鸡胚毒性的检测 ： 用无菌生理盐水对药物进行连续稀释。肺经草倍半萜 提取物提取物和病毒唑注射剂各自均取 4 个浓度剂量进行鸡胚尿囊腔接种， 每一浓度接种 4 个胚， 每个胚 0.2ml， 35℃培养， 同步设生理盐水对照， 每个胚 0.2ml。24h 内死亡的鸡胚不 计入药物毒性作用的死亡数。 连续观察 4d， 记录鸡胚存活情况， 确定药物对鸡胚的最大无毒 限量 (TC0)。
2、 药物对流感病毒增殖抑制作用的检测 ： 10 日龄鸡胚 63 个， 随机分组 ： 正常组 3
个； 空白组 4 个 ( 加生理盐水 0.4ml) ； 病毒对照 4 个 ； 阳性对照组 4 个 ； 药物组 48 个。分 别用无菌生理盐水将肺经草倍半萜提取物稀释成 4 个浓度， 分别为 ： 200mg/ml、 100mg/ml、 50mg/ml 和 25mg/ml。将 1 ∶ 10 稀释的病毒液接种 10 日龄鸡胚尿囊腔， 每胚 0.2ml， 35℃培 养 1h 后， 每胚注射上述各浓度的药液 0.2ml， 35℃培养 72h， 4℃冰箱过夜， 收集尿囊液， 用微 量血凝试验滴点病毒血凝效价。同时， 阳性对照组每胚注射 0.2ml 病毒唑， 同步进行培养、 测定。
结果 ： 1、 药物对鸡胚毒性的检测结果 ： 肺经草倍半萜提取物对鸡胚的无毒限量为 200mg/ml ； 病毒唑注射剂的无毒限量为 100mg/ml ； 无菌生理盐水对鸡胚无毒作用。
2、 药物对流感病毒增殖抑制作用的检测结果 ： 见表 1。肺经草倍半萜提取物具有 明显的抑制流感病毒增殖的作用， 且呈量效关系， 随着其中总倍半萜含量的增高， 其抗流感 病毒效果增强。
表 1 对流感病毒增殖的抑制作用
试验二、 对甲型 H1N1 流感病毒作用的体内试验
1 材料
药物 ： 肺经草倍半萜提取物 ( 含倍半萜 30％的由实施例 1 制得、 含总倍半萜 60％ 的由实施例 2 制得、 含总倍半萜 90％的由实施例 3 制得 ) ； 阳性对照药 ： 病毒唑注射剂 ( 批 号 010523， 上海禾丰制药有限公司 )。
病毒株 ： 甲型 H1N1 流感病毒鼠肺适应株 ( 将由湖南省疾病预防控制中心提供 )。
动物 ： NIH 小鼠 ( 将由中南大学湘雅医学院实验动物中心提供 )。
2 对小鼠流感病毒性肺炎的影响
将 NIH 小鼠随机分为病毒对照组、 正常对照组、 阳性对照组及肺经草倍半萜提取 物大、 小剂量组， 雌雄各半。各药物组于感染前 5d 开始灌胃给药， 对照组给予同容积无菌 生理盐水灌胃。各组在乙醚轻度麻醉下感染甲型 H1N1 流感病毒鼠肺适应株 15 个 LD50， 感 染后 96h 处死， 称体重后取肺称量， 逐个算出肺指数值 ( 即肺指数＝肺质量 / 体重 ×100)
和肺指数抑制率 [( 病毒对照组平均肺指数一实验组平均肺指数 )/ 病毒对照组平均肺指 数 ×100％ ]， 与对照组比较进行组间 t 检验。
3 结果 ： 见表 2。
表 2 肺经草倍半萜提取物对小鼠甲型 H1N1 流感肺炎的影响
结果表明 ： 肺经草倍半萜提取物具有明显的对抗小鼠流感病毒性肺炎作用， 且呈 量效关系， 随着其中总倍半萜含量的增高， 其效果增强。
急性毒性试验 ：
为了考察肺经草倍半萜提取物的安全性， 特对其进行了急性毒性的考察研究， 试 验方法结果如下 ：
药物 ： 由实施例 2 制得的肺经草倍半萜提取物 ( 含总倍半萜 60％ )。
动物 ： ICR 小鼠， 一级， 鼠龄 8 ～ 9 周， 体重 18 ～ 22g。
方法 ： 改良寇法 ( 参照 《中药药理研究方法学》 第 113 页， 人民卫生出版社， 第 1 版， 陈奇主编 )。
结果 ： LD50 为 16.89g/kg， 95％的可信限为 16.05 ～ 17.74g/kg。
结果表明本发明药物急性毒性小， 安全度大。
由上述药效学和毒理学试验的结果可以得出 ： 肺经草倍半萜提取物具有较好的治 疗流行性感冒的作用， 且 LD50 为 16.89g/kg， 毒性很低。
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