通过玻璃体内施用编码治疗用蛋白质的表达载体救援光感 器 发明背景发明领域 本发明总体涉及眼的治疗， 更具体地涉及通过提供具有治疗用蛋白质——优选为 人神经营养蛋白 4(NT4)——的视网膜的特定亚群、 使用重组递送载体靶向和表达神经营养 生长因子来治疗和预防光感器退化的方法。
背景信息
色素性视网膜炎 (RP) 是指影响视网膜对光反应能力的一组遗传性病症的术语。 虽然在大多数情况中该疾病似乎是常染色体隐性， 但是它也可以是常染色体显性、 或者为 罕见的 X 连锁的， 并且可以作为综合症症状 ( 症候群， syndrome complex) 的一部分出现。 RP 患者在青春期具有夜盲， 之后在成年期完全丧失视力。
RP 主要影响视杆细胞、 感光细胞， 感光细胞负责夜间视觉 —— 在微暗的光中 看——和周边视觉。视锥细胞， 其负责色觉和在明亮的光中看， 也可以随着疾病发展被影 响。
视紫红质是在眼的视杆细胞中唯一发现的一种光敏感性眼色素。在 RP 常染色体 显性形式的个体中， 视紫红质基因包括单核苷酸改变。突变基因成为来自另外的症状前个 体中视网膜的异常光诱发反应的基础， 并最终导致视杆细胞和视锥感光细胞的进行性退 化。虽然退化的准确机理是未知的， 但是可能由视杆细胞中未退化的突变视紫红质和异常 膜盘的逐渐积累伴随着视网膜对这种畸形的次反应产生。
已知神经营养蛋白在选择周围神经系统和中枢神经系统中神经元的生存和分化 中起到关键作用 ( 例如， 神经生长因子 (NGF) ； 脑源神经营养因子 (BDNF) ； 和神经营养蛋 白 -4(NT4))。 这些因子已经显示出对属于视觉系统的细胞的作用。 这些因子的受体在视网 膜中表达。这些因子中的一些可以沿着 RGC 轴突以顺行性方式进行输送， RGC 轴突共同包 括视神经。
在多个 CNS 区中， 发育中的神经元和它们的连接被过量地产生， 然后被部分地消 除。在正常啮齿动物中， 约 65％的发育中 RGC 由于核固缩而死亡。未成熟外周感觉和交感 神经元通过竞争靶来源的神经营养蛋白而存活。虽然神经营养蛋白对发育中的 CNS 神经元 的促存活作用存在争议， 但是神经营养蛋白在体外已经显示促进这些神经元的存活， 并且 显示减缓或减少轴索显微外科术诱导 (axotomy induced) 的 CNS 神经元的死亡， 其包括发 育中的 RGC 和成熟的 RGC。
因此， 先前研究已显示生长因子可以救援垂死的感光细胞。 例如， 当八种不同的因 子注射入暴露于持续的高强度光的大鼠视网膜时， 所有八种不同的因子都显示延迟感光细 胞退化的能力。这些因子包括 FGF( 酸和碱两种形式 )、 BDNF、 睫状神经营养因子 (CNTF) 和 白细胞介素 1(IL-1)。神经营养蛋白 3(NT-3)、 胰岛素样生长因子 II(IGF-II)、 转化生长因 子 β(TGF-β) 和肿瘤坏死因子 α 和 β(TNF-α、 TNF-β) 也显示存活活性， 但是其活性程
度比其它因子低得多。然而， 这些蛋白质因子的直接注射对于长期治疗和光感器功能的维 持是不足够的。
最近工作已经显示， rd 小鼠的视网膜退化表型可以通过表达转基因小鼠中的牛 cGMP 磷酸二酯酶 β- 亚基来救援， rd 小鼠已经用作 RP 研究的模型超过 30 年。类似地， rds 小鼠的缓慢型视网膜变性 (retinal degeneration slow phenotype， rds) 表型也可以通过 产生表达野生型 rds 基因产物—— 39kD 的膜相关糖蛋白——的转基因小鼠进行矫正。然 而， 转基因技术不可直接应用于人的治疗。
因此， 在治疗各种眼状况的疗法中， 对于在体内持续和原位递送神经营养蛋白仍 然存在需求。
发明概述
本发明涉及通过使用重组载体表达神经营养因子以靶向视网膜中的细胞亚群来 救援眼的光感器来治疗眼疾病的方法。使用包含编码神经生长因子 ( 优选为神经营养蛋 白 -4(NT4)) 的序列的基因工程基因转移载体， 视网膜神经节细胞 (RGC) 层通过在玻璃体内 施用的载体被原位特定地转导， 或所述 RGC 层在用编码生长因子的表达载体转化的供体细 胞的玻璃体内植入之后， 通过表达生长因子而被影响。 因此， 公开了使用该载体用于治疗需 要其的对象的方法， 包括通过靶向细胞的 RGC 层亚群救援光感器。 在一个实施方式中， 公开了原位救援眼的光感器的方法， 包括用可操作地编码生 长因子的表达载体感染视网膜神经节细胞 (RGC)， 其中所述载体通过玻璃体内注射进入眼 睛而被施用到 RGC， 并且进一步， 感染的细胞组成性地表达生长因子。 在相关方面， 表达载体 可以以合适的供体细胞被递送， 所述供体细胞被植入眼中用于生长因子的玻璃体内表达。
在相关的方面， 方法包括施用第二种生长因子或钙通道阻滞剂。在另一相关的方 面， 第二种生长因子是脑源神经营养因子 (BDNF)、 胶质细胞系衍生神经营养因子 (GDNF) 或 睫状神经营养因子 (CNTF)。 在还相关的方面， 通过体内递送编码生长因子的重组表达载体、 或者由基因工程供体细胞重组地表达， 第二种神经生长因子作为蛋白质在玻璃体内或视网 膜下被递送。
在一方面， 生长因子是 NT4。在还另一方面， 表达载体是源于腺伴随病毒的 AAV 载 体。在另一方面， AAV 载体是 AAV 2 型 (AAV2)、 或者定向于眼细胞的另一种 AAV 血清型。在 还一方面， 邻近细胞通过 RGC 感染被活化 ( 激活 )， 其中这些邻近细胞包括但不限于 ： 杆状 光感器、 锥状光感器、 双极细胞、 水平细胞、 视网膜色素上皮细胞和米勒胶质细胞。
在一方面， 方法包括增加与眼疾病中光感器变性相关的暗视 b- 波、 暗视 a- 波、 和 / 或明视 b- 波的振幅。在相关方面， 眼疾病色素性视网膜炎 ( 包括乌斯赫尔综合 征 (Usher Syndrome)、 巴 - 比 二 氏 综 合 征 (Bardet-Biedl syndrome)、 雷弗索姆病 (Refsum disease))、 利 伯 先 天 性 黑 朦 (Leber congenital amaurosis)、 黄斑变性 ( 包 括湿和干形式的年龄相关的黄斑变性和斯塔加特病 )、 卵黄状黄斑营养不良 ( 包括贝斯 特氏病 (Best disease))、 无脉络膜、 视网膜先天性裂、 视锥细胞 - 视杆细胞营养不良 (cone-rod dystrophy)、 视杆细胞 - 视锥细胞营养不良 (rod-cone dystrophy)、 malattia Leventinese( 或 Doyne 蜂窝状脉络膜炎 )、 视网膜血管瘤样增生 (retinal angiomatous proliferation， RAP)、 黄 斑 毛 细 血 管 扩 张 症 (MacTel) 或 白 点 状 视 网 膜 炎 (retinitis punctata alescens)。
在另一方面， 方法增加整个视网膜中的外核层 (outer nuclear layer， ONL) 厚度。 在相关的方面， ONL 层厚度的增加与对照相比是显著的。
在一方面， ONL 层厚度的增加与对用视网膜下注射的 AAV 载体感染的感光细胞的 反应相比是显著的。在相关的方面， 感染的 RGC 通过邻近细胞诱导旁分泌反应。
在另一方面， 表达载体源于定向于眼组织的 AAV 血清型， 其中所述载体缺乏病毒 蛋白质编码序列， 但是包括编码 NT4 的核酸序列。在相关的方面， NT4 基因以 AAV 反向末端 重复 (ITR) 为侧翼。
在另一个实施方式中， 公开原位治疗光感器氧化损伤的方法， 包括施用感染性重 组载体， 所述重组载体在组织特异性启动子下可操作地编码生长因子， 其中所述载体在玻 璃体内施用到对象的眼中， 并且在感染后， 生长因子表达基本被限制于眼睛中至少一个选 择的组织。
在一方面， 生长因子是 NT4。在另一方面， 通过使用组织特异的启动子， NT4 表达基 本涉及内视网膜、 或者外视网膜、 或者它们的组合， 特别是米勒胶质细胞。 在相关的方面， 载 体包括胶质细胞原纤维酸性蛋白 (GFAP) 启动子， 已发现其对视网膜细胞——特别是米勒胶 质细胞——是特异的。在另一方面， 方法还包括共同施用至少一种抗血管生成剂和生长因 子 ( 例如， NT4)。
附图简述
图 1 是 CERE-140 载体构建体的示意图。
图 2 显示在玻璃体内注射 CERE-140 后的第 4 周时在下述中 NT4 免疫化学染色的 代表性图像 ： (A) 配制缓冲液 (FB) 对照和 (B)CERE-140 注射的眼。红色箭头显示视网膜神 经节中的 NT4 的表达和整个分子层中的 NT4 表达， 而无长突细胞通过黑色箭头识别。 GCL ＝ 神经节细胞层 ； IPL ＝内从状层层 ； INL ＝内核层 ； OPL ＝外从状层层 ； ONL ＝外核层 ； IS ＝ 内节 ； OS ＝外节 ； RPE ＝视网膜色素上皮。
图 3 显示在 RP 的 P23H-1( 左方框 ) 和 S334-4( 右方框 ) 转基因大鼠模型中玻璃 体内注射 CERE-140(NT4-140) 后的 ERG 结果。平均 ERG 振幅的柱状图在顶部方框中显示。 误差线代表平均值的标准误差 (SEM)。每只大鼠的单独数据点被图示在具有来自线连接的 对侧眼的数据的两个较低的图中。
图 4 显示在光感器变性的持续光损伤模型中玻璃体内 CERE-140(NT4-140) 之后的 ERG 结果。暗视 b- 波 ( 左图 ) 和明视 b- 波 ( 右图 ) 反应的平均振幅通过单独的数据点群 内的实线标明。
图 5 显示在 RP 的 P23H-1 转基因大鼠模型中玻璃体内注射 CERE-140 后的 ONL 的 厚度。显示在 CERE-140(NT4-140 ； 上面的显微照片 ) 注射的眼中视网膜的上方与对侧载体 注射的对照眼 ( 下面的显微照片 ) 相比较的代表性视网膜横截面。在显微照片下面的 “蜘 蛛图” 图解了穿过中线平面的视网膜中的多个匹配点的 ONL 厚度的不同。ONH ＝视神经头。
图 6 显示在 RP 的 S334-4 转基因大鼠模型中玻璃体内注射 CERE-140 后的 ONL 的 厚度。显示在 CERE-140(NT4-140 ； 上面的显微照片 ) 注射的眼中视网膜的上方与对侧载体 注射的对照眼 ( 下面的显微照片 ) 相比较的代表性视网膜横截面。在显微照片下面的 “蜘 蛛图” 图解了穿过中线平面的视网膜中多个匹配点的 ONL 厚度的不同。ONH ＝视神经头。
图 7 显示在视网膜变性的持续光损伤模型中玻璃体内注射 CERE-140 后的 ONL 的厚度。显示在 CERE-140(NT4-140 ； 上面的显微照片 ) 注射的眼中视网膜的上方与对侧的载 体注射的对照眼 ( 下面的显微照片 ) 相比较的代表性视网膜横截面。 在显微照片下面的 “蜘 蛛图” 图解了穿过中线平面的视网膜中多个匹配点的 ONL 厚度的不同。ONH ＝视神经头。
图 8 显示在 (A) 配制缓冲液 (FB) 对照和 (B)AAV/NTN(CERE-120 构建物 ) 注射的 眼中， 在玻璃体内注射 4 周后的神经秩蛋白 (neurturin， NTN) 免疫组织染色的显微照片图 像。GLC ＝神经节细胞层 ； IPL ＝内丛状层 ； INL ＝内核层 ； OPL ＝外从状层 ； ONL ＝外核层 ； IS ＝内节 ； OS ＝节 ； RPE ＝视网膜色素上皮。
图 9 显示在 RP 的 P23H-1( 左图 ) 和 S334-4( 右图 ) 转基因大鼠模型中， 在玻璃体 内注射 CERE-120(NTN-120) 之后的 ERG 结果的柱状图。平均 ERG 振幅的柱状图在顶部方框 中显示。误差线代表平均值的标准误差 (SEM)。每只大鼠的单独数据点被图示在具有线连 接的对侧眼的数据的两个较低的图中。
图 10 显 示 在 光 感 器 变 性 的 持 续 光 损 伤 模 型 中，在 玻 璃 体 内 注 射 CERE-120(NTN-120) 之后的 ERG 结果的柱状图。暗视 b- 波 ( 左图 ) 和明视 b- 波 ( 右图 ) 反应的平均振幅通过单独数据点群内的实线指出。
图 11 显示在光感器变性的 rcd3 狗模型中， 在玻璃体内 CERE-140(NT4-140) 之后 的 ERG 结果。明视 a- 波和闪烁 ERG 振幅的平均值 ( 顶图 ) 和单独的值 ( 底图 )。误差线代 表平均值的标准误差 (SEM)。每只动物的单独数据点被图示在具有线连接的对侧眼的数据 两个较低的图中。 与对侧配制缓冲液注射的对照眼相比， CERE-140 注射的眼中的明视 a- 波 振幅 (p ＝ 0.004) 和视锥细胞闪烁振幅 (p ＝ 0.01) 有显著的增加。 图 12 表明靶向递送 NT4 到视网膜下新血管形成的部位保护 vldlr-/- 视网膜免于 神经元变性。在视网膜下新血管形成区域周围的活化米勒细胞中， 在 GFAP 启动子控制下 的 (A-D) 腺相关病毒 2(AAV2) 质粒选择性地导致基因产物表达。所有病毒制品在 P14 注 射。(A)WT 视网膜用 AAV-GFAP-GFP 感染。(B)WT 视网膜用对照 CAG- 引发的启动子载体 (AAV-CAG-GFP) 感染。(C-D) 在 (P28， C) 注射后 2 周和在 (P45， D) 注射后 1 个月的米勒细 胞中 GFP 的表达。(E-F) 显示在异常新血管形成周围的视网膜下区域附近的 NT4 基因产物 的定位。(G) 提供在视网膜下新血管形成周围区域中的视蛋白 -1 和视紫红质 mRNA 的定量 RT-PCR 分析。(H-I) 提供对视网膜功能的 AAV-GFAP-NT4 处理的 ERG 分析。(J) 提供比较 3-4 个月龄的 WT 小鼠、 3-4 个月龄的未处理 vldlr-/- 小鼠、 4 个月龄的 AAV-GFAP-GFP 对照处 -/理的 vldlr 小鼠和 4 个月龄的 AAV-GFAP-NT4 处理的 vldlr-/- 小鼠的 ERG 测量的定量分 析。粗体 p 值表示在对侧处理的 AAV-GFAP-NT4 和 AAV-GFAP-GFP 眼之间的统计学显著地测 量。
发明详述
在描述本组合物和方法之前， 应该理解本发明不限于所描述的特定的方法学、 方 案、 细胞系、 试验和试剂， 因为这些可以变化。 也应该理解， 本文描述的术语意欲描述本发明 的特定的实施方式， 并且决不意欲限制所附权利要求中说明的本发明的范围。
应该说明的是， 如在本文和附加权利要求中使用的， 单数形式 “一个 (a)” 、 “一个 (an)” 和 “所述 (the)” 包括复数指代， 除非上下文另外清楚规定。因此， 例如， 提及 “载体 (a vector)” 包括多个这种载体， 提及 “神经营养蛋白” 是提及一种或多种神经营养蛋白和 本领域技术人员已知的其等价物， 等等。
除非另外定义， 本文使用的所有技术和科学术语具有属于本发明技术领域的一般 普通技术人员通常理解的相同含义。 虽然类似于或等同于本文描述的方法和材料的任何方 法和材料都可以在本发明的实施或试验中使用， 但是现在描述的是优选的方法和材料。
除非另外指出， 本发明的实施将使用本领域技术之内的化学、 生物化学、 分子生物 学、 细胞生物学、 遗传学、 免疫学和药理学的常规方法。这样的方法在文献中进行了充分地 说明。参见， 例如， Gennaro， A.R.， ed.(1990)Remington’ s Pharmaceutical Sciences， 18th ed.， Mack Publishing Co. ； Colowick， S. 等， eds.， Methods In Enzymology， Academic Press， Inc. ； Handbook of Experimental Immunology， Vols.I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell， eds.， 1986， Blackwell Scientific Publications) ； Maniatis， T. 等， eds. (1989)Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， 2nd edition， Vols.I-III， Cold Spring Harbor Laboratory Press ； Ausubel， F.M. 等， eds.(1999)Short Protocols in Molecular Biology， 4th edition， John Wiley & Sons ； Ream 等， eds.(1998)Molecular Biology Techniques ： An Intensive Laboratory Course， Academic Press) ； PCR(Introduction to Biotechniques Series)， 2nd ed.(Newton & Graham eds.， 1997， Springer Verlag)。
本发明公开了递送——特别是原位递送——编码生长因子——优选为 NT4——的 外源核酸用以治疗眼细胞的方法。出人意料地， 已知在治疗神经系统疾病中的其它环境中 有用的至少一种其它生长因子， 神经秩蛋白 (neurturin)(NTN)， 没有证明如在本发明的方 法中一样有效。 因此， 提供用于治疗眼细胞的优选的方法利用基因工程载体， 用于原位递送 NT4。 该方法包括使眼细胞与包含编码 NT4 的核酸的载体在以下条件下接触 ： 使眼细胞吸收 外源核酸进入所述眼细胞并且表达它。在一个实施方式中， 载体经由玻璃体内注射被递送 到 RGC 层。 可选地， 生长因子可以通过从供体细胞表达进行递送， 所述供体细胞已经用编码 生长因子如 NT4 的表达载体转化。在一个实施方式中， 生长因子经由供体细胞的玻璃体内 植入被递送到 RGC 层。
虽然不被理论约束， 但是假定将由根据本发明的编码生长因子 ( 例如， AAV/NT4) 的表达载体提供的功能和解剖学益处归因于生长因子——特别是 NT4——的生物活性是合 理的， 因为已经显示 NT4 蛋白在持续光损伤模型中救援光感器。相比之下， 其它生长因子 ( 包括 BDNF、 bFGF、 CNTF 和 GDNF) 也在数个光感器变性的体内模型中显示功效。再次， 不被 理论约束， 在经由视网膜下途径的玻璃体内 AAV/NT4 之后所看见的提高功效的一种可能解 释是靶向玻璃体内的空间， 特别是 RGC 层， 是在视网膜内释放 NT4 更有效的途径。后者的 假设将可能支持旁分泌机制， 由此光感器的生存力通过一个或多个第二信使分子被最终保 存。 同样地， 期望的是 ： 递送编码神经生长因子的表达载体到在距离光感器一段距离处的玻 璃体内空间 ( 即， 在玻璃体液内， 但是在其中的前点 )， 以最大化可以被旁分泌级联的生长 因子触发影响的间插细胞类型的数量。
本文的术语 “原位眼细胞” 或语法上的等价物指包含在眼内的眼细胞， 即， 体内的 眼细胞。眼细胞包括晶状体细胞、 角膜 ( 内皮细胞、 基质细胞和上皮角膜细胞 )、 虹膜、 视网 膜、 脉络膜、 巩膜、 睫状体、 玻璃体、 眼部血管、 巩膜静脉窦 (canal of Schlemm)、 眼部肌肉细 胞、 视神经、 和其它眼的感官神经、 运动神经和自主神经。 在优选的实施方式中， 眼细胞被包 括在视网膜神经节细胞层中。
本文的术语 “基因工程” 指已经进行重组 DNA 操作的核酸载体， 例如引入外源核酸 或者转基因， 产生不是在自然界中通常发现的形式的核酸载体。 一般而言， 外源核酸或者转 基因使用重组 DNA 技术进行制备。应该理解， 一旦制备了基因工程载体， 它可以非重组地复 制， 即， 使用宿主细胞的体内细胞机器， 但是将仍然被认为用于本发明目的的基因工程。同 样， 在供体细胞的情况中， 当用外源核酸——特别是重组的表达载体——转导时， 这种细胞 被认为已经进行了遗传加工。
本文的术语 “核酸” 或语法等价物指 DNA 或 RNA、 或者包括核糖核苷酸和脱氧核糖 核苷酸的分子。核酸包括基因组 DNA、 cDNA 和包括正义和反义核酸的寡核苷酸。核酸可以 是双链、 单链、 或者包含部分双链或单链的序列。
本文的术语 “外 源 核 酸 (exogenous nucleic acid)” 、 或 “外 生 核 酸 (foreign nuclear acid)” 、 或 “重组核酸” 或语法等价物指编码眼细胞中通常不以可感知的或治疗的 量产生的蛋白质的核酸。 因此， 外源核酸包括在眼细胞的基因组中通常见不到的核酸， 例如 来自其它生物的异源核酸。外源核酸也包括在眼细胞的基因组中通常见到， 但是其形式使 得蛋白质的表达在眼细胞中通常不以可感知的或治疗的量进行表达的核酸。可选地， 外源 核酸可以编码天然存在的蛋白质的变体或者突变体形式。 应该理解， 一旦制备外源核酸被制备并被再引入宿主细胞或生物中， 它将非重组 地进行复制， 即， 使用原位宿主细胞或者供体细胞的体内细胞机器， 而不是在体外进行操 纵； 然而， 这些核酸， 一旦重组地产生， 虽然随后进行非重组复制， 仍然被认为是用于本发明 目的 “外源的” 或 “重组的” 。
在一个实施方式中， 外源核酸编码待被表达的蛋白质。 也就是， 它是用于治疗眼疾 病的蛋白质。
在一个实施方式中， 外源核酸编码单个蛋白质。 在可选的实施方式中， 外源核酸编 码多于一种的蛋白质。因此， 例如， 对于治疗眼病症有用的数种蛋白质是可以期望的 ； 可选 地， 使用编码数种蛋白质的外源核酸， 可以同时治疗数种眼疾病。
类似地， “外源的” 或 “重组蛋白质” 是使用重组技术制备的蛋白质， 即， 通过如上 描述的外源或重组核酸进行表达。 重组蛋白质通过一个或多个特征区别于天然出现的蛋白 质。 例如， 通过使用诱导型启动子或者高表达启动子， 蛋白质可以以比通常看到的明显更高 高的浓度产生， 使得产生增加水平的蛋白质。因此， 例如， 外源蛋白质是在眼组织中不通常 表达的蛋白质。 可选地， 蛋白质可以是不在自然界中通常见到的形式， 如附加表位的加入或 者氨基酸替代、 插入或缺失。
在优选的实施方式中， 外源核酸编码在治疗眼疾病中有用的蛋白质。该蛋白质是 通过外源核酸表达的生长因子。提供的生长因子表达是瞬时的或者组成型的。因此， 例如， 当治疗用蛋白质被短时间地递送时， 可以使用瞬时表达系统 ； 例如， 在眼手术或者受伤后， 某些外源蛋白质是期望的。 可选地， 对于在进行的或者先天的眼疾病， 例如色素性视网膜炎 或黄斑变性， 可以期望组成型表达。
本文的 “眼疾病” 指相对于健康状态的动物是不正常的眼的病症或者病理状况， 无 论作为遗传缺陷、 损伤或者其它创伤 ( 例如， 手术后状况 )、 疾病或其它病症的结果。这种 眼疾病的本领域接受的动物模型是已知的 ； 例如， 视网膜变性表型的 rd 小鼠已经用作人色 素性视网膜炎研究的模型超过 30 年 (Lem 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA.， 15 ： 442(1992))。
生成和修复动物模型中的视网膜损伤的其它试验方案在本文示例。
在一种实施方式中， 眼疾病可以由遗传缺陷引起。基因已经被鉴定的这种眼 疾病的实例包括但不限于常染色体色素性视网膜炎、 常染色体显性白点状视网膜炎 (autosomal dominant retinitis punctata albescens)、 蝴蝶状色素中心凹营养不良 (butterfly-shaped pigment dystrophy of the fovea)、 成人卵黄状黄斑营养不良、 诺里 斯病 (Norrie’ s disease)、 蓝视锥细胞全色盲 (blue cone monochromasy)、 无脉络膜和脑 回状萎缩。这些也可以称为遗传性眼疾病。
在其它实施方式中， 眼疾病可以不由特定的已知基因型引起 ( 虽然它们可以在将 来显示为具有遗传成分 )。这些眼疾病包括但不限于黄斑变性、 眼癌、 前和后眼色素层炎 (anterior and posterior uveitis)、 视网膜血管性疾病 (retinovascular diseases)、 白 内障、 遗传性角膜缺陷 (inherited corneal defects) 如角膜营养不良、 视网膜脱离和虹膜 变性和萎缩、 和次生于青光眼和糖尿病的视网膜疾病， 如糖尿病性视网膜病。
另外， 术语眼疾病包括不是遗传基础的、 但是仍然引起眼病症或者机能障碍的状 况。这些包括但不限于病毒性感染如单纯疱疹病毒或巨细胞病毒 (CMV) 感染、 过敏性结膜 炎和其眼过敏性反应、 干眼、 溶酶体贮积病、 糖原贮积疾病、 胶原病症、 糖胺聚糖和蛋白聚糖 病症、 鞘脂类代谢障碍 (sphinogolipodose)、 脂质贮积病 (mucolipidose)、 氨基酸代谢紊 乱、 甲状腺机能障碍相关眼病、 前角膜和后角膜营养不良、 视网膜光感器病症、 角膜溃疡、 乌 斯赫尔综合征、 巴 - 比二氏综合征、 雷弗索姆病、 利伯先天性黑朦、 黄斑变性， 包括但不限于 湿和干形式的年龄相关的黄斑变性、 斯塔加特病、 卵黄状黄斑营养不良， 包括但不限于贝斯 特病、 无脉络膜、 视网膜先天性裂、 视锥细胞 - 视杆细胞营养不良、 视杆细胞 - 视锥细胞营养 不良、 遗传性黄斑变性疾病或 Doyne 蜂窝状脉络膜炎、 白点状视网膜炎和眼创伤如在手术 后的创伤或者由氧化应激 / 损伤引起的那些畸形， 如视网膜血管瘤样增生 (RAP) 和黄斑毛 细血管扩张症 (MacTel)。
本文的术语 “氧化损伤” 或 “氧化应激” 指以自由基的释放为特征的细胞中氧化 产物增加和导致细胞变性的状况。氧化应激与过量的新血管形成相关， 并且通常与某些 神经元——包括视锥光感器——的发病机理有关。在与异常的视网膜血管生成相关的病 症如尿病性视网膜病变中， 异常的血管可以从内视网膜生长进入玻璃体中。在常见形式 或者视网膜新血管形成中， 被称为黄斑毛细血管扩张症 ( 或特发性旁中心凹毛细管扩张 (idiopathic parfoveal talangiectasia))， 视 网 膜 膜 内 血 管 扩 张 血 管 (intraretinal talangectatic vessels) 在内视网膜的中心部分增生， 并且可以生长进入通常无血管的外 视网膜中。在年龄相关的黄斑变性 (AMD) 中， 异常血管一般产生自脉络膜并侵入视网膜下 间隙。然而， 在 AMD 患者的亚群中， 视网膜内和视网膜下的新血管形成产生于内视网膜血 管， 其是已知为视网膜血管瘤样增生 (RAP) 的状况。
在一个实施方式中， 公开了治疗光感器的疾病或损伤——包括氧化损伤——的方 法， 该方法包括施用组织特异性的启动子下的可操作编码生长因子的传染性重组表达载 体， 其中所述载体在玻璃体内施用到对象的眼睛， 并且当感染时， 生长因子表达基本上限于 眼中至少一种选择的组织。本文的术语 “组织特异性的启动子” 指选择性控制形态学类似 的细胞中的转录子的表达的调控元件， 所述细胞执行一种或多种选择功能。
在相关的方面， 载体包括胶质细胞原纤维酸性蛋白 (GFAP) 启动子。 GFAP 启动子序列在本领域中是熟知的 ( 参见， 例如， Besnard 等， J.Biol.Chem.， 266 ： 18877-18883， 1991 ； Masood 等， J.Neurochem.61 ： 160-166， 1993 ； Brenner 等， J.Neurosci.， 14 ： 1030-1037， 1994， 这些文章通过引用并入本文 )， 并且包含这种启动子的载体是商业可得的。当玻璃体 内递送的时候， 发现 GFAP 启动子对视网膜细胞， 特别是米勒胶质细胞， 具有特异性。
在另一方面， 治疗的方法也包括共同施用至少一种抗血管生成剂。 在相关的方面， 抗血管生成剂包括 VEGFR-1、 NRP-1、 血管生成素 2、 TSP-1、 TSP-2、 制管张素、 内皮抑制素、 血 管抑制素、 钙网蛋白、 血小板因子 4、 IMP、 CDAI、 Meth-1、 Meth-2、 INF-α、 INF-β、 INF-γ、 CXCL10、 IL-4、 IL-12、 IL-18、 凝血酶原 (kringle 结构域 -2) 抗血栓形成 III 片段、 促乳素、 VEGI、 SPARC、 骨桥蛋白、 乳腺丝抑蛋白、 癌抑素 (canstatin)、 增殖素相关蛋白质、 列斯蛋 白、 贝伐单抗 (bevacizumab)、 羧胺三唑 (carboxyamidotriazol)、 TNP-470、 CM101、 苏拉明 (suramin)、 血小板反应蛋白、 抗血管生成类固醇 / 肝素、 软骨源性血管生成抑制因子、 RNA 适配体 ( 例如， MACUGEN， OSI Pharmaceuticals， Long Island、 NY)、 基质金属蛋白酶抑制剂、 2- 甲氧雌二醇、 替可加兰 (Tecogalan)、 αvβ3 抑制剂和羧氨基喹啉。
本文的术语 “允许摄取外源核酸的状况” 指使原位眼细胞吸收外源核酸、 并被外源 核酸转化的实验状况。 所述允许的状况将取决于外源核酸的形式。 因此， 例如， 当外源核酸为病毒重组表 达载体的形式的时候， 允许的状况是使细胞感染病毒的状况。 类似地， 当外源核酸是质粒的 形式的时候， 允许的状况使质粒进入细胞。 因此， 外源核酸的形式和允许其被摄取的状况是 相关的。这些状况在本领域中一般是熟知的， 并且被应用于根据本发明体内递送表达载体 到眼细胞， 或者用于离体转导供体细胞。
摄取外源核酸的具体状况在本领域中是已知的。它们包括但不限于 ： 反转录病毒 感染、 病毒载体感染 ( 例如， 腺病毒、 腺病毒相关病毒 (AAV)、 慢病毒感染 )、 用质粒转化、 用 包含外源核酸的脂质体转化、 生物射弹核酸递送 ( 即， 装载核酸在金或其它金属颗粒之上 并且发射或者注入细胞中 ) 和疱疹病毒感染。这些都可以被认为是用于本发明目的的 “表 达载体” 。
在一个实施方式中， 载体是 AAV 载体。AAV 载体系统已经用于在真核细胞中表达 多种基因。Hermonat 和 Muzyczka， Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.， 81 ： 6466-6470， 1984， 产 生重组的 AAV(rAAV) 病毒库， 在其中新霉素抗性的基因 (neo) 被用于替换 AAV 衣壳基因， 并观察到 rAAV 将新霉素抗性转导到鼠和人细胞系中。Tratschen 等， Mol.Cell.Biol.， 4： 2072-2081， 1984， 产生了被发现在人细胞中表达氯霉素乙酰转移酶 (CAT) 基因的 rAAV。 Lafare 等， Virology， 162 ： 483-486， 1988， 观察到使用 AAV 载体基因转化进入定向造血干细 胞。Ohi 等， J.Cell.Biol.， 107 ： 304A， 1988， 构建了包含人 β- 球蛋白 cDNA 的重组 AAV 基 因组。Wondisford 等， Mol.Endocrinol.， 2： 32-39， 1988， 用两种不同的重组 AAV 载体进行 共转染， 每种载体编码人促甲状腺素的亚基， 并且观察到生物活性的促甲状腺素的表达。
已经设计了几种 rAAV 载体系统。例如， Samulski 等， J.Virol.， 61 ： 3096-3101， 1987， 构建了感染性腺相关病毒基因组， 其包含位于病毒编码区侧翼的两个 XbaI 切割位 点； 产生这些限制性酶切割位点以使非病毒序列插入 AAV 的顺式作用末端重复之间。美国 专利号 4,797,368 涉及包含在质粒中的 AAV 载体， 其能够被包装入 AAV 颗粒， 并且当在 AAV 转录启动子控制下的时候， 作为稳定维持或表达真核细胞中的基因或 DNA 序列的载体起作
用。 其它 AAV 载体和它们的用途在美国专利号 5,139,941 和 PCT 国际专利申请 WO 94/13788 以及在 Yokoi 等， Investigative Ophthalmology and Visual Science， 48 ： 3324-3328， 2007( 自我互补的 AAV 载体 ) 中描述。
已知多种 AAV 血清型具有眼组织定向 ( 参见， 例如 Allocca 等， Expert Opinion on Biological Therapy， 12 ： 1279-1294， 2006)。 这种血清型用作本发明中的表达载体是特 别优选的， 并且包括 AAV2 和 AAV5。
一般而言， 这些表达载体包括可操作地连接到外源核酸的转录和翻译调控核酸。 在上下文中 “可操作地连接” 指转录和翻译的调控 DNA 以这样的方式相对于外源蛋白质的 编码序列定位， 以使得转录被启动。 一般而言， 这将意味着启动子和转录起始或者开始序列 位于外源蛋白质编码区的 5’ 和 / 或 3’ 。转录和翻译调控核酸一般将适合于用于表达外源 蛋白质的眼宿主细胞 ； 例如， 来自哺乳动物细胞特别是人的转录和翻译调控核酸序列优选 地用于表达哺乳动物和人中的外源蛋白质。 多种类型的合适的表达载体和合适的调控序列 在本领域中是已知的。
一般而言， 转录和翻译调控序列可以包括但不限于 ITR、 TR、 启动子序列、 核糖体结 合位点、 转录起始和终止序列、 翻译起始和终止序列、 和增强子或激活因子序列。在优选的 实施方式中， 调控序列包括启动子以及转录起始和终止序列。 启动子序列编码组成型或诱导型启动子。 启动子可以是天然存在的启动子或杂合 启动子。杂合启动子， 其结合多于一种启动子的元件， 在本领域中也是已知的， 并且在本发 明中是有用的。
另外， 表达载体可以包括另外的元件。例如， 对于整合表达载体， 表达载体包含至 少一种与宿主细胞基因组同源的序列， 并且优选为位于表达构建物的侧翼的两种同源序 列。整合载体通过选择用于载体中的内含物的合适同源序列， 可以针对宿主细胞 ( 原位或 者体外供体细胞 ) 中特定的基因座。整合载体的构建体在本领域中是熟知的。
本文的 “用于治疗眼疾病的蛋白质” 指有效减轻眼疾病症状的蛋白质。眼疾病可 以是遗传性的， 或者可以不具有遗传成分。 因此， 例如， 眼创伤、 过敏反应、 病毒感染、 溃疡等 可以用有用的蛋白质治疗。例如， gD 是在单纯疱疹病毒感染的治疗中有用的一种蛋白质， 在角膜上皮伤口中转化生长因子 β(TGFβ) ； 用于眼过敏反应的抗 -IgE 抗体以及用于视 网膜变性的 BDNF、 GDNF 和 CNTF。神经营养蛋白 4(NT4) 和 BDNF 以及这些的融合体和 / 或 突变体可以用于视网膜变性或者推迟或防止视网膜血管疾病、 或者视网膜脱落或青光眼后 的损伤。这些神经营养因子也可以用于治疗视神经受压、 创伤或者脱髓鞘。免疫抑制蛋白 可以用于治疗角膜移植后的移植排斥。血管内皮细胞生长因子 (VEGF) 拮抗剂， 例如抗体 或者小分子， 可以用于治疗视网膜和玻璃体的新生血管性病症 (neovascular disorder)。 碱性成纤维细胞生长因子已经显示延长大鼠中光感器寿命 (Faktorovich 等， Nature 347 ： 83-86(1990))。然而， 如以上所说明的， 基于在实施例中描述的视网膜变性模型中使用 NT4 获得的良好结果， NT4 是用于本发明中的优选的生长因子。
在实施方式中， 在治疗眼疾病中有用的蛋白质是 NT4， 其中所述 NT4 通过载体递 送。在一方面， AAV 载体是全部或部分源自腺相关病毒载体型 2(AAV2) 的遗传加工的基因 转移载体。在相关的方面， AAV 载体是 AAV/NT4( 在图 1 中称为 “CERE-140” )。CERE-140 构 建物缺少所有编码病毒蛋白质的 DNA 序列， 但是包括编码人神经营养蛋白 -4(NT4) 的序列
( 参见， 例如， GENBANK 登录号 NM_006179))。NT4 转基因的表达通过 CAG 启动子 (CMV 增强 子与鸡 β- 肌动蛋基因启动子和兔 β- 球蛋白基因内含子的融合 ) 和人生长激素控制。
为了递送到眼， “单位剂量” 一般指载体基因组的浓度 / 毫升的药学上可接受的组 合物， 所述组合物由编码用于治疗眼疾病的蛋白质如 NT4 的载体组成。优选地， 对于使用 病毒表达载体递送神经营养蛋白， 根据本发明提供的每个单位剂量将包括治疗有效剂量的 药物组合物， 其中所述组合物包括在药学上可接受流体中的病毒表达载体， 并且每毫升的 10 15 组合物提供从 10 到多至 10 的蛋白质表达载体基因组 (Vg)。根据本发明的递送到 RGC， 1×1010vg/ 眼的药物组合物 ( 编码 NT4 的 AAV2) 产生 33.119±10.517ng/ 视网膜的可检测 NT4 蛋白。因为一般而言视网膜， 特别是 RGC， 是相对小的器官， 本领域普通技术人员应该能 够从用于实施本发明的动物模型中使用的剂量外推出临床剂量， 该临床剂量将在人中具有 可能的治疗益处。
根据本发明的编码生长因子的表达载体的实际递送是通过直接引入药物组合物 到玻璃体间隙、 或通过供体细胞的植入。对于载体 - 介导的施用路径， 注射是优选的递送 方法。然而， 特别是对于非载体递送编码生长因子的外源核酸进入玻璃体间隙 ( 例如， 通 过质粒 )， 其它的递送方法可以是合适的， 例如微注射 (DePamphilis 等， BioTechnique6 ： 662-680(1988)) ； 电 穿 孔 (Tonequzzo 等， Molec.Cell.Biol.6 ： 703-706(1986)， Potter， Anal.Biochem.174 ： ： 361-33(1988)) ； 化学介导的转染如磷酸钙转染 (Graham and van der EB， supra， Chen and Okayama， Mol.Cell.Biol.7 ： 2745-2752(1987)， Chen and Okayama， BioTechnique， 6： 632-638(1988)) 和 DEAE- 葡聚糖介导的转移 (McCutchan and Pagano， J Natl.Cancer Inst.41 ： 351-357(1968)) ； 阳离子脂质体介导的转染 (Felgner 等， Proc. Natl.Acad.Sci.USA， 84 ： 7413-7417(1987)， Felgner and Holm， Focus 11 ： 21-25(1989) 和 Felgner 等， Proc.West.Pharmacol.Soc.32 ： 115-121(1989)) 以及本领域已知的其它方法。
对于通过供体细胞植入的递送， 第一个步骤是在允许在其中摄取外源核酸的条件 下产生供体细胞。转移基因进入体外供体细胞的方法包括以下基本步骤 ： (1) 选择合适的 外源核酸， 如以上其它地方描述的 ； (2) 选择和培育合适和有效的基因转移载体， 如以上其 它地方描述的 ； (3) 从原代培养物或者建立的细胞系制备供体细胞 ； (4) 证明表达新功能的 供体植入细胞是活的， 并且可以稳定和有效地表达转基因产物 ( 一种或多种 ) ； (5) 证明植 入没有引起严重的有害影响 ； 和 (6) 证明对象中期望的表型效果。
植入供体细胞的选择严重地依赖于表达基因的性质、 载体的特征和期望的表型结 果。 供体细胞可以是活跃生长的细胞， 例如原代培养物或者建立的细胞系、 复制的胚性眼细 胞或者复制的成熟眼细胞。 细胞也可以是前体细胞、 祖细胞、 或干细胞 ； 即， 能发育成多种不 同细胞类型——包括眼细胞的多能细胞。眼细胞包括视网膜神经细胞 ( 例如， 视杆感光细 胞或视锥感光细胞 )、 视网膜色素上皮 (RPE) 细胞、 虹膜上皮细胞和视网膜干细胞 ( 例如， 视 网膜祖细胞 )。
植入细胞的长期存活可以取决于病毒感染对细胞的影响、 由培养条件产生的 细胞损伤、 细胞植入的技巧、 或者足够血管的建立以及宿主动物对外源细胞或对引入的 基因产物的免疫反应。哺乳动物的眼传统上被认为是免疫特惠器官 (immunologically privileged organ)。 虽然如此， 通过以下最小化排斥和由植入细胞诱导的植入物抗宿主反 应的可能是重要的 ： 在可行的情况下通过使用自体细胞 ； 通过使用不产生细胞表面抗原变化的载体， 除与表型校正相关的那些外 ； 和在可能情况下通过在宿主动物的免疫耐受期间 引入细胞， 如在胎儿生命中。种匹配的细胞因此是优选的 ； 例如， 灵长类细胞用于递送到灵 长类， 人细胞用于递送到人等等。
如本文使用的 “对象” 包括人和其它动物以及生物。因此， 方法可应用于人的治疗 和兽医应用。例如， 兽医应用包括但不限于 ： 狗、 牛、 猫、 猪、 马和绵羊动物， 以及包括爬行动 物、 鸟、 兔的其它家畜 ； 和啮齿动物， 如大鼠、 小鼠、 豚鼠和仓鼠。 也可以治疗有价值的非家畜 动物， 如动物园动物。 在优选的实施方式中， 动物是哺乳动物， 和在最优选的实施方式中， 动 物是人。
另外， 本发明中略述的方法在眼疾病动物模型的产生中是有用的。 即， 突变的基因 拷贝可以被引入动物中以产生用于药物筛选和治疗的模型。
以下实施例意欲说明但不是限制本发明。 实施例 1. 在 AAV/NT4 玻璃体内施用后， NT4 在视网膜中的表达。
通过免疫组织化学证实 AAV/NT4 介导的 NT4 的表达和随后从转导视网膜细胞的分 泌 ( 图 2)。 在玻璃体内注射后， NT4 主要在视网膜中整个最里面的视网膜神经节细胞 (RGC) 层中分布。在玻璃体内注射 AAV/NT4 后， NT4- 阳性内核层细胞 ( 无长突细胞、 双极细胞、 和 / 或水平细胞 ) 和偶而的米勒胶质细胞也在视网膜中检测到。 在玻璃体内注射 AAV/NT4 后， 也可以在光感器节中看见轻微的 NT4 标记。另外， 经由视觉通路， NT4 蛋白也被从 RGC 顺行 地运输到脑的视网膜接受区， 主要为脑的外侧膝状体核和上丘区。
在玻璃体内施用 AAV/NT4(1×1010vg/ 眼 ) 后的第 4 周， 在分离的视网膜中 NT4 的 量 也 通 过 ELISA 定 量。NT4 的 浓 度 是 1.015±0.259ng/mg 组 织 ( 平 均 值 ±SEM) 或 33.119±10.517ng/ 视网膜。 首次用于实验的和 FB 注射的眼的对照视网膜都是在测定的定 量的下限 (LLOQ) 以下 (0.032ng/ml)。
2. 在光感器变性的动物模型中玻璃体内 AAV/NT4 的功效。
AAV/NT4 的功效已经在光感器变性的试验大鼠模型中被证明， 包括 ： 色素性视网 膜炎 (RP) 的 P23H 系 1(P23H-1) 和 S334 系 4(S334-4) 转基因大鼠模型， 以及光线损伤视网 膜变性的持续光损伤模型 ( 在野生型白化 SD 大鼠中 )。表 1 显示光感器变性的速率 ( 和因 此的模型严重性 )， 该 AAV/NT4 途径被测试， 和对这三种模型进行试验测量。
表 1. 用于测试玻璃体内 AAV/NT4 功效的模型和相应的测量结果。
大鼠模型 突变 变性速率 试验结果测量
视网膜下 玻璃体内
CERE-140 CERE-140
P23H 视紫红质 ： 在密码子 中等 ERG ERG
系1 23* 处的单个氨基酸替 ONL 厚度 ONL 厚度
代
S344 系 4 视紫红质 ： 最后 15 个氨 中等 ERG ERG
基酸的 C- 端平截 ONL 厚度 ONL 厚度
持续光损 N/A 非常快 ONL 厚度 ERG
伤 ONL 厚度
*RP.N/A 中最常见地突变＝不可适用的。ERG ＝视网膜电流图 ； ONL ＝外核层 ( 由 光感器核组成 ).
这 3 个模型中光感器变性的两个主要结果是 ： 1) 视网膜神经元响应闪光刺激的电 生理反应减少， 如视网膜电流图 (ERG) 测量的， 和 2) 感光细胞的数量的减少， 并且因此， 在 外核层 (ONL) 厚度中感光细胞的数量减少， 其中感光细胞体存在于视网膜中。而 ONL 厚度 的测量提供光感器变性量的定量解剖指数， ERG 测量评估视网膜的功能。
ERG 测量的三个主要组分是暗视 b- 波、 暗视 a- 波和明视 b- 波 ( 参见表 2)。
表 2.ERG 信号以及它们的细胞和功能量度。
ERG 信号 相关细胞类型 ( 一种或多种 ) 功能量度
暗视 b- 波 内核层细胞 总体功能， 包括下游元件
暗视 a- 波 视杆光感器 外周、 低光、 单色视觉
明视 b- 波 视锥光感器 中心、 亮光、 色觉
暗视 b- 波主要反映内视网膜细胞——包括双极细胞和米勒细胞一一的健康状况， 因此， 代表视网膜的总体功能的量度。暗视 a- 波主要反映视杆光感器的功能反应， 该细胞 类型主要负责在低光中的外周单色视觉。暗视 b- 波主要反应视锥光感器的功能反应， 该细 胞类型主要负责在亮光中的中心色觉。
对于涉及 P23H-1 和 S334-4 系的功效试验， 转基因大鼠在 P11-12( 即， 出生后的 11 至 12 天 ) 注射。对于持续光损伤模型， 大鼠在暴露于持续的光之前大约 4 周被注射。在 所有的情况中， 大鼠用 2μl 的总体积单侧玻璃体内注射 2.4×1010AAV/NT4vg/ 眼睛。对侧 眼睛用 2μl 的配制缓冲液 (FB) 在对照动物内注射。视网膜电流图测量在杀死 P60-64 的 23H-1 和 S334-4 大鼠之前或在持续光暴露 7 天之后进行， 以评估与对侧对照眼相比， AAV/ NT4 注射的眼睛中的视网膜的生理健康状况。在杀死后， 眼睛进行组织学处理， 以测量外核 层 (ONL) 厚度和定性评估视网膜结构。
ERG 数据。在玻璃体内施用 AAV/NT4 之后， 与配制缓冲液注射或未注射的对侧对 照眼睛相比， 所有的 b- 波和 a- 波 ERG 反应在 P23H-1 和 S334-4 模型中都显著得改善 ( 图 3)。在暗视 b- 波、 暗视 a- 波和明视 b- 波振幅中可见的增加在两个模型中都是非常显著的 (p 值 ： 在 P23H-1 模型中， 暗视 b- 波振幅 0.0002， 暗视 a- 波振幅 0.0004， 和明视 b 波振幅 ＜ 0.0001 ； 在 S334-4 模型中， 暗视 b- 波振幅 0.0119， 暗视 a- 波振幅 0.0039， 和明视 b 波 振幅 0.0169)。 这些结果显示玻璃体内 AAV/NT4 可以阻止或减少这些 RP 模型中与光感器变 性相关的功能缺陷， 并且可以特定地保护或者恢复视杆细胞、 视锥细胞和其它下游的内视 网膜细胞的健康， 所述下游的内视网膜细胞例如双极细胞和米勒胶质细胞。 而且， 这些结果 表明在提供光感器变性的功能保护方面， 特别是对于视杆光感器群， 玻璃体内施用途径比 视网膜下途径更有效。
在持续光损伤模型中， 玻璃体内 AAV/NT4 对于暗视 b- 波和明视 b- 波 ERG 反应也 有积极作用 ( 图 4)。虽然在眼睛之间存在相当大的差异， 但是在玻璃体内注射 AAV/NT4 后 两个模型中的平均暗视和明视 b- 波振幅都比对照眼中大。暗视 a- 波振幅由于变性的严重 性， 在所有眼中缺乏这些测量。因此， 存在 AAV/NT4 保护视网膜功能 ( 特别是内核层细胞和 视锥细胞的功能 ) 的趋势， 然而， 视杆细胞的功能性在该严重的变性模型中仍然被削弱。在玻璃体内注射之后， 组织学的分析一致揭示， 在 P23H-1 和持续光损伤模型中， 与 FB 注射的对侧对照眼相比， 注射 AAV/NT4 的眼的整个视网膜中的外核层 (ONL) 厚度显著 的增加， 然而， 对于有意义的增加， 在 S334-4 模型中没有达到统计学意义。对于每个模型， 视网膜横截面的代表性图像以及取自穿过 AAV/NT4 注射和对照眼的视网膜的区域匹配的 区的平均 ONL 厚度测量的 “蜘蛛状图” 被显示。
对于 P23H-1 转基因小鼠模型， 图 5 显示 AAV/NT4 注射的眼中的 ONL( 通过暗着色 细胞层识别 ) 显得更厚， 具有更大数量的感光细胞体行。 另外， 不同于对照眼， AAV/NT4 注射 的眼具有坚固的外光感器节和内光感器节， 具有合适形态和排比。 “蜘蛛状图” 显示玻璃体 内 AAV/NT4 的神经保护作用在整个视网膜中被显示， 并且不限制于焦点区。而且， AAV/NT4 注射的眼中的 ONL 厚度的增加是非常显著的 (p ＝ 0.003)。
对于 S334-4 转基因小鼠模型， 图 6 显示与对照相比， AAV/NT4 注射的眼中的光感 器外节和内节显得更健康， 具有合适的形态学和排比。 “蜘蛛状图” 揭示增加 ONL 厚度的趋 势， 但是这种效果没有统计学显著性 (p ＝ 0.195)。
对于持续光损伤模型， 图 7 显示， 虽然两个视网膜都是基本变性， 在 AAV/NT4 注射 的眼中的增加的 ONL 厚度是清晰可见的。需要说明的是， 在该模型中， 对照载体注射的眼中 的光感器在该阶段几乎完全不存在， 这显示模型的严重性。 “蜘蛛状图” 显示玻璃体内 AAV/ NT4 的神经保护作用在整个视网膜中被证明， 并且不限制于焦点区。而且， AAV/NT4 注射的 眼中的 ONL 厚度的增加是非常显著的 (p ＜ 0.002)， 即使在这种严重和快速的光感器变性的 模型中。 3. 玻璃体内 AAV/NT4 功效结果与用视网膜下注射获得的功效结果的比较。
玻璃体内 AAV/NT4 注射导致在所有 3 个测试的大鼠模型中光感器 ONL 厚度形态学 的改善， 在 P23H-1 和持续光损伤模型中具有显著的增加。 在 S334-4 模型中存在增加 ONL 厚 度的趋势， 其中大鼠的亚群清楚地对治疗反应。 另外， 玻璃体内 AAF/NT4 导致 ERG 暗视 a- 波 的显著增加 ； 因为暗视 a- 波反映视杆光感器——视网膜中最大量的感光细胞类型——的 功能健康状况， 当玻璃体内施用的时候， AAV/NT4 大概发挥了对视杆光感器群施加神经保护 作用。同时， ERG 结果显示玻璃体内 AAV/NT4 施用的暗视和明视 b- 波振幅显著的增加， 表 明 AAV/NT4 介导的递送 NT4 到视网膜也可以有利于视锥细胞和内视网膜细胞的健康。
视网膜下注射 AAV/NT4 导致主要在感光细胞自身中的 NT4 蛋白质表达， 和在视网 膜色素上皮细胞 (RPE) 中一些额外的表达。与玻璃体内结果相比， 视网膜下施用 AAV/NT4 的结果显示在这 3 个模型中的任一个中感光细胞没有变化。ONL 厚度测量显示当在 P23H-1 和 S334-4 转基因模型或持续光损伤模型中视网膜下施用的时候， AAV/NT4 注射的和 FB 注 射 ( 或未注射 ) 的眼之间没有不同。考虑到在视网膜下注射 AAV/NT4 之后缺少明显的光感 器节省 ( 光感器剩余， photoreceptor sparing)， 在这些模型中都不存在显著的暗视 a- 波 ERG 反应的改善不出人意料， 因为暗视 a- 波代表视杆细胞—— ONL 中最大量的感光细胞类 型——的功能状态。对于 P23H-1 和 S334-4 系， ERG 测量显示 ： 与对侧 FB 注射的对照相比， AAV/NT4 注射的眼的暗视 b- 波和明视 b- 波显著增加 ( 配对 t- 检验 p 值 ： 在 P23H-1 模型 中， 对于暗视 b- 波振幅为 0.0057， 对于明视 b- 波振幅为 0.0009 ； 在 S334-4 模型中， 对于 暗视 b- 波振幅为 0.0027， 对于明视 b- 波振幅为 0.0019)( 图 4)。然而， 视网膜下 AAV/NT4 注射的这些积极变化的范围比在相同模型中的玻璃体内 AAV/NT4 观察到的那些小得多。因
此， 组织和功能分析表明 AAV/NT4 施用的玻璃体内途径比视网膜下途径在保护光感器变性 方面更有效的。
在玻璃体内 AAV/NT4 注射后， 非常少的光感器被转导。然而， 由于视网膜下注射直 接靶向光感器而不引起感光细胞损伤， 所以光感器中的 NT4 表达对于普遍的神经保护似乎 不是必须的。因此， 当被 NT4 刺激时， 另一种细胞类型如米勒细胞可以提供阻止感光细胞死 亡或功能丧失必需的营养支持。 在任一种情况中， 与进行视网膜下施用相比， 玻璃体内施用 显得提供更大量的组织和功能保护， 特别是对视杆光感器的保护。
4.AAV/NTN 玻璃体内施用之后， 视网膜中的 NTN 表达。
CERE-120 是源于腺相关病毒载体型 2(AAV2) 的一种基因工程的基因转移载体。 CRE-120 在结构和序列上与 CRE-140 相同， 除了 CERE-140 中的编码人 NT4 蛋白的序列在 CERE-120 中用编码与人 β- 神经生长因子 (βNGF) 的前 / 原 (pre/pro) 序列融合的成熟人 神经秩蛋白 (NTN) 的序列替代。
AAV/NTN 介导的表达和随后转导视网膜细胞的 NTN 的分泌已经通过免疫组织化学 确认 ( 参见图 8)。在玻璃体内注射后， NTN 主要通过视网膜中最里面的视网膜神经节细胞 (RGC) 层进行分布。在玻璃体内注射 AAV/NTN 之后， NTN- 阳性内核层细胞 ( 无长突细胞、 双 极细胞、 和 / 或水平细胞 ) 和偶然的米勒胶质细胞也在视网膜中被检测到。在玻璃体内注 射 AAV/NTN 后， 也可以在光感器节中看见轻微的 NTN 标记。在玻璃体内注射 AAV/NTN 后观 察到的 NTN 转基因表达谱与在玻璃体内 CERE-140(AAV/NT4) 施用之后所看见的 NT4 表达谱 事实上相同。 5. 光感器变性的动物模型中的玻璃体内 AAV/NTN 的功效。
在光感器变性的数个试验大鼠模型中进行 AAV/NTN 的功效的研究， 所述模型包 括： 色素性视网膜炎 (RP) 的 P23H 系 1(P23H-1) 和 S334 系 4(S334-4) 转基因大鼠模型， 以 及光线损伤的视网膜变性的持续光损伤模型 ( 在野生型白化 SD 大鼠中 )。 这些是测试玻璃 体内 AAV/NT4 的作用的相同模型， 并且对 CERE-140 和 AAV/NTN 载体的检查的结果测量也完 全相同。
对于包括 P23H-1 和 S334-4 系的功效试验， 转基因大鼠分别在 P12 或 P15( 即， 在 出生后的 12 或 15 天 ) 注射。对于持续光损伤模型， 在暴露于持续的光之前， 野生型大鼠被 10 注射大约 4 周。在所有的情况中， 大鼠以 2μl 的总体积的 2.4×10 AAV/NTN vg/ 眼睛单侧 玻璃体内注射。对侧眼睛用 2μl 的配制缓冲液 (FB) 注射用作动物内对照。视网膜电流图 测量在杀死之前进行——对于 23H-1 大鼠在 P60， 对于 S334-4 大鼠为 P65——或在野生型 大鼠持续光暴露 7 天之后进行， 以与对侧对照相比， 评估 AAV/NTN 注射的眼中的视网膜的生 理健康状况。在杀死后， 眼进行组织学处理， 以测量外核层 (ONL) 厚度和定性评估视网膜结 构。
ERG 数据。与 FB 注射或者未注射对侧的对照眼相比， 玻璃体内施用 AAV/NTN 在 P23H-1 和 S334-4 模型中都产生中等的功能益处 ( 图 9)。在 P23H-1 模型中， AAV/NTN 介导 的 NTN 递送仅导致显著增加暗视 b- 波 (p ＝ 0.0136)。在 S334-4 模型中， 在所有三种波中 都见到显著的增加 (p 值 ： 暗视 b- 波振幅为 0.0340， 暗视 a- 波振幅为 0.0469， 和明视 b- 波 振幅为 0.0041)。相比之下， 相同剂量的 AAV/NT4( 递送 NT4) 导致两个模型中所有 3 种波 都显著增加， 并且这些增加的量和显著性 AAV/NT4 比 AAV/NTN 大得多 ( 图 3 和 4 与图 9 比
较 )。 在持续光模型中， 对于玻璃体内 AAV/NTN， 在 3 种 ERG 波的任一种中都没有看见改 善 ( 图 10)。暗视 a- 波振幅由于变性的严重性， 在所有眼中的这些测量中都不存在。相比 之下， 玻璃体内 AAV/NT4 导致暗视 b- 波和明视 b- 波 ERG 反应的中等改善， 然而， 由于差异， 这些增加没有达到统计学显著性。尽管如此， 存在 AAV/NT4 保护视网膜功能 ( 特别是内核 层细胞和视锥细胞的功能 ) 的趋势， 但是 AAV/NTN 在这种严重的变性模型中是无效的。
组织学数据。组织学分析显示 ： 在 P23H-1 和 S334-4 转基因大鼠模型中或者在 RP 的在持续光损伤模型中， 与 FB 注射对侧的对照眼相比， 玻璃体内 AAV/NTN 注射对于整个视 网膜中的外核层 (ONL) 厚度完全没有作用。相比之下， 在 P23H-1 和持续光损伤模型中， 在 玻璃体内 AAV/NT4 之后， 见到整个视网膜中的 ONL 厚度显著增加， 在 S334-4 模型中， 具有增 加 ONL 厚度的趋势 ( 参见图 5、 6 和 7)。
6. 在光感器变性的 rcd3 狗模型中的玻璃体内 CERE-140.
光感器变性的 rcd3 狗模型。rcd3 狗是携带 PDE6A 基因突变的威尔士矮脚狗 (Cardigan Welsh corgi dog) 的一个品系。 这种基因编码环 -GMP 特异的磷酸二酯酶 6A—— 一种在视杆光感器外节中表达的蛋白质， 其调控膜电流并因此参与视觉信号的传输和放 大——的 α 亚基。 PDE6A 中的突变可以导致称为视杆细胞 - 视锥细胞发育异常的渐进性视 网膜萎缩的表型， 其以视杆光感器的最初的损失和随后视锥光感器的损失为特征。
rcd3 狗中的视杆细胞 - 视锥细胞发育异常是早期发作的并且非常迅速的。 虽然进 展的速率较慢， 但是光感器变性的类似模式在色素性视网膜炎 (RP) 和数个其它致盲疾病 中出现。而且， PDE6A 突变具体地占小百分比的 RP 病例。因此， rcd3 狗是测试 RP 和其它光 感器变性疾病的潜在疗法的相关模型。
rcd3 狗模型中的玻璃体内 CERE-140 的功效。大鼠中的研究已经证明视网膜中基 于 AAV2 的载体的最大转基因表达在玻璃体内注射后大约 4 周出现。因此， 在早期时间点 rcd3 狗被给药 CERE-140， 以确保相对于病理发作充分表达 NT4。 总计 8 只狗每只在右眼中接 受 CERE-140 的一次玻璃体内注射。 5 只狗在出生后第 4 天用 15μL 的 CERE-140 注射 ( 总剂 11 量： 3.8×10 vg)， 而 3 只狗在第 9 天 (n ＝ 1) 或第 12 天 (n ＝ 2) 用 20μL 的 CERE-140( 总 11 剂量 ： 5.0×10 vg) 注射。对侧左眼用相等体积的配制缓冲液玻璃体内注射， 以用作动物内 对照。
在大约 7 周的年龄进行视网膜电流图 (ERG) 测量， 以评估响应闪光的视锥细胞的 功能。由于视杆细胞在非常小年龄的 rcd3 突变狗中就不起作用， 因此没有期望在该模型中 恢复视杆细胞的功能。因此， 只有反映视锥光感器健康状况的那些 ERG 测量被具体地分析。 视锥细胞功能的两个相关 ERG 测量是明视 a- 波——在正常光照条件下产生于亮光的单闪 光的 ERG 信号的组分——， 和视锥细胞闪烁反应——产生于明亮白光的高频 ( 大约 30Hz) 闪烁的电信号， 所述明亮白光选择性地刺激视锥细胞。
ERG 结果。在第 7 周获得的 ERG 的结果在图 11 中显示。与配制缓冲液注射的对 照眼相比较， 在明视 a- 波和视锥细胞闪烁反应中都看见显著的增加。在 CERE-140 注射的 眼中观察到的明视 a- 波 ERG 振幅和闪烁反应的显著增加显示出光感器变性的 rcd3 模型中 CERE-140 保护视锥细胞功能， 其保存视锥光感器的电生理活性。 在人中， 这种治疗应该防止 中央视觉、 高敏度视力、 色觉的丧失。
7.vldlr-/- 小鼠中异常视网膜新血管形成的组合疗法和 GFAP 启动子的组织特异性。 VLDLR(vldlr-/-) 缺 陷 的 小 鼠 表 面 上 看 上 去 是 正 常 的， 是能存活并能繁殖的 (Frykman 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 92 ： 8453-8457， 1995)， 但是显示出视网膜维管结 构 的 异 常 (Heckenlively 等， Retina， 23 ： 518-522， 2003 ； Li 等， Arch.Ophthalmol.， 125 ： -/793-803， 2007)。新生 vldlr 小鼠的系统评估显示了新生后的第一周中视网膜血管的正 常发育。在新生后第二周期间， vldlr-/- 视网膜显示浅表血管丛和相关的星形胶质细胞的 短暂的过度增殖， 特别是在视网膜外周附近的新血管区。这种相关的星形胶质细胞增生与 先前研究一致， 证明了在浅视网膜中血管和星形胶质细胞之间的直接相关性 (Dorrell 等， Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.， 43 ： 3500-3510， 2002 ； Stone and Dreher， J.Comp.Neurol.， 255 ： 35-49， 1987 ； Fruttiger 等， Neuron， 17 ： 1117-1131， 1996)。 到新生后第三周， 浅表血管 丛中血管和星形胶质细胞密度退回到正常水平。
到新生后第五周， 正常 RPE 单层在视网膜下血管损伤周围被破坏， 并且多层的 RPE -/细胞包围 vldlr 视网膜中的新生血管复合物。 在 5 周期间的累积的异常 (abnormality) 导 致视网膜的焦点变形 (focal distortion) 和伤痕， 并且与光感器内节 (PIS) 和外节 (POS) 的焦点丧失相关， 这通过异常的视网膜形态学和视网膜下新生血管形成区中不存在红 / 绿 (rd/gr) 视蛋白染色来证明。 也观察到光感器变性。 神经异常决不先于视网膜内和视网膜下 的新生血管形成的出现。 在新生后 12 天 (P12)， 就在异常的新血管形成出现之前， 当通过电 子和共聚焦显微镜评估时， 所有的视网膜层都是完整的并且与年龄匹配的野生型 C57BL6/ J(WT) 对照相同。因此， vldlr-/- 小鼠中的神经异常似乎是新血管形成的结果， 而不是其原 因。
虽然视网膜下新血管形成的显著惊人减少可以使用抗 - 血管发生疗法 ( 例如， 用
MACUGEN， 与 T2-TrpRS 一起的整联蛋白和拮抗剂， 具有抗 - 血管发生活性的色氨酸 tRNA 合成酶的片段 ) 获得， 该作用只是暂时的 ； 在治疗后 2-3 周内， 视网膜下的新血管 形成在治疗动物中恢复。这与报道抗 - 血管发生的有利作用的临床观察结果类似， 但是通 常只是部分的作用， 并且一般涉及慢性治疗。 因此， 用于保护眼血管疾病中的视网膜视觉的 另外策略仍然是需要的 (Bradley and Robinson Angiogenesis(2007)10 ： 141-148)。使用 特异递送到视网膜新血管形成部位和因此视网膜变性的活性部位的神经营养因子， 作为保 护患有血管疾病的眼中视网膜神经元功能的药剂， 进行进一步的分析。
将 0.5μL 的 腺 相 关 病 毒 颗 粒 溶 液 —— 其 效 价 为 大 约 1e13vg/mL、 包含 AAV-CAG-GFP( 引发 GFP 表达的 CAG 启动子 )、 AAV-GFAP-GFP( 引发 GFP 表达的 GFAP 启动 子 )、 或 AAV-GFAP-NT4( 引发神经营养蛋白 -4 表达的 GFAP 启动子 )， 玻璃体内注射进入 2 -/周龄的 vldlr 小鼠眼中。通过在注射后的第 1 个月和第 2 个月分析 GVP 表达来评估病毒 转染。对在神经退行性表型的 vldlr-/- 小鼠的作用在注射后 3 个月进行评价。
米勒细胞中的 GFAP 活化在 vldlr-/- 小鼠视网膜中的视网膜下新血管形成的周围 特异地出现。 GFP 载体 (AAV-GFAP-GFP) 的玻璃体内注射证明表达限于对照——WT 小鼠—— 中的内视网膜 ( 图 12A)。然而， 在 vldlr-/- 小鼠的整个内视网膜和外视网膜中观察到 GFP 表达， 特别是由邻近于视网膜下新血管形成的激活的米勒细胞表达 ( 图 12C-D)。 相比之下， 具有普遍存在的 CAG 引发的启动子 (AAV-CAG-GFP) 的对照载体显示了通过所有的内视网膜细胞的 GFP 的非特异表达， 但是在外视网膜中具有最小的表达 ( 图 12B)。通过使用具有 GFAP 启动子的 AAV 病毒载体靶向激活的米勒胶质细胞， 实现特异递送载体产物到与视网膜 下新血管形成直接相邻的区域中的外视网膜。
已经显示神经营养蛋白 -4(NT-4) 在包括视网膜变性的神经元变性的数个模 型 中 保 护 神 经 元 (Lykissas 等， Curr.Neurovasc.Res.， 4： 143-151， 2007 ； Harada 等， Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.， 46 ： 669-673， 2005)。类似于 GFP 载体， 具有 GFAP 引发表达 NT-4(AAV-GFAP-NT4) 的 AAV-2 载体特异地导致 NT-4 在邻近视网膜内新血管形成的激活米 勒细胞中产生 ( 图 12E)。 这导致在整个视网膜中心的三分之二的视网膜下新血管形成区域 附近的光感器的外节和内节处， NT-4 大量积累 ( 图 12F)。
使用 AAV-GFAP-NT4 载体保护视网膜免于神经元变性， 如通过归一化视蛋白和视 -/紫红质 mRNA 表达观察到的 ( 图 11G)， 并且保护 vldlr 视网膜没有视觉功能特征的损伤， 如通过 ERG 分析观察到的 ( 图 12H-J)。这种保护， 其由选择性递送神经营养因子到具有视 网膜下新血管形成的视网膜区域提供， 有力地表明在视网膜内的异常新血管形成和神经元 变性是直接相关的。 而且， 因为米勒胶质的激活与多种视网膜疾病相关， 特别是与相关的异 常新血管形成的那些相关， 这些结果提供概念验证数据， 其支持利用玻璃体内注射， 使用激 活的米勒胶质， 用于病毒介导 (GFAP 载体 ) 递送各种治疗性基因产物到外视网膜。
以上引用的所有文献通过引用并入本文。在 2008 年 2 月 7 日提交的美国临时专 利申请第 61/026,990 号和在 2008 年 8 月 29 日提交的美国临时专利申请第 61/093,228 号 的整个内容和附图也通过引用并入本文。
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