一种高效快速的甘蔗转基因方法 【技术领域】
本发明属于植物生物技术领域，涉及一种甘蔗转基因育种方法，具体是一种高效快速的甘蔗转基因方法。
技术背景
甘蔗是全世界最为重要的糖料经济作物，也是我国热带、亚热带地区重要的糖料经济作物。目前我国是世界第三大产糖国，2008/2009榨季全国总产糖量达到1243万吨，其中甘蔗糖占总产糖量的94％。近年来甘蔗还发展成为一种重要的能源作物，是生产绿色燃料——酒精的重要原料。
由于现代甘蔗栽培种是甘蔗属热带种，割手密和印度种等物种的种间杂交种，在长期的高贵化育种过程中，减数分裂的异常使得现代甘蔗栽培种形成大量的非整倍体，其染色体数量多、基因组结构复杂、在同株中染色体倍数不同，同时由于甘蔗对光周期反应敏感，许多重要亲本在亚热带和温带地区很难开花，即使开花花粉数量也不足，而且经常与近缘植物的花期不遇，这给常规的抗逆育种带来许多困难。因此基因工程转基因技术成了甘蔗品种遗传改良的重要途径。
目前甘蔗的遗传转化技术主要有基因枪转化法和农杆菌介导法。早期甘蔗转基因植株的获得主要是采用基因枪转化法，但该法转化效率较低，嵌合体比较多，外源基因插入拷贝数比多，遗传稳定性比较差，转化成本高。1998年以来，世界多个实验室采用农杆菌介导法，获得很多种转基因植株。农杆菌介导法的优点在于外源基因插入的拷贝数低，对受体伤害小，而且实现了大片段DNA的转化。在农杆菌介导法的转化过程中，乙酰丁香酮的正确采用虽然大幅提高了农杆菌介导法的转化效率，但其转化效率约为3％，还是不能满足转基因工程的产业化发展需求，而且农杆菌介导法在甘蔗遗传转化中仍然存在不足：(1)在甘蔗愈伤组织的采用上一直沿袭着早期基因枪转化法的愈伤继代诱导方式，愈伤本身分化效率偏低，直接影响了最后的转化效率；(2)在农杆菌与愈伤组织共培养后，很难将农杆菌彻底清除干净，导致分化培养与再生培养时期污染严重；(3)通常采用共培养后愈伤组织分化期即进行筛选，但因甘蔗愈伤组织分化的芽较小，抗性芽很难长高，导致在更换培养基过程中很难将抗性芽与被筛选剂杀死的芽区分开来。(4)转化时间较长，达6个月以上。
【发明内容】
本发明的目的在于克服原有农杆菌介导法甘蔗遗传转化技术的不足而提供一种高效快速的甘蔗转基因方法，通过改变转化模式，大大提高了转化效率，缩短了转化的时间，节约了转化的成本。
本发明所采用的技术方案：
一种高效快速的甘蔗转基因方法，包括甘蔗胚性愈伤组织的诱导过程，农杆菌的活化及胚性愈伤组织的转化过程，胚性愈伤组织的分化再生及筛选过程，转化小植株DNA/RNA微量提取及PCR与RT-PCR鉴定过程：
1、甘蔗胚性愈伤组织的诱导过程：以优良甘蔗栽培种的顶端生长点处的幼叶组织为外植体，外植体经消毒、无菌水冲洗、无菌滤纸吸干其表面的水分后切成薄片接种于诱导培养基上，于避光条件下进行培养至诱导出胚性愈伤组织。所述诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加1-2mg/L 2，4-D、30g/L蔗糖、8g/L卡拉胶。
2、农杆菌的活化及胚性愈伤组织的转化过程：将含有目的基因的农杆菌EHA105单菌落接种到活化培养基中震荡培养，通过离心回收菌体，再重悬于等体积vir基因诱导培养基中继续震荡培养，以诱导农杆菌质粒vir基因的表达，此菌液即为转化用的农杆菌工程菌液；将甘蔗胚性愈伤组织转入农杆菌菌液中，浸泡后再接种于共培养培养基上于黑暗条件下共培养，然后接种于分化培养基上。所述活化培养基是以YEP为基础培养基，并添加相应抗生素Kan 50μg/mL，Str50μg/mL，Rif 50μg/mL。所述vir基因诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，其中大量元素修改为原含量的1/5，并添加1mg/L2.4-D、10mmol/L果糖、10mmol/L葡萄糖、30g/L蔗糖、100-150μmol/L乙酰丁香酮。所述共培养培养基是以MS培养基为基础培养基，其中大量元素修改为原含量的1/5，并添加1mg/L2.4-D、10mmol/L果糖、10mmol/L葡萄糖、30g/L蔗糖、100-150μmol/L乙酰丁香酮、卡拉胶20g/L。所述分化培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加1mg/L6-BA、0.2mg/LKT、30g/L蔗糖、8g/L卡拉胶。
3、胚性愈伤组织的分化再生及筛选过程：将接种于分化培养基上的胚性愈伤组织置于1500lux，14h/d光照条件下培养至胚状体形成，然后将胚状体更换到生芽培养基上，继续置于1500lux，14h/d光照条件下培养产生小芽，然后将小芽转接到成苗培养基上，1500lux，14h/d光照条件下培养至长成小苗，将长成0.5cm-3cm的小苗转接到抗性培养基上于1500lux，14h/d光照条件下培养18-25天获得抗性植株，将抗性植株单株单瓶按编号培养于壮苗生根培养基上进行抗性植株的生根壮苗培养18-25天。所述生芽培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加0.2mg/L6-BA、30g/L蔗糖、8g/L卡拉胶。所述成苗培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加30g/L蔗糖、8g/L卡拉胶。所述抗性培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加5mg/LIBA、250ul/LPPT、30g/L蔗糖、8g/L卡拉胶。所述壮苗生根培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加5mg/LIBA、250ul/LPPT、30g/L蔗糖、8g/L卡拉胶、50-100ml/L椰子汁。
4、转化小植株DNA/RNA微量提取及PCR与RT-PCR鉴定过程：按编号剪取单株单瓶培养于壮苗生根培养基上的抗性植株的叶片，剪碎后置于液氮中冷冻3-8秒，研碎，用CTAB法提取DNA，然后进行PCR检测。经PCR检测为阳性的植株用同样的方法提取RNA进行RT-PCR检测。最后将PCR及RT-PCR检测均呈阳性的植株从培养基中取出洗净炼苗后移栽到大棚。
本发明对甘蔗进行遗传转化地实验，所获数据列表如下：
甘蔗转化效果数据
基因名称 愈伤使用 量(个) 转化时间 筛选抗性 植株数量 检测阳 性植株 数量 筛选效 率 转化效率 转化耗 时 1900GUS 20皿*10个 ＝200个 09.1.17- 09.5.13 44株 40株 90.9％ 20.0％ 116天 1900SST1 25皿*10个 ＝250小 09.8.1- 09.12.15 50株 46株 92.0％ 18.4％ 112天 1900SST2 30皿*10个 ＝300个 09.8.3- 09.12.25 80株 70株 87.5％ 23.3％ 115天 1900SST3 30皿*10个 ＝300个 09.9.4- 09.1.10 82株 75株 91.5％ 25.0％ 125天
*注：筛选效率＝检测阳性植株数量/筛选抗性植株数量
转化效率＝检测阳性植株数量/使用愈伤数量
从以上数据说明，本发明在甘蔗转基因育种领域将甘蔗农杆菌介导法的遗传转化效率提高到20％左右，大大优先于先前的3％；筛选效率达到了90％，转化时间也从原来的半年缩短到4个月左右。
本发明以甘蔗顶端生长点处的幼叶组织作为外植体诱导胚性愈伤组织，作为农杆菌侵染的受体材料，通过先分化培养，后进行高浓度的PPT筛选，获得抗性植株后，采用创新的DNA、RNA微量提取技术，提取抗性苗的DNA/RNA，然后进行PCR、RT-PCR检测，经PCR、RT-PCR检测为阳性的植株再移栽到大棚，待植株长大后再进行其它的分子与生理生化的检测。与已有技术相比，本发明可大幅度提高转化效率，缩短转化的时间，只需4个月就可得到PCR、RT-PCR检测为阳性的转基因植株，也降低了转化成本。
【具体实施方式】
下面结合实施例对本发明进行详细说明。
本发明包括甘蔗胚性愈伤组织的诱导过程，农杆菌的活化及对甘蔗胚性愈伤组织的转化过程，转化后胚性愈伤组织的分化再生及筛选过程，转化小植株DNA、RNA微量提取及PCR与RT-PCR鉴定过程。
下面的实施例为利用本实验室构建好的植物表达载体PCBI1900对甘蔗胚性愈伤组织进行遗传转化。
具体操作过程如下：
1、胚性愈伤组织的诱导
以优良甘蔗栽培品种(ROC22)为转化受体材料，选田间生长健壮植株，取其尾稍部分逐层剥去外部老叶，取其距顶端生长点约10cm左右的幼叶组织作为外植体，先用75％的乙醇浸泡30s后，再用0.1％的升汞处理12min，后用无菌水洗3～4次，用无菌的滤纸吸干水分，再小心剥去最外一层叶片组织，然后将其横切成0.2～0.5mm厚的薄片并接种于诱导培养基上，于25℃黑暗条件下培养20-30天，即可长出胚性愈伤组织，可直接用于转化。
2、农杆菌工程菌液的制备
将经PCR鉴定的农杆菌在含相应抗生素的YEP平板上划线，挑取单菌落接种到活化培养基中，于28℃，200rpm振荡培养至对数生长期(约24h)，再于150mL三角瓶中扩大培养到100mL含有相同抗生素的YEP培养基中，培养至OD为0.3-1.5左右(10h)，将菌液转移到离心管中，4℃，5000rpm离心5min，弃上清，吸干残液，用等体积(100mL)的vir基因诱导培养基重悬菌体，再置于28℃，200rpm振荡培养1-3h，以诱导农杆菌Vir基因的表达，此菌液即为转化用的农杆菌工程菌液。
3、农杆菌菌液浸染甘蔗胚性愈伤组织及共培养
将甘蔗胚性愈伤组织置于准备好的农杆菌工程菌液中浸泡约30-40min，期间用无菌镊子轻轻搅动胚性愈伤组织。之后，用无菌漏勺滤去菌液，然后将胚性愈伤组织转移到滤纸上，在超净工作台中晾干，直至材料表面干爽、无水膜，再把材料组织块切成0.3-0.5cm的小块转接到共培养培养基上，22℃左右黑暗共培养3-4d。共培养后用含Car200mg/L的无菌水洗涤胚性愈伤组织一次，再用无菌水洗2-3次，最后再用MS液体培养基洗一次，置于无菌滤纸上在超净工作台中吹晾到材料干爽后，将胚性愈伤组织转移到含有Car200mg/L的分化培养基上，28℃光下培养。
4、农杆菌浸染后的胚性愈伤组织分化成苗
将接种于分化培养基的胚性愈伤组织置于28℃，1500lux，14h/d光照条件下培养两周即可分化出胚状体，再将胚状体转接到生芽培养基上，继续置于1500lux，14h/d光照条件下培养以产生小芽，两周后将小芽转接到成苗培养基上，于1500lux，14h/d光照条件下培养三周左右使其长成小苗。
5、甘蔗转化小植株的筛选
挑选0.5cm-3cm的小苗转接到抗性培养基上于1500lux，14h/d光照条件下培养三周左右，将抗性小植株单株单瓶按编号培养于壮苗生根培养基上进行抗性植株的生根壮苗培养3周即可长成根系发育良好的抗性植株。
6、抗性植株总DNA的微量提取
按编号用无菌剪刀剪取单株单瓶培养于M4培养基上的抗性植株叶片10-30mg，剪碎直接放入2.0mL离心管中，将离心管置于液氮中冷冻数秒，用玻璃棒将叶片组织捣碎，采用CTAB法微量提取抗性植株的DNA。
7、抗性植株的PCR检测
以植物总DNA为模板，以植物表达载体pCBI 1900插入区域一基因设计引物，以pCBI1900质粒DNA作正对照，以未转化甘蔗的DNA为负对照，PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析并照相，回收PCR产物，并连接到pMD18-T载体上，测序并分析其序列与pCBI1900植物表达载体上该基因序列的同源性。
8、抗性植株的RNA提取
按编号用无菌剪刀剪取经PCR检测为阳性的植株叶片10-30mg，剪碎直接放入2.0mL离心管中(DEPC处理)，立即置于液氮中冷冻数秒后用玻璃棒捣碎，采用Trizo1法提取RNA。
9、抗性植株的RT-PCR检测
以PCR阳性植株的RNA为模板进行RT-PCR检测，引物与抗性植株PCR检测相同，以pCBI 1900质粒DNA作正对照，以未转化甘蔗的DNA为负对照，RT-PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析并照相。
10、转化植株的移栽
将经PCR和RT-PCR检测均为阳性的植株移栽到温室大棚。