一种复合软组织补片的制备方法 【技术领域】
本发明属于生物医用材料的组织工程技术领域，具体涉及一种用于软组织缺损修复的复合组织补片的制备方法。
背景技术
软组织的缺损、薄弱是临床上常见问题，引起的原因有先天缺陷、病理因素及衰老等，临床表现为：疝、瘘、瘢痕及皱纹等。这类软组织的缺损、薄弱通常无法自行修复，极大的影响到相应器官组织的功能及外观。目前临床上主要依靠组织补片充填修复，因此对组织补片的研发已成为现代生物医用材料的热点之一。
组织补片的种类很多，按材质分类有：尼龙补片、聚丙烯补片、膨化聚四氟乙烯补片、生物补片、复合补片等。其中的非生物补片存在有生物相容性较差、不能降解、影响术后生活质量等问题。近年来，进入市场的生物补片多为异体/异种的脱细胞产品及其衍生产品，如：脱细胞人真皮、脱细胞牛真皮等。单纯的脱细胞材料因为在去除细胞的过程中也去除了大量的活性物质，生物活性极大的降低；但通过对脱细胞方法的改进，可有效提高脱细胞材料的生物活性，同时为了进一步改善脱细胞材料的性质，使其具备更好的生物相容性，实现一定的生理功能，复合补片成为研究的重点。
中国专利(200610027044.9)公开了一种人成纤维细胞修饰的异体/异种脱细胞真皮替代物，是将成纤维细胞与脱细胞真皮基质复合培养，使脱细胞真皮表面形成单层或多层人成纤维细胞，改善了脱细胞真皮的亲合性和活力，用作真皮替代物。该方法的不足在于：所制备的真皮替代物，其应用范围仅限于皮肤组织；该真皮替代物含有细胞，在临床应用中容易产生免疫排斥，因此难以应用于体内组织的修复；另外，含细胞的补片制备工艺复杂，生产成本高，质量难以控制，产业化瓶颈尚未突破。
中国专利(200610153403.5)公开了一种具有生物活性剂的外科补片，该补片具有释放抗炎剂、抗血小板剂、抗凝剂、纤维蛋白溶解剂、细胞周期抑制剂和/或抗增殖剂的功能；但其仅限于血管补片，并且只是采用简单的药物涂布方法制备，无法实现药物的持续作用。
经检索，到目前为止尚无一种补片可以完全满足临床应用的要求。
【发明内容】
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种复合软组织补片的制备方法，使所得软组织补片不仅有修补填充的功能，还具有促进细胞增殖及分泌基质的能力，临床表现上生物相容性和组织重建效果更好。
本发明所提供的复合软组织补片制备方法，采用有经脱细胞处理的真皮基质，其特征在于，是将含有人体细胞培养分泌物的缓释微球，混合于凝胶溶液中，再与脱细胞真皮基质在真空条件下复合，经干燥灭菌后得到可用于人体软组织修复的复合软组织补片。所述的脱细胞真皮基质可以来源于异种或是异体，具有天然的三维结构，其孔隙率可达90％以上，有利于细胞长入，是一种性能良好的生物支架材料。所述的人体细胞培养分泌物，为人体细胞在培养过程中分泌的多种活性因子和基质蛋白构成的细胞营养因子；所培养的细胞是根据补片用途需要，可以是人体组织中各类型的细胞；收集这些细胞培养的分泌物，与微球复合成为含细胞培养分泌物的缓释微球；所述的微球可采用甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐、聚乳酸、聚羟基乙酸、或明胶的任一种或几种的混合物制备而成。所制得的组织补片具有更高的生物活性，在植入人体三个月内可缓慢释放细胞培养分泌物促进细胞增殖和基质分泌，促进组织重建，从而达到更好的临床治疗效果。
本发明复合软组织补片制备方法的具体步骤包括：
步骤一、制备脱细胞真皮基质：取健康(人、猪、牛等)哺乳动物的新鲜皮肤，洗净后去除皮下脂肪组织及表皮，保留0.1mm～2mm厚的真皮层皮片，用去离子水分别和无菌PBS溶液清洗，于4℃去离子水浸泡充分溶胀；置于-80℃中冷冻30分钟以上，至组织完全冻透后取出融化，可有效的破坏细胞，使细胞内容物暴露出来，便于下一步的清除，此冻融过程为至少一次；再采用W/V为0.1％～0.3％的胰蛋白酶溶液消化皮片，解除胶原蛋白与其它蛋白间的连接，松散组织，便于抗原蛋白的去除；用含有曲拉通100/200、脱氧胆酸钠或十二烷基硫酸钠的任一种或几种混合的去垢剂溶液清洗皮片，除去大部分的抗原成分，尚留部分小片段核酸；再用40～150U/ml的DNA酶溶液消化，去除残留的DNA，随着温度的增加可适当缩短消化时间；用1M的NaOH溶液消蚀真皮皮片1h，以去除真皮中的病毒，保证所制备真皮基质的使用安全；最后将皮片分别用PBS溶液和纯水洗净，经冷冻干燥、灭菌后，4℃保存备用；所得到的脱细胞真皮基质具有较高的生物活性和生物相容性，其孔隙率在90％以上。
步骤二、制备细胞培养分泌物：收集细胞培养过程中更换下的培养液，细胞培养方法可参考《组织工程学原理与技术》(金岩第四军医大学出版社2004年出版)或是其他已有技术；通过超滤方法浓缩(超滤柱可采用30K孔径)，用去离子水清洗去盐；采用蛋白纯化仪去除牛血清蛋白，余留蛋白成分为含有所需细胞营养因子的细胞培养分泌物，过滤除菌后保存；
步骤三、制备含细胞培养分泌物的缓释微球：参考《生长因子生物控释促进牙周组织再生的实验研究》(陈发明，博士论文)或是其他已有技术，微球材料可采用甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐、聚乳酸、聚羟基乙酸、或明胶的任一种或二种的混合，所制备微球的粒径为10nm～3um，经冻干灭菌后，在无菌条件下用水溶液吸附的方法，使1g微球中含有100～500mg的细胞培养分泌物，经冻干后即得含细胞培养分泌物的缓释微球；
步骤四、制备复合软组织补片：采用胶原、纤维素、海藻酸、透明质酸、或壳聚糖的任一种或任几种混合物为原料，制备W/V为0.2～1.5％的凝胶溶液，在其中加入含细胞培养分泌物的缓释微球，使细胞培养分泌物的终浓度为50～200mg/ml，混匀后均匀覆涂于脱细胞真皮基质表面，在真空条件下使含有细胞培养分泌物微球的凝胶溶液充分渗透到脱细胞真皮的孔隙中，覆涂量为0.5～1ml/cm
2，干燥后即为复合软组织补片。
本发明复合软组织补片的保存与使用：应在0～8℃下保存；使用时将补片裁成所需大小置于无菌容器中，用10～50倍量的生理盐水浸泡5～30min，可用于各种创面的封闭、软组织缺损的修补及薄弱处的增强；补片碎片和裁剪剩余经粉碎后可采用注射方式用于各种细小软组织薄弱或凹陷处的充填。
本发明制备的复合软组织补片保留了脱细胞真皮基质良好的三维结构，为细胞的附着提供了天然的三维空间；由于酶处理、去垢剂清洗及碱处理等方法的联合使用，有效去除了抗原成分，不会引起明显的免疫排斥反应；复合时所采用的凝胶可以促进细胞的长入；缓释微球中携带有大量的细胞生长因子和细胞外基质成分可促进细胞增殖和基质分泌；将缓释微球吸附到脱细胞真皮的孔隙中可有效延长细胞分泌物的释放时间，使细胞分泌物的作用更稳定持久。本发明由于未采用细胞复合培养，使制作更简便、成本更低、质量容易控制、使用更方便。实验表明，与单纯的脱细胞真皮基质相比，本发明补片可有效促进细胞的增殖及基质的分泌，具有更好的生物相容性及更优的组织重建性。本发明补片可广泛用于各种创面的封闭、软组织缺损的修补及薄弱处的增强，也可制成粉末通过注射用于各种细小薄弱或凹陷处的充填，临床上具有更广泛的应用前景。
【具体实施方式】
以下结合具体实例对本发明技术方案作进一步的详细说明。
实施例1、
步骤一、制备脱细胞真皮基质：取健康新鲜的猪皮肤，用取皮鼓去除皮下脂肪组织及表皮，保留0.1mm厚的真皮层，用去离子水洗净，再用无菌PBS溶液清洗，于4℃去离子水浸泡充分溶胀后，置于-80℃中冷冻30分钟以上，至组织完全冻透后取出置于37℃环境融化，反复2次；采用0.1％(W/V)的胰蛋白酶溶液消化皮片1天；随后用0.02％(W/V)曲拉通100/200溶液清洗1天；采用40U/ml的DNA酶溶液37℃消化2小时；用1M的NaOH溶液浸泡真皮皮片1h；分别用PBS溶液和纯水洗净后，经冷冻干燥、灭菌后，于4℃保存备用；通过该方法制备的脱细胞真皮基质孔隙率为91％；
步骤二、制备细胞培养分泌物：参考《组织工程学原理与技术》(金岩第四军医大学出版社2004年出版)进行成纤维细胞培养，收集更换下的培养液；采用超滤方法浓缩，去离子水清洗去盐，超滤柱采用30K孔径；采用蛋白纯化仪(AKTA PRIME)去除牛血清蛋白，余留蛋白成分为所需的人细胞培养分泌物，测分泌物含量(以蛋白总量计)，浓度调至200mg/ml，过滤除菌后保存；
步骤三、制备含细胞培养分泌物的缓释微球：参考《生长因子生物控释促进牙周组织再生的实验研究》(陈发明，博士论文)中的方法制备甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐微球，微球的平均粒径为50～100nm，冻干灭菌后，无菌条件下在1g微球中加入1ml细胞培养分泌物的水溶液，4℃下放置一天，冻干后得含细胞培养分泌物的缓释微球；
步骤四、制备复合软组织补片：在W/V为0.3％的胶原溶液中加入细胞培养分泌物终浓度为80mg/ml的含细胞培养分泌物的缓释微球，混匀后将该凝胶溶液均匀覆涂于脱细胞真皮基质表面，覆涂量为0.6ml/cm
2，真空条件下使其充分渗透到脱细胞真皮的孔隙中，冷冻干燥后即得复合软组织补片。
本例制备的复合软组织补片厚度为0.1～0.15mm，断裂拉伸强度大于0.1Mpa。补片在4℃条件下保存，使用时将补片取出根据需要裁剪成适宜大小置于无菌容器中，加入10～20倍量的生理盐水浸泡10min。该补片可用于人体体内软组织缺损的修复及软组织薄弱的增强，如：疝修复、肿瘤手术后创面的封闭等；其补片碎片和裁剪剩余经粉碎后可用于局部填充，如注射除皱等。
实施例2、
步骤一、制备脱细胞真皮基质：取健康胎牛皮，洗净后手工去除皮下脂肪组织及表皮，保留1mm厚的真皮层，用去离子水洗净，再用无菌PBS溶液清洗，于4℃去离子水浸泡充分溶胀后，置于-80℃中冷冻30分钟以上，至组织完全冻透后取出置于37℃环境融化，反复3次；采用0.25％(W/V)的胰蛋白酶溶液消化2小时，再用0.05％十二烷基硫酸钠溶液清洗8小时；采用80U/ml的DNA酶溶液37℃消化2小时；用1M的NaOH溶液消蚀真皮皮片1h；处理后的真皮分别用PBS溶液和纯水洗净后，经冷冻干燥、灭菌后，于4℃保存备用；通过该方法制备的脱细胞真皮基质孔隙率为93％；
步骤二、制备细胞培养分泌物：参考《中国修复重建外科》(2004年06期)中的大张皮片法与小皮条法培养表皮细胞的比较研究，进行表皮细胞培养，收集更换下的培养液；按实例1进行成纤维细胞培养，收集更换的培养液；采用超滤方法分别浓缩，去离子水清洗去盐，超滤柱采用30K孔径；采用蛋白纯化仪(AKTA PRIME)去除牛血清蛋白，分别得到所需的两种细胞培养分泌物，分别测分泌物含量(以蛋白总量计)，过滤除菌后保存；
步骤三、制备含有细胞培养分泌物的缓释微球：参考《制备复合生长因子的缓释微球并考察其对细胞的影响》(黄沙、金岩等，《上海生物医学工程》杂志2004年第25卷第4期)中明胶微球的制备方法，制备平均粒径为100～500nm的明胶微球，冻干灭菌后，无菌条件下在2g微球中加入含250mg表皮细胞培养分泌物和含100mg成纤维细胞培养分泌物的水溶液，4℃下放置一天，冻干后即得含细胞培养分泌物的缓释微球；
步骤四、制备复合软组织补片：在含有W/V为0.15％透明质酸钠和0.15％胶原的混合凝胶溶液中，加入含细胞培养分泌物的缓释微球，使细胞培养分泌物的终浓度为120mg/ml，混匀后将该凝胶溶液均匀覆涂于脱细胞真皮基质表面，覆涂量为1ml/cm
2，真空条件下使其充分渗透到脱细胞真皮的孔隙中，冻干即得复合软组织补片。
本例制备的复合软组织补片厚度为1～1.2mm，断裂拉伸强度大于0.2Mpa；补片在4℃条件下保存，使用时将补片取出根据需要裁剪成适宜大小置于无菌容器中，加入10～20倍量的生理盐水浸泡15min。该补片适用于人体皮肤创面的封闭，能有效促进难愈性创面、慢性溃疡的愈合。