一种从西洋参中提取人参皂甙Rb1的方法及其粉针剂 【技术领域】
本发明涉及一种从西洋参中提取人参皂甙Rb1的方法及用人参皂甙Rb1制成的用于治疗心脑血管疾病的粉针剂，属于制剂领域。
背景技术
西洋参又称花旗参，为五加科植物西洋参Panax quinquefolium L.的干燥根。原产于美国及加拿大，我国已引种成功，形成规模化生产，称为国产西洋参，西洋参已首次收入中华人民共和国药典2000版一部99页。其性味与归经为甘、微苦，凉，归心、肺、肾经。其功能与主治为补气养阴，清热生津，用于气虚阴亏，内热，咳喘痰血，虚热烦倦，消渴，口燥咽干。西洋参的主要有效单体成分是人参皂甙Rb1。
中国发明专利ZL200310100461.8公开了“西洋参总皂甙提取新工艺及其粉针剂”；中国发明专利CN1072089(申请号92111985)公开了“吸附树脂法提取中药复方有效部分”；《吉林中医药》2006年第07期发表了“西洋参皂苷Rb1分离、纯化工艺的研究”；《天然产物研究与开发》2008年02期发表了“从西洋参中提取分离纯化人参皂苷R_(b1)和人参皂苷R_e的研究”；《河北医学》2001年第九期发表了“大孔吸附树脂法提取西洋参总皂甙工艺探讨”；《中国药学杂志》1997年第10期发表了“西洋参二醇组皂甙注射液的研制及临床研究”。上述专利和文献报道所采用的提取工艺都是常规水提取，包括温水提取，然后用吸附树脂法纯化，耗时、耗能且提取转移率也不高。在从西洋参总皂甙中分离纯化人参皂苷Rb1时，采用的是单用有机溶剂重结晶或硅胶层析单柱分离洗脱的工艺，存在使用大量有机溶剂分离效率低且耗时，影响人参皂苷Rb1的回收率，工业化生产有一定难度。
技术内容
本发明的一个目的是公开一种从西洋参中提取人参皂甙Rb1的方法，该方法可节约能源和时间，减少对环境的污染，使提取物中的人参皂甙Rb1的含量进一步提高，处理量增大，有利于工业化生产。
本发明的另一个目的是公开一种人参皂甙Rb1的粉针剂，该粉针剂质量更为稳定。
本发明所述的从西洋参中提取人参皂甙Rb1的制备方法包括如下步骤：
步骤1.取西洋参粉碎成细粉，用8-12倍的水浸泡，浸泡时间为10-60分钟后，用超声波振荡提取1-3次，每次20-50分钟，滤过，合并滤液；
步骤2.滤液通过大孔吸附树脂柱，吸附完毕用水洗涤至流出液澄清，再用碱性无机盐的水溶液，碱的浓度为0.1-5％，进行洗涤，至洗出液澄清，再用水洗涤至PH为5-7；用20-95％的乙醇洗脱，洗脱剂用量为树脂用量的1-5倍；
步骤3.收集洗脱液，浓缩，干燥，即得西洋参总皂苷提取物；
步骤4.采用模拟移动床色谱工艺从西洋参总皂苷提取物中分离纯化人参皂苷Rb1单体。
所述步骤1中，浸泡所用水的温度为常温。
所述步骤1中，超声波振荡提取的频率为26-80kHz。
所述步骤2中，吸附树脂用量为药材重量比的0.5-3倍；树脂型号为JD-1(WLD)；或D-101、D-201、XAD-4中任一种。
上述制备方法中，碱性无机盐的水溶液可以为氢氧化钠或碳酸钠等无机盐。
所述步骤4中用模拟移动床色谱工艺从西洋参总皂苷提取物中分离纯化人参皂苷Rb1单体的方法为：
A.设备特征：
该系统由洗脱泵、进样泵、萃取泵、流量计、色谱柱、电磁阀、单向阀和可编程逻辑控制器及电脑组成；
洗脱泵流量0-1000ml/min，压力0-10mpa；进样泵流量0-30ml/min，压力0-8mpa；萃取泵流量0-100ml/min，压力0-10mpa；工作温度：20-25℃。
色谱柱填料：填料为反相硅胶ODS，填料粒度30-40um；
B.分离步骤：
①配制样品液：将步骤3所得西洋参总皂苷提取物溶于甲醇中，沉降，0.45μm滤膜过滤，滤液浓度0-10g/ml，备用；
②流动相的配制：V甲醇∶V水＝40-55∶60-45；
③模拟移动床色谱参数：解吸段3根柱，精制段3根柱，吸附段2根柱；进样流速Uf＝3-4ml/min；洗脱泵流速Ud＝50-70ml/min；萃取液流速Ue＝20-40ml/min；残余液流速Ur＝10-12ml/min；切换时间ts＝5-7min。
④浓缩：将模拟移动床流出的残余液用薄膜旋转蒸发器在65℃浓缩至干，用甲醇洗出，真空65℃干燥至恒重，即为模拟移动床制备出的产品；
D.重结晶：将上述产品按1g加正丁醇5ml比例超声溶解，过滤，滤液干燥后得白色粉末，即为纯化了的人参皂苷Rb1单体。
本发明的另一个目的是公开一种用人参皂甙Rb1制备粉针剂的制备方法：
1、喷雾干燥法
取本发明分离的人参皂甙Rb1，在100级以下的车间内加入5-25倍的水，40--90℃搅拌溶解，加入适量水溶性药用辅料，调节PH为5.5-8.5，药液无菌过滤，无菌喷雾干燥，无菌分装，即得；
上述制备方法中，水溶性药用辅料还可以为低分子右旋糖酐、葡萄糖、乳糖、氯化钠、氯化钙等；
2、冷冻干燥法
取本发明分离的人参皂甙Rb1，在100级以下的车间内加入5-25倍的水，40--90℃搅拌溶解，加入适量水溶性药用辅料，调节PH为5.5-8.5，药液无菌过滤，无菌分装，无菌冷冻干燥，熔封，即得；
3、一步干燥法
取本发明分离的人参皂甙Rb1，移入100级以下的车间，加入适量注射用水和辅料，调节好PH值，无菌过滤，喷雾干燥或冷冻干燥，即得；
按上述粉针剂制备方法，将50mg人参皂甙Rb1制成规格为50mg/2ml西林瓶中，或2ml安瓿中，或者100mg人参皂甙Rb1制成规格为100mg/2ml西林瓶中，或2ml安瓿中。
本发明对从西洋参中提取人参皂甙Rb1进行了创新性研究。一是变饮片为细粉，以利于药物的提取；二是变煮沸为常温浸泡，节约了能源，且提高了提取率；三是用超声波振荡提取，大大节约能源，时间和西洋参总皂甙包括人参皂甙Rb1的提取转移率；四是在吸附完毕洗涤柱子时，用了无机洗涤剂，使提取物中总皂甙含量大大提高。五是模拟移动床色谱工艺从西洋参总皂苷提取物中分离纯化人参皂苷Rb1单体，使分离纯化工艺操作简单，处理量增大，耗时减少。本发明粉针剂制剂更为稳定，运输和贮存更为方便。
下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。
实验例1：超声波振荡提取与温水浸泡提取工艺比较
方法1：温水浸泡提取+大孔吸附树脂
取产地吉林5g以下长枝的西洋参，研为粉末，过100目筛，并检测人参皂甙Rb1的含量，各取50g，分别编号为1和2号。取1号粉，用40倍90℃的水浸泡1小时，水浴保温，不时搅拌，静置1小时，滤过。滤液通过1.5倍量大孔吸附树脂(型号：D-101净品型批号：070305产品标准：津Q、HG3790-91天津市海光化工有限公司出品)，吸附完毕后，用水洗至无色，再用0.5％的NaOH溶液洗至无色，并用水洗至中性，再用4倍树脂量的70％乙醇洗脱，洗脱液回收乙醇，浓缩，减压干燥，得西洋参总皂甙提取物1号。
方法2：超声波提取+大孔吸附树脂
另取2号粉，用10倍常温的水浸泡15min后，用超声波(超声波药品处理机《第四代》频率26KHz、47KHz、70KHz济宁金百特电子有限责任公司出品)提取3次，提取频率26KHz，每次30分钟，滤过，合并滤液；滤液通过1.5倍量大孔吸附树脂，吸附完毕后，用水洗至无色，另用0.5％的NaOH溶液洗至无色，并用水洗至中性，最后用4倍树脂量的70％乙醇洗脱，洗脱液回收乙醇，浓缩，减压干燥，得西洋参总皂甙提取物2号。
以上实验重复3次，取3次平均数。经检测人参皂苷Rb1含量(％)，结果见表1。
表1超声波振荡提取与温水浸泡提取工艺比较
本实验将西洋参饮片提取，改为用西洋参经粉碎后的细粉提取，使其接触溶媒的表面积显著提高，西洋参总皂甙，人参皂甙Rb1等活性成分更易溶于溶媒中，以利提高其提取率。更意想不到的是，将煮沸提取或温水浸泡提取的方法改变为常温浸泡后用超声波振荡提取的工艺显著提高了西洋参总皂甙包括人参皂甙Rb1的提取转移率。
实验例2：大孔吸附树脂工艺研究
方法1：取产地吉林5g以下长枝的西洋参，研为粉末，过100目筛，并检测人参皂甙Rb1的含量。各取50g，分别编号为2-1和2-2号。取2-1号粉，用10倍常温的水浸泡15min后，用超声波(超声波药品处理机《第四代》频率26KHz、47KHz、70KHz济宁金百特电子有限责任公司出品，下同)提取3次，提取频率26KHz，每次30分钟，滤过，合并滤液；。滤液通过1.5倍量大孔吸附树脂(型号：D-101净品型批号：070305产品标准：津Q、HG3790-91天津市海光化工有限公司出品，下同)，吸附完毕后，用水洗至无色，再用4倍树脂量的70％乙醇洗脱，洗脱液回收乙醇，浓缩，减压干燥，得西洋参总皂甙提取物2-1号。
方法2：另取2-2号粉，用10倍常温地水浸泡15min后，用超声波提取3次，提取频率26KHz，每次30分钟，滤过，合并滤液；滤液通过1.5倍量大孔吸附树脂，吸附完毕后，用水洗至无色，另用0.5％的NaOH溶液洗至无色，并用水洗至中性，最后用4倍树脂量的70％乙醇洗脱，洗脱液回收乙醇，浓缩，减压干燥，得西洋参总皂甙提取物2-2号。以上实验重复3次，取3次平均数。经检测人参皂苷Rb1含量(％)，结果见表2。
表2用含有碱性的无机盐的水溶液洗涤吸附柱与不洗涤吸附柱的工艺比较
实验例3：模拟移动床色谱工艺从西洋参总皂苷提取物中分离纯化人参皂苷Rb1单体的
在从西洋参总皂甙提取物中分离，纯化人参皂苷Rb1单体的工艺过程中，我们采用的是模拟移动床色谱，真空浓缩蒸干和重结晶工艺来得到人参皂苷Rb1单体的。该工艺具有分离效率高，易工艺放大，洁净环保的优点。
由于模拟移动床系统是一个非线性，非理想的多自由度系统，产品的纯度与收率取决于对这一非线性的多自由度系统的参数优化与选择。以下是对几个重要参数的优化与选择
①流动相配比的选择
表3流动相配比的选择
从表3可见，甲醇体积分数低时，人参皂苷Rb1收率很低，甲醇体积分数高时，分离能力差，当V(甲醇)∶V(水)＝45∶55时人参皂苷Rb1收率最高，故将流动相配比定为45∶55。
②进样中人参皂苷质量浓度的选择
表4进样中人参皂苷质量浓度的选择
从表4可见，进样中人参皂苷质量浓度为0.2g/ml时Rb1收率最高，故将其选择为进样中人参皂苷质量浓度。
③切换时间的选择
表5切换时间的选择
从表5可见，切换时间过短，前杂质冲洗不够，被带入产品中而降低人参皂苷Rb1的纯度。切换时间太长，又会将人参皂苷Rb1带入前杂质中，使流出物中人参皂苷Rb1的纯度降低，后杂质增多。当切换时间为6min时，人参皂苷Rb1的纯度最高，且其收率未受明显影响，故将切换时间选定为6min左右。
④洗脱流速的选择
表6洗脱流速的选择
从表6可见，洗脱流速较低时，快组分冲洗程度不够，产品中带入杂质，影响了人参皂苷Rb1的收率。洗脱流速过大，部分人参皂苷Rb1会从杂质出口流出，使人参皂苷Rb1的收率和纯度都受到影响。当洗脱流速为60ml/min时，人参皂苷Rb1的收率最高，故规定洗脱流速为60ml/min。
下述实施例均能实现上述实验例的效果。
【具体实施方式】
实施例1：人参皂苷Rb1制法
取西洋参粉碎成细粉，用8-12倍的水浸泡，每次浸泡时间为10-20分钟后，用超声波振荡提取1-3次，每次20-50分钟，超声波振荡提取的频率为26-80kHz，滤过，合并滤液，药液通过1.5倍量的大孔吸附树脂柱，型号为JD-1(WLD)，吸附完毕，用水洗涤，另用0.5％的氢氧化钠溶液洗涤，再用水洗涤至中性，用树脂4倍量的70％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，即得西洋参总皂苷提取物。将所得西洋参总皂苷提取物溶于甲醇中，沉降，0.45μm滤膜过滤，滤液浓度0-10g/ml，备用。流动相的配制：V甲醇∶V水＝45∶55。模拟移动床色谱参数：解吸段3根柱，精制段3根柱，吸附段2根柱。进样流速Uf＝3-4ml/min；洗脱泵流速Ud＝50-70ml/min；萃取液流速Ue＝20-40ml/min；残余液流速Ur＝10-12ml/min；切换时间ts＝5-7min；残余液即为模拟移动床色谱的产品。浓缩：将模拟移动床流出的残余液用薄膜旋转蒸发器在65℃浓缩至干，用甲醇洗出，真空65℃干燥至恒重，即为模拟移动床制备出的产品。重结晶：将上述产品按1g加正丁醇5ml比例超声溶解，过滤，滤液干燥后得白色粉末，即为纯化了的人参皂苷Rb1单体。用高效液相色谱仪测定纯度后，备用。
实施例2：人参皂苷Rb1喷雾干燥粉针剂
取人参皂苷Rb1单体提取物在100级以下的车间内加入20倍的水，于60℃搅拌溶解，加入5％低分子右旋糖酐，调节PH为6-7，药液无菌过滤，无菌喷雾干燥，无菌分装于2ml西林瓶中，每支含人参皂苷Rb150mg，即得。
实施例3：人参皂苷Rb1冷冻干燥粉针剂
取人参皂苷Rb1单体在100级以下的车间内加入7倍的水，于60℃搅拌溶解，加入5％低分子右旋糖酐，调节PH为6-7，药液无菌过滤，无菌分装在2ml安瓿内，冷冻干燥，熔封，每支安瓿含人参皂苷Rb150mg，即得。
实施例4：人参皂苷Rb1一步干燥粉针剂
取西洋参粉碎成细粉，用8-12倍的水浸泡，每次浸泡时间为10-20分钟后，用超声波振荡提取1-3次，每次20-50分钟，超声波振荡提取的频率为26-80kHz，滤过，合并滤液，滤液通过药材1.5倍量的大孔吸附树脂柱，型号为JD-1(WLD)，吸附完毕，用水洗涤，继用0.5％的氢氧化钠溶液洗涤，使杂质彻底去除后，用水洗涤至中性，用树脂4倍量的70％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，即得西洋参总皂苷提取物。将所得西洋参总皂苷提取物溶于甲醇中，沉降，0.45μm滤膜过滤，滤液浓度0-10g/ml，备用。流动相的配制：V甲醇∶V水＝45∶55。模拟移动床色谱参数：解吸段3根柱，精制段3根柱，吸附段2根柱。进样流速Uf＝3-4ml/min；洗脱泵流速Ud＝50-70ml/min；萃取液流速Ue＝20-40ml/min；残余液流速Ur＝10-12ml/min；切换时间ts＝5-7min；残余液即为模拟移动床色谱的产品。浓缩：将模拟移动床流出的残余液用薄膜旋转蒸发器在65℃浓缩至干，用甲醇洗出，真空65℃干燥至恒重，即为模拟移动床制备出的产品。重结晶：将上述产品按1g加正丁醇5ml比例超声溶解，过滤，滤液采用冷冻干燥或真空浓缩蒸干工艺所得到的白色粉末，即为纯化了的人参皂苷Rb1单体。用高效液相色谱仪测定纯度后，备用；
将人参皂苷Rb1单体移入100级以下的车间，加入适量注射用水和辅料，调节好PH值，无菌过滤，滤液喷雾干燥，分装于2ml西林瓶内，每支西林瓶含人参皂苷Rb150mg，轧盖，即得；或滤液分装，冷冻干燥，熔封，每支安瓿含人参皂苷Rb150mg，即得。