二价手足口病灭活疫苗 技术领域：
本发明属于一种新型预防用病毒性灭活疫苗。
背景技术：
手足口病(hand-foot-and-mouth disease，HFMD)是一种主要发生于儿童的病毒性皮肤病，多发生于婴幼儿，成人也偶见发生，又名发疹性水泡性口腔炎，具有很强的传染性，常爆发流行，已有数十个国家和地区报告发生和流行。亚太地区HFMD流行伴有较高的死亡率。有报道HFMD感染部分患儿有不同程度的心肌损害。台湾1998～2000年两次爆发HFMD流行，死亡78例。该病以手、足和口腔粘膜疱疹或破溃成溃疡为主要临床症状，并可发生严重的并发症，如并发无菌性脑膜炎、脑炎及瘫痪。目前HFMD极强的传染性越来越被临床医师所重视，且HFMD发生于夏季，易继发皮肤感染，故积极治疗，防止继发感染，切断传播途径、尤其是预防爆发流行显得尤为重要。
与大部分仅由一种病原体引起的传染病(如乙肝、麻疹)不同，手足口病由多种病毒感染引起，但绝大部分都是由科萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A 16，CA16)和肠道病毒71型(Enteroviruse EV71)引起。
本发明的目的就是研制一种可以同时预防CA16和EV71病毒引起的手足口病。
发明内容：
分离手足口病病原体EV71病毒和CA16病毒，经过纯化、灭活、抗原性及免疫原性测定，确定了将二者联合制成灭活疫苗的方法，用于预防手足口病流行。
用反应器、转瓶或细胞工厂培养Vero细胞，成片后感染EV71或者CA16病毒，于35℃培养48-96小时后收获病毒，经0.65-0.22微米滤膜多级过滤、100MW超滤浓缩、Sepharose 6Fast Flow层析、DEAE Sepharose FF层析、1∶2000甲醛于37℃灭活12天，分别制成单价灭活原液；将两种灭活原液以1∶1体积比混合，加入人白保护剂后即为双价手足口病灭活疫苗。
具体实施方式：
1.EV71和CA16病毒均分离自手足口病患者咽试子。
2.病毒分离和疫苗制备用细胞为非洲绿猴肾传代细胞(Vero)，购自美国ATCC。
3.分别制备EV71和CA16的病毒种子批系统：将分离的原始毒种在Vero细胞上传代扩增，制备EV71和CA16病毒主种子批和工作种子批。
4.病毒种子批鉴定：按照2005版《中国药典》二部中生产人用疫苗用毒种的要求对毒种进行全面鉴定，确定无外援因子污染，无菌、无支原体污染，用单抗对两种病毒进行生物学鉴定。对病毒滴度、免疫原性进行检查。
5.建立细胞库：将ATCC购来的原始细胞通过传代扩增，分别冻存主细胞库和工作细胞库。并按照2005版《中国药典》二部中传代细胞作为人用疫苗地细胞基质的质量要求进行全检。
6.复苏工作库细胞并传代扩增至反应器规模或细胞工厂规模或3L细胞培养瓶。
7.细胞成片后(80％成片)，感染工作种子批EV71或CA16病毒，于35-37℃培养48-96小时后收获细胞培养上清液。
8.用0.65-0.22微米滤膜进行多级过滤，去除细胞碎片。
9.用100MW截留分子量的超滤膜进行超滤浓缩50-100倍。
10.用Sepharose 6 Fast Flow进行分子筛层析，收集第一峰。
11.用DEAE-Separose FF进行阴离子交换层析，收集流穿峰。
12.纯化病毒液中加入1∶2000-1∶4000的福尔马林摇匀，置33-37℃作用6-12天。
13.加入稳定剂，即为单价灭活原液。EV71和CA16的单价原液应该分别制备，不可同时在同一批细胞上制备。
14.用微量滴定法测定病毒收获液的病毒滴度，病毒滴度应不低于7.0 CCID50/ml。
15.分别用EV71和CA16单抗包板，用双抗体夹心法测定各工艺步骤的抗原含量。
16.用微量中和试验测定灭活抗原的免疫原性和保护性抗体产生水平。
17.根据抗原测定结果和免疫原性测定结果，将两种单价灭活原液按照一定比例混合，制成半成品。
18.分装成0.5ml/至，即为二价手足口病灭活疫苗。