一种抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白及其基因 本发明涉及抗病菌蛋白及其基因，特别涉及一种抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白及其基因。
培育抗病品种是防治植物病害的根本措施，但传统的杂交育种普遍具有周期长、抗病性及优良的农艺性状难以兼得等缺点，采用基因工程手段向优良作物品种导入外源抗性基因，为抗病育种开辟了新的途径，而达到这一目标的关键是分离有效的目的基因。许多拮抗细菌能够产生抗菌蛋白，抗菌蛋白可以在体外直接杀死或抑制病原菌，如果能分离出抗菌蛋白的编码基因，用基因工程的方法进行抗病育种将是很有价值和意义的。
本发明目的在于提供一种抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白及其基因，即从水稻根际中分离得到一株多粘类芽胞杆菌(Paenibacillus polymyxa)WY110(以下简称WY110)，WY110对水稻的三种主要病原菌——稻瘟病菌、水稻纹枯菌和水稻白叶枯病菌均具有很高的体外拮抗活性，兼具固氮活性，并具有较广的拮抗谱，在温室实验中表现出较好的植株防病效果，具有很好的研究价值和应用前景；从WY110菌株中分离纯化得到一种对稻瘟病菌具有拮抗活性的抗真菌蛋白，并克隆和表达此抗真菌蛋白的编码基因；此编码基因经修饰和重组后，可作为目的基因转入水稻中进行表达，以获得抗稻瘟病的水稻品种，也可将其转入其它水稻附生菌或内生菌中而构建高效生防工程菌。
本发明的实施方案如下：
本发明提供的抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白及其基因，其特征在于：该抗真菌蛋白由多粘类芽胞杆菌(Paenibacillus polymyxa)WY110中分离纯化得到；其编码基因及氨基酸序列为：GCG AAT GTG TTC TGG GAA CCA TTA AGT TAT 30 A N V F W E P L S Y 10TAT AAT CCG AGT ACA TGG CAA AAG GCA GAT 60 Y N P S T W Q K A D 20GGA TAT TCC AAT GGG GAC ATG TTT AAT TGC 90 G Y S N G D M F N C 30ACT TGG CGT GCC AAT AAT GTC AAT TTT ACT 120 T W R A N N V N F T 40AAC GAT GGC AAA ATG AAG CTT AGC TTA ACG 150 N D G K M K L S L T 50AGT TCT GCG TAT AAT AAA TTT GAC GGC GGA 180 S S A Y N K F D G G 60GAG TAT CGT TCG AAG AAT ACT TAC AGA TAC 210 E Y R S K N T Y R Y 70GGC TTA TAC GAG GTC AAC ATG AAG CCT GCG 240 G L Y E V N M K P A 80AAA AAT ACA GGA ATC GTA TCT TCC TTT TTC 270 K N T G I V S S F F 90ACA TAT ACG GGA CCT GCT AAT GGC ACG CAA 300 T Y T G P A N G T Q 100TGG GAT GAA ATA GAT ATT GAA TTT TTA GGA 330 W D E I D I E F L G 110AAA GAC ACA ACA AAA GTG CAA TTT AAC TAT 360 K D T T K V Q F N Y 120TAT ACA AAC GGG ATC GGT GGT CAT GAG AAG 390 Y T N G I G G H E K 130GTT GTC GAT CTG GGT TTT GAT GCA TCA AGT 420 V V D L G F D A S S 140GGC TTC CAC ACC TAT GCA TTC GAT TGG CAG 450 G F H T Y A F D W Q 150CCA GGA TAC ATT AAG TGG TAT GTT GAC GGG 480 P G Y I K W Y V D G 160GTT CTA AAG CAT ACG GCA ACT ACG AAC ATA 510 V L K H T A T T N I 170CCG AAA ACG CCA GGC CAA ATT ATG ATG AAT 540 P K T P G Q I M M N 180TTA TGG AAT GGC ACC GGA GTA GAT AGC TGG 570 L W N G T G V D S W 190TTA GGT CCA TAT AAC GGA GTC AAT CCG TTG 600 L G P Y N G V N P L 200TAC GCC GAA TAT GAC TGG GTA AAA TAT ACG 630 Y A E Y D W V K Y T 210
AGC AAT 636
S N 212
该抗稻瘟病菌地抗真菌蛋白及其基因由636个核苷酸组成，编码由212个氨基酸组成的具有拮抗稻瘟病菌活性的蛋白质；
其进行PCR扩增的引物序列为：
上游引物(22mer)：5′TT GCG AAT GTG TTC TGG GAA CC 3′
下游引物(26mer)：5′TA CTA ATT GCT CGT ATA TTT TAC CCA 3′
使用该抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白的编码基因进行抗稻瘟病水稻转基因应用。
本发明为一种从WY110菌株中分离纯化得到的对稻瘟病菌具有拮抗活性的抗真菌蛋白，并克隆和表达此抗真菌蛋白的编码基因，此编码基因经修饰和重组后，可作为目的基因转入水稻中进行表达，以获得抗稻瘟病的水稻品种，也可将其转入其它水稻附生菌或内生菌中而构建高效生防工程菌，其应用前景广阔。
其制备如下：
将拮抗活性检测后的多粘类芽胞杆菌(Paenibacillus polymyxa)WY110接种于LB液体培养液(胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 0.5％，pH7.0-7.2)中，振荡培养过夜作为种子液，按1％的接种量转接于7升自动发酵罐(BIOFLOH，NBS公司)培养，有效容积5升，30℃，pH7.2，调节通气量和转速使溶氧保持在20％左右，培养18小时；发酵液于4℃ 4000rmp离心15分钟，除去菌体，收集上清液；加硫酸铵于上清液至70％的饱和度，4℃静置过夜；8000rmp 4℃离心20分钟沉淀蛋白，溶于适量10mM的磷酸钠盐缓冲液(PBS，pH8.0)中得到蛋白粗提液；
蛋白粗提液上Sephadex G-25凝胶过滤柱(Φ2.6×40cm)，用10mM的PBS，pH8.0洗脱收集的蛋白组分，每次上样30ml，连续上样洗脱，流速为5ml/min；脱盐后的粗蛋白液上DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱(Φ2.6×20cm)，用10mM的PBS(pH8.0)缓冲液洗脱，流速为4ml/min，收集穿柱部分，收集的样品经SDS-PAGE和抑菌活性检测，合并后用蔗糖包埋，4℃浓缩后上Superdex-75凝胶过滤层析柱(Φ2.6×60cm)，10mM的PBS(pH8.0)洗脱，流速为2ml/min，分部收集；
经SDS-PAGE和抑菌活性检测后，收集目的峰，即为本发明的抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白纯品，低温保存。
上述通过硫酸铵分级沉淀，DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Supersex-75分子筛层析方法从多粘类芽孢杆菌WY110发酵液中分离纯化制备的对稻瘟病菌具有拮抗作用的抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白的拮抗活性，见图1所示，图1为该抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白对稻瘟病的拮抗活性的示意图，其中A为对照，B为粗蛋白，C为纯化的抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白蛋白，D为E.Coli重组表达的抗稻瘟病菌蛋白。
纯化的抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白蛋白经SDS-PAGE后，凝胶置于CAPS缓冲液(含有0.1M 3-cyclohexylamino-1-propanesulfonic acid，10％甲醇，pH11.0)中浸泡2分钟，同时将测序级PVDF膜在无水甲醇中浸泡15秒，再移至CAPS缓冲液中；将SDS-PAGE凝胶上的抗真菌蛋白电转移至PVDF膜上；切下PVDF膜上的抗真菌蛋白带，直接在ABI公司的蛋白序列仪(Applied Biosystems 491Protein Sequencer)上测定N末端部分序列，该抗真菌蛋白的部分氨基酸序列为：H2N-Ala-Asn-Val-Phe-Trp-Glu-Pro-Leu-Ser-Tyr-Tyr-Asn-Pro-Ser-Thr-Trp-Gln-Lys-Ala-Asp-Gly-Tyr-Ser-Asn
采用BLASTP程序(Altschul S F et al，1997)，在网上通过NCBI(美国国家生物技术信息中心，NIH下属机构)Web服务器(网址为http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)的蛋白质序列数据库，根据抗真菌蛋白N-末端部分氨基酸序列进行类似性检索，其与来源于芽孢杆菌的β-1，3-1，4-葡聚糖酶(β-1，3-1，4-glucanase，lichenase，EC3.2.1.73)或β-1，3-1，4-葡聚糖酶前体及重组酶的序列具有相似形；经酶活性检测，该抗真菌蛋白具有β-1，3-1，4-葡聚糖酶，见图3，图3为该抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白的β-1，3-1，4-葡聚糖酶活性的示意图，其中的A为对照，B为抗稻瘟病菌蛋白质的组蛋白，C为纯化的抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白，D为E.Coli重组表达的抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白，这是首次发现β-1，3-1，4-葡聚糖酶具有抗真菌活性。
根据已知的蛋白N末端氨基酸序列及β-1，3-1，4-葡聚糖酶C端保守性序列，并参照国外发表的β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的核苷酸序列(Gosalbes M J，1991)，分别设计了上、下游引物：
上游引物(22mer)：5′TT GCG AAT GTG TTC TGG GAA CC 3′
下游引物(26mer)：5′TA CTA ATT GCT CGT ATA TTT TAC CCA 3′
以多粘类芽胞杆菌Paenibacillus polymyxa WY110总DNA为模板，进行PCR扩增得到0.6kb的特异性片段，与预期大小基本相符，回收此片段；将PCR产物回收纯化后的片段与pMD18-T载体通过TA互补非定向连接，转化大肠杆菌JM109；经筛选得到插有目的基因片段的阳性克隆，以F primer(M13-47)为引物进行核苷酸序列测定：目的基因5’端72个核苷酸序列与抗真菌蛋白N端已知的24个氨基酸序列完全吻合，这证明克隆的基因就是抗真菌蛋白的编码基因，其序列全长636nt，由此得到该抗真菌蛋白的氨基酸系列全长212aa，其编码基因及氨基酸序列为如图2所示。
进一步以其重组质粒DN1A为模板，设计引物时加入两端酶切位点及肠激酶裂解位点，通过PCR扩增引入目的基因中，克隆PCR产物，测序结果表明读框正确；目的基因双酶切后与GST融合蛋白表达载体pGEX3X定向连接，成功构建了融合蛋白表达载体；经诱导表达，超声破菌，提取蛋白，用谷胱甘肽亲和层析柱纯化GST融合蛋白，肠激酶裂解释放出目的蛋白；经Western-blotting检测，此蛋白可与抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白制备的抗体发生特异免疫反应，生物测定表明目的该抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白对稻瘟病菌具有明显抑菌活性，并具有β-1，3-1，4-葡聚糖酶活性，这证明克隆的DNA片段为正确的抗真菌蛋白基因。从生物体(包括植物、昆虫和微生物)内寻找具有拮抗病原菌的蛋白及其基因是获得植物抗病基因工程育种的目的基因的一个手段。几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶可以抑制病原真菌生长并将外源的基因导入植物中以提高植物体内酶的表达水平达到抗病目的。β-1，3-1，4-葡聚糖酶作为葡聚糖苷酶的一种，尚未有抑制真菌生长的报道，本发明首次从多粘类芽胞杆菌(Paenibacilluspolymyxa)WY110中分离纯化出一种对稻瘟病菌具有抑制作用的β-1，3-1，4-葡聚糖酶并克隆到其基因，它将为转基因抗稻瘟病水稻育种提供新的抗病基因。
使用该抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白的编码基因进行抗稻瘟病水稻转基因应用。
附图说明：
图1抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白对稻瘟病菌的拮抗活性示意图：
其中，A为对照，B为粗蛋白，C为纯化的抗稻瘟病菌蛋白，D为E.Coli重组表达的抗稻瘟病菌蛋白；
图2抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白的编码基因及氨基酸序列；
图3抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白的β-1，3-1，4-葡聚糖酶活性示意图：
其中，A为对照，B为粗蛋白，C为纯化的抗稻瘟病菌蛋白，D为E.Coli重组表达的抗稻瘟病菌蛋白。