本发明涉及一个新的、用作为预防猪喘气病的猪肺炎霉形体弱毒疫苗的生产和使用。 猪喘气病（又叫猪地方性肺炎，猪霉形体肺炎）是猪的一种慢性传染病。世界广泛流行，给养猪业造成巨大的经济损失。Whittlestone（1973）报导在英国此病使猪的增长率减少20%，每年大约损失为2，000万美元。Ross（1978）报导此病在美国的感染率为20～47%，计每年损失1.2～2.0亿美元;山本（1979）报导在日本此病感染率估计为50%左右，每年经济损失约300亿日元。
在预防此病的疫苗研究方面，至今尚无应用于生产的商品疫苗。美国Lam.K.M.和Switzer.W.P.（1971）报导，以猪肺炎霉形体培养物浓缩100倍，裂解后加佐剂制成疫苗，先后作4次免疫，接种猪56头，以强毒攻击后，疫苗组保护率为76.8%，对照组攻毒后发病率83.3%，仅见到一次报导，没有推广;英国Goodwin和Whittlestone（1973）报导试用猪肺炎霉形体作抗原，加不同佐剂和不同途径免疫接种猪，未获得预期结果;Goodwine（1973）试制的福尔马林灭能苗，作田间试验，免疫接种猪298头，并用对照猪279头作比较，未见效果;尼日利亚Obegbulem（1975）报导用猪肺炎霉形体的实验性免疫，以皮下和足底途径免疫接种猪11头，以强毒攻击，保护10头，仅一次报导;美国Farrington（1976）以等量花生油或氢氧化铝作佐剂，免疫接种猪36头，花生油佐剂苗获得75%保护率，对照猪89%发病;南斯拉夫Durisic（1975）用浓缩的猪肺炎霉形体的悬浮物，超声波裂解处理与吐温-80及石蜡油制成乳剂，经乳头孔注入乳房内，企图用初乳保护仔猪，未能实用;美国Kishma，M.，和Ross，R.F.（1985）报导用无活性的猪肺炎霉形体和硫酸右旋糖酐免疫接种猪4次，后用有致病性的猪肺炎霉形体经气管攻击，结果没有明显的效力。总之，国外报导猪地方性肺炎疫苗的试验不多，均未达到应用的目的。
我国从40年代末开始零星发生此病，1953年开始大规模流行，后来蔓延全国，国内灭能苗的研究结果，大多数无免疫力，或不能重复。自1959年以来，许多单位都开展了猪气喘病弱毒疫苗的研究，但是，多数未能获得满意的效果。
本发明人以培育安全有效的猪肺炎霉形体弱毒及其生产疫苗的方法为目的，拟用动物传代方法来培育一株弱毒，使之对猪的致病力弱;对猪的免疫力能达到70%左右;该弱毒可以用动物或鸡胚来生产疫苗，并有较宽地制苗代次。
本发明所涉及猪肺炎霉形体弱毒株，是强毒型的猪肺炎霉形体连续在乳兔体内继代，适应了在兔体内繁殖，该弱毒对猪致病力弱，一般不会引起猪发生融合性肺炎，也不引起支气管纤毛脱落;可以用兔和鸡胚来制苗;注苗后的猪不引起同圈未接种猪的同居感染;该弱毒对猪的免疫率达66.6～100%，平均为70%;对猪的免疫期不低于8个月;该弱毒700-840代的传代毒均可以用于制苗;在低温下有适当的保存期，该弱毒被命名为兔化猪肺炎霉形体弱毒株_mycoplasma hyopneumoniae LMh（Lapinized Mycoplasma hyopneumoniae），以下简称LMh，1986年12月11日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，CGMCC 0121。
用本发明人培育的兔化猪肺炎霉形体弱毒LMh制造猪肺炎霉形体弱毒疫苗可以有兔体法和鸡胚法两种制苗方法，所制出的疫苗效果相同。
兔体法制苗：
以LMh冻干毒，经乳兔复壮1～2代的1∶10～1∶20的乳兔肺乳剂作为种子液，以其2毫升接种于健康大兔的胸腔内，于接种后的第4天采集兔肺，并以5%蔗糖脱脂乳制成1∶5的兔肺乳剂，分装后冻干封口、保存。
鸡胚法制苗：
将经乳兔复壮的LMh乳兔肺乳剂再用培养基制成1∶10乳剂，接种于7日龄鸡胚卵黄囊内，每个胚接种0.5毫升，放37℃温箱培育4天后收获。将收获的卵黄囊加5%蔗糖脱脂乳制成5倍的乳剂，再用离心法去掉脂肪层和管底的沉淀物后混合分装冻干。
LMh弱毒株的主要微生物学特性描述如下：
该弱毒霉形体为球形，环形等多种形态，直经约0.5～0.75微米，在霉形体固体培养基上，经37℃培养6～10天，形成为四周薄中心微密，边缘整齐，或呈小颗粒状结构，边缘整齐的大、小菌落，大菌落直径约160微米，小菌落直径约30微米。
LMh弱毒株在大兔体内能产生血凝抗体，先后用LMh的695、717、735、764、781、784、735、813代乳兔肺稀释成不同的浓度，胸腔接种大兔，于接种后20天和30天采血，用间接血凝方法测产生血凝素抗体滴度。据8次测定接果LMh产生血凝素最小剂量为10-5～10-6之间。这个量与LMh对兔的最小感染量10-5（更高未测）接近。而我们用猪肺炎霉形体济南系强毒F54和F60的猪肺稀释成不同浓度接种成兔，用同LMh同样的方法测在兔体内产生血凝抗体滴度。据两次测定结果济南系强毒产生血凝素最小剂量为10-1，明显低于LMh，因此可以将在大兔体内产生血凝抗体做为LMh的一个特性。
该弱毒株的冻干菌种在-75℃冰箱中可存放4年（更长期限待测）。
LMh弱毒株对猪的特性：
1.LMh对猪致病的潜伏期测定：
在LMh培育的继代过程中每5～10代将感染LMh的乳兔肺接种于猪测定有无猪肺炎霉形体，接种后每周透视一次。肺部透视出现阴影，认为发病（有肺炎霉形体存在），由接种之日起至肺部透视出现阴影之日为潜伏期。根据用1∶5～1∶10LMh肺乳剂5毫升剂量接种200头猪统计：1～200代LMh潜伏期几何平均数为19.8天、205～246代为15.5天、600～654代为20天、660～843代为27.9天。而济南株强毒1∶10、5毫升剂量28～80代，发病潜伏期几何平均数为9.7天、81～116代为8.9天。
2.LMh对猪毒力的变化
猪病程的长短和病变的程度是反应LMh毒力变化的指标之一，故在乳兔继代过程中每5～10代左右用猪测定毒力的变化情况，试验猪接种后单间饲养，每周透视一次，由肺部透视出现阴影至阴影消失的间隔时间作为恢复期（病程），根据1∶5～1∶100乳剂5毫升剂量接种猪的试验结果，1～200代不反应头数占1.6%∶205～546代不反应占5.3%∶600～654代不反应的占30.7%∶600～843代不反应的占36.7%。而济南株强毒（中国兽药监察所保存，以下同）对猪100%发病。说明LMh乳兔继代株对猪的毒力已随在乳兔体继代次数的增加而减弱。
3.LMh对猪的免疫原性：
接种含LMh乳兔肺组织的猪，经透视和临床证明恢复后15～30天，连同对照猪，经气管攻击济南株强毒1∶10猪肺乳剂5毫升，接种未发病试验猪于接种后50～70天也攻击上述强毒，攻毒后，每周透视一次，检查肺部病变，有病变者为不保护，病变不典型又难以肯定者为可疑，无病变者为保护，试验结果对照猪126头于4～14天发病，试验猪于25～30天剖杀结合肺部病变判定保护力：1～200代保护率为97.4%;205～546代为80.6%;600～654代为85.3%;660～843代为77.6%。
结果表明LMh对猪的免疫原性随在乳兔继代代数的增加而降低。但600～843代基本稳定在一个水平上。
4，LMh对猪最小免疫量的测定
在乳兔继代过程中，每传10～15代将继代乳兔肺稀释成不同剂量用猪测定免疫原性，根据45次测定结果，200代以前滴度很少达到10-4、5毫升，205～384代上升到10-5、5毫升（更高的滴度未测），460代以后下降，而不太稳定，600～654代下降到10-3以下，660～843代维持在600代以后的水平上。
5.同居感染试验
猪喘气病病原仅存在于呼吸道，通过接触发生感染，因此同居感染，感染试验是检验毒力变化的一种方法，本试验用两种方法进行。
1）将不同代次的试验病猪于发病后加健康猪同圈试验，按期进行透视，如同居猪只发病则认为同居感染，如健康猪经过一定时间仍未发病，用强毒攻击，同居猪发病即认为未发生同居感染，结果证明607代以后不发生同居感染，详见如下结果：
代次 发病猪头数 同居猪头数 同居天数 结果
184，185 3 3 15，21 发生同居感染
604 1 1 41 发生同居感染
607 1 1 63 未发生同居感染
706 3 1 68 未发生同居感染
788 3 2 101 未发生同居感染
2）用787代乳兔肺制成1∶10乳剂、剂量为5毫升，以胸腔接种方法接种3窝猪中的1/2左右的猪只，另1/2的猪只作为不接种的对照，所有试验猪于接种前进行二次（间隔16天）间接血凝试验，接种后31、71、127天采血进行间接血凝测定，结果表明，经127天同居感染猪只的血凝抗体均为阴性，即证明未发生同居感染（见下表），而强毒对照猪经43天就有血凝抗体阳KPTK结果，证明了发生感染，：
接种前间接血凝结果 窝号 组别 接种后间接血凝结果
前24天 前8天 31天 71天 127天
4/4（-） 4/4（-） LMh接种组 3/4（+） 3/4（+） 3/4（＋）
4/4（-） 4/4（-） 同居组 4/4（-） 4/4（-） 4/4（-）
5/5（-） 5/5（-） 2 LMh接种组 5/5（+） 5/5（+） 5/5（＋）
5/5（-） 5/5（-） 同居组 5/5（-） 5/5（-） 5/5（-）
6/6（-） 6/6（-） 3 LMh接种组 6/6（+ 6/6（+） 6/6（＋）
6/6（-） 6/6（-） 同居组 6/6（-） 6/6（-） 6/6（-）
7/7（-） 7/7（-） 4 LMh接种组 7/7（+） 7/7（+） 7/7（＋）
7/7（-） 7/7（-） 同居组 7/7（-） 7/7（-） 7/7（-）
实施例1
接种含不同代次的LMh乳兔肺组织的猪，经透视和临床证明恢复后15～30天，连同对照猪，经气管攻击济南株强毒1∶10稀释猪肺乳剂5毫升，接种未发病试验猪于接种后50～70天也攻击上述强毒，攻毒后，每周透视一次，检查肺部病变，有病变者为不保护，病变不典型又难以肯定者为可疑，无病变者为保护，试验结果对照猪126头于4～14天发病，试验猪于25～30天剖杀结合肺部病变判定保护力：
接种 接种物 病猪的恢复期 攻毒结果 保
护
的浓度 未 30天 30～ 60天 攻毒 保护 可疑 不保 率
代次 5ml/头 发病 内 60天 以上 头数 数 数 数 %
688 1∶10 2 10 1 13 10 3 76.92
744 1∶10 3 1 1 5 4 1 80
780 1∶10 1 5 6 6 100
783 1∶10 5 11 1 1 18 15 83.33
816 1∶15 1 1 2 4 3 1 75
843 1∶10 3 2 5 5 100
实施例2
猪喘气病弱毒冻干大兔疫苗
（1）制造疫苗的弱毒菌株;用本发明人培育的782代LMh种子批菌种经乳兔复壮1-2代作为种子液。
（2）猪喘气病强毒;系中国兽药监察所保存的济南系冻干毒59代，10-5、5毫升，使猪典型发病。攻毒用气管注射10-2，5毫升。
（3）制造疫苗用家兔;为中国兽药监察所健康室自繁自养的大耳白兔，体重1.5至2.5公斤，营养良好。
（4）冻干大兔苗的制造;选体温正常，营养良好的家兔，每只大兔右侧胸腔接种乳兔肺乳剂菌悬液10～20倍稀释2毫升，于第四天无菌采肺，置-20℃冰箱保存，一般在30天内制造疫苗，取大兔肺1份，加保护剂4份（含抑制杂菌药物），经组织捣碎机捣碎3-5分钟，经90目铜网（含1层纱布）过滤，去残渣，收集菌滤液，摇匀分装于安瓶，每瓶5毫升，进行低温真空干燥火焰封口，冻干疫苗置-20℃冰箱保存，同时进行安检、效检，同法制成冻干苗5批。
（5）保护剂含5%蔗糖脱脂牛奶。
（6）冻干大兔疫苗杂菌检验：将以上生产的5批冻干大兔疫苗（8501、8502、8503、8504、8505、）每批抽样3瓶，用生理盐水作5倍稀释，充分溶化后混合，进行杂菌检验，结果5批疫苗含杂菌数均在《规程》允许的范围内。
（7）安检：5批冻干大兔疫苗，每批抽样3瓶，用生理盐水作10倍稀释，充分溶化后混合，每批接种16-18克健康小白鼠3只，每只皮下0.2毫升，观察10天，3/3健活。
（8）效检：5批冻干大兔疫苗，分别用大兔和猪效检。5批大兔疫苗，每批抽样3瓶，用生理盐水作10倍递增稀释，每个稀释度接种大兔2～3只，每只胸腔接种2毫升，于接种后20、30天两次采血分离血清，以微量间接血凝方法测定血清抗体滴度。5批疫苗阳性反应均达到10-、10x++1/3以上。5批冻干大兔疫苗接种猪反应和免疫力测定：5批冻干大兔疫苗，各取3～6瓶用生理盐水作10倍稀释，分别接种健康小猪3～10头，品种为内江、北京黑或丰津北京黑杂，2月龄每头右胸腔接种5毫升，X光胸透和临床观察，于接种后60～111天攻毒，攻毒后第25～30天，剖杀检查肺部出现肉眼可见性肺炎病变。结果8501批苗保护2/3，66.6%;8502批苗保护4/5，80%;8503批苗保护6/7，85.7%;8504批苗保护5/6，83.3%;8505批苗第一次保护1/6，第二次效检保护4/4/，100%。8505批苗第二次效检时，同圈感染的未注射疫苗的健康猪攻毒发病，同品种攻毒对照猪2/2发病。5批大兔冻干疫苗效检用猪共31头，保护22头，保护率70.9%。
实施例3
猪喘气病弱毒冻干鸡胚疫苗：
（1）制造疫苗的弱毒菌种，兔化猪肺炎霉形体（LMh）784代种子批。
（2）鸡胚：中国兽药监察所健康室供应的受精卵，孵化7日龄鸡胚。
（3）家兔：中国兽药监察所建康室供应的大耳白家兔体重1.5-2公斤。
（4）冻干鸡胚疫苗的制造用784代LMh种子批作为种子，用液体培养基作为稀释液制成1∶10乳兔肺菌悬液，经1000r.p.m.离心10分钟，取上清接种于鸡胚卵黄囊内0.5毫升，于接种后第4天收获卵黄囊和卵黄液混合后按照1份鸡胚组织加4份5%蔗糖脱脂牛奶，经捣碎机捣碎5分钟，经80目铜网（含1层纱布）滤过（含抑制杂菌剂）摇匀分装于安瓶内，每瓶装5毫升进行低温真空干燥，真空火焰封口，置-20℃冰箱保存。试冻干了3批（8601、8602、8603）。
（5）杂菌检验：三批冻干疫苗皆阴性。
（6）剩余水份检验：三冻干疫苗剩余水份皆低于3%。
（7）安检：各批疫苗取3瓶作1∶10稀释混合后，接种健康小白鼠（每只体重6～18克）3只，每只皮下0.2毫升，观察10天全部健活。
（8）效检：每批疫苗各取3瓶用生理作10倍稀释，接种健康断奶小猪3头，每头右胸腔注射5毫升。每周X光胸透，皆呈阴性反应，于接种后第67天以猪肺炎霉形体济南株强毒F59代1∶100，5毫升气管注射攻击，攻毒后第28天剖杀检验肺脏，结果三批苗均保护2/3。
实施例4
增重影响试验
用5批冻干大兔苗，先后在北京、浙江两地，选择12窝，2～3.5月龄杂交小猪E134头、4窝2月龄太湖猪29头，根据同窝、体重毛色、营养状况，随机分为2组，其中疫苗组（90头）每头右侧胸腔接种苗（1∶10稀释）5毫升;对照组（83头）不接种苗。两组猪均于接种前称重后回原圈饲养，观察60天，作第二次称重，根据两组猪每头增重数据，进行分组平均数显著性检验，结果5批苗进行了8组试验，接种苗猪与不接种苗猪的增重在60天内无论杂交猪或太湖猪均无显著性差别，P＞0.05。
实施例5
LMh冻干苗接种猪免疫期试验
用8405批苗，加生理盐水作10倍稀释，免疫接种小猪5头，品种为北京黑、丰津苏白杂交种，2月龄，每头胸腔接种5毫升，隔离观察8个月攻毒，于攻毒后第29天，剖杀检查肺部有无肉眼可见性肺炎病变，结果保护5/5，攻毒对照猪1头发病。
实施例5
区域试验;用LMh 782、783代菌种制造的8批冻干大兔疫苗，先后在北京、浙江、福建、广东四省、市的14个猪场，先后共免疫接种不同品种（北京黑、太湖、福建黑、广东大花白、杜洛克、汉普夏、施格、丹麦长白、大约克、内江、丰津、荣昌、金华等土种或纯种猪），不同猪龄（1～3.5月龄的小猪、成年公猪、成年母猪、后备母猪）的猪只4793头，接种后临床观察2-6个月，证明安全，效果良好。
实施例6
冻干大兔疫苗接种猪免疫期;用8405批冻干疫苗，免疫接种断奶小猪5头，隔离观查8个月后强毒攻击，于攻毒后24天剖杀，结果保护5/5，攻毒对照猪1头发病。
实施例7
苗的保存期：4批冻干苗在-18～-20℃可保存10个月左右。
本发明所称的《规程》为中华人民共和国农牧渔业部部标准《兽医生物缺口制造及检验规程》（第五次修订本）