一种能够协同增效抑制肿瘤生长的新型药物组合物.pdf

本发明涉及一种能够协同增强抑制肿瘤作用的新型药物组合物，所述组合物由烯二炔类药物力达霉素及烷基化类化疗药物替莫唑胺组成，研究证明，该药物组合能够协同抑制肿瘤细胞的增殖，协同诱导细胞凋亡，并能协同抑制血管生成，体内试验对人神经胶质瘤U87细胞的裸鼠移植瘤疗效显著，该组合物组分增强了抑制肿瘤的生长及肿瘤组织内的血管生成过程的作用，显示了该组合物的协同抑瘤作用，具有良好的应用前景。

1.  一种能够协同增强抑制肿瘤作用的新型药物组合物，其特征是所述组合物含有烯二炔类药物及烷基化类化疗药物。

2.  权利要求1所述的药物组合物，其特征是该组合物中含有的烯二炔类药物选自力达霉素Lidamycin。

3.  权利要求1所述的药物组合物，其特征是该组合物中含有的烷基化类化疗药物选自替莫唑胺Temozolomide。

4.  权利要求1或2或3所述组合物在制备协同增强抗肿瘤药物中的应用。

一种能够协同增效抑制肿瘤生长的新型药物组合物
技术领域：
本发明涉及一种能够协同增强抑制肿瘤生长的新型药物组合物的应用。
背景技术：
肿瘤是威胁人类健康的多发病和常见病，胶质瘤是成年人最常见原发脑性肿瘤，具有很强的危害性。尽管外科手术和放化疗取得了很大进展，但事实上，仅仅对神经系统肿瘤而言，其中神经胶质瘤患者，近十年来的生存率与生活质量都没有发生明显的改变。目前，用于治疗神经胶质瘤的主要化疗药是以亚硝脲类或烷化剂类为主体药物，但神经胶质瘤对此类药物也存在着药物抗性[N Engl JMed(新英格兰医学)，2005，352(10)：987-996]，临床所用的神经胶质瘤治疗方案多为放化疗结合，且主要化疗药还是以亚硝脲类或烷化剂类为主体的单一或联合用药。这些治疗措施单独使用或与其他化疗药物联合应用均获得了较好的疗效，然而耐药性问题仍然比较突出。因此，寻找新的药物治疗策略十分重要。
替莫唑胺(TMZ)是目前用于治疗恶性神经胶质瘤的有效药物，它能够显著增加患者生存率，临床前及临床实验已经证实TMZ具有较好的抗瘤效果[Neuro Oncol(神经肿瘤学)，2007，9(3)：354-363]，虽然还远没有达到理想的疗效[Tumori(肿瘤)2008，94(5)：674-80]，但TMZ与其他药物联合治疗神经胶质瘤颇有成效并成为临床共识，TMZ与血管生成抑制剂的联合已经被证明能够有效抑制神经胶质瘤的的生长，具有明显的统计学及临床意义[Int JRadiat Oncol Biol Phys(国际放射肿瘤学-生物与物理学分册)，2008，71(5)，1372-1380]。与此同时，TMZ也能增强人神经胶质瘤U87细胞的放射敏感性[ClinCancer Res(临床癌症研究)2008，14(3)：931-938.]。
力达霉素(Lidamycin，LDM)也称C-1027，是从我国湖北省潜江县土壤中分离得到的一株链霉菌(Streptomyces globisporus，菌种保藏号：CGMCC No.0704)产生的烯二炔类抗生素，由110个氨基酸组成的辅基蛋白(MW10.5kDa)和烯二炔结构的发色团(MW843Da)两部分组成，是迄今报道过的对肿瘤细胞杀伤作用最强的大分子肽类抗肿瘤抗生素。LDM对体外培养的癌细胞具有强烈的杀伤作用，比丝裂霉素和阿霉素强10,000倍以上[Cancer Chemother Pharmacol(癌症化疗与药理学)，1990；27(1)：41-46，J Antibiot(抗生素杂志)，1988；41(11)：1575-1579]，动物体内实验表明，LDM对多种肿瘤有较好的疗效[中国抗生素杂志，1994；19(2)：164-168]。
TMZ与其他药物联合治疗神经胶质瘤，是解决当前神经胶质瘤治疗所遇难题的重要措施。本发明所述利用新型药物组合物TMZ/LDM协同增效作用提高肿瘤治疗效果的研究，迄今为止尚未见有国内外的相关报道。该组合药物在体外对肿瘤细胞有强烈的杀伤作用及诱导凋亡的作用，并对肿瘤血管生成模型有增效抑制作用，体内试验对人肿瘤裸鼠移植瘤疗效显著，能显著抑制肿瘤的生长，增强了体内肿瘤细胞的凋亡，并对体内的血管生成有明显的协同抑制作用。
本发明的目的是提供一种以LDM与TMZ为组合药物，通过协同增效作用，达到提高肿瘤治疗效果的新手段。
发明内容：
本发明提供了一种能够协同抑制肿瘤生长的新的药物组合物TMZ/LDM。
本发明提供了新型药物组合物TMZ/LDM的系列生物学实验研究，包括：
LDM与TMZ联合应用对大鼠神经胶质瘤C6细胞和人神经胶质瘤U87细胞增殖的协同抑制作用；
LDM与TMZ联合应用对大鼠神经胶质瘤C6细胞和人神经胶质瘤U87细胞凋亡的协同增效作用；
LDM与TMZ联合应用对大鼠脑微血管内皮细胞小管形成能力的协同抑制作用；
LDM与TMZ联合应用对大鼠动脉环发芽的协同抑制作用；
LDM与TMZ联合应用对大鼠神经胶质瘤C6细胞和人神经胶质瘤U87细胞VEGF信号通路的协同下调作用；
LDM与TMZ联合应用对人神经胶质瘤U87裸鼠移植瘤模型的治疗作用等。
上述生物学实验研究结果表明，本发明提供的LDM/TMZ组合药，由于是以DNA断裂为作用机制的LDM和以DNA甲基化为作用机制的TMZ联合应用，其效果明显优于单独使用上述组合物的每个组分，从而具有良好的抑制肿瘤生长的作用。
附图说明：
图1.LDM与TMZ联合对大鼠神经胶质瘤C6细胞增殖的效果
其中：TMZ(60μmol/L)+LDM；TMZ(90μmol/L)+LDM；TMZ(120μmol/L)+LDM；TMZ(150μmol/L)+LDM；---联合指数＝1。
图2.LDM与TMZ联合对人神经胶质瘤U87细胞增殖的协同抑制效果
其中：TMZ(60μmol/L)+LDM；TMZ(90μmol/L)+LDM；TMZ(120μmol/L)+LDM；TMZ(150μmol/L)+LDM；---联合指数＝1。
图3.LDM与TMZ及联合处理对大鼠神经胶质瘤C6细胞凋亡的作用
其中：A-对照组；B-TMZ(300μmol/L)组；C-LDM(0.1nmol/L)组；D-TMZ(300μmol/L)+LDM(0.1nmol/L)组。
图4.对照组大鼠神经胶质瘤C6细胞与经过药物处理72小时后的大鼠神经胶质瘤C6细胞凋亡率
其中：A-对照组；B-TMZ(300μmol/L)组；C-LDM(0.1nmol/L)组；D-TMZ(300μmol/L)+LDM(0.1nmol/L)组；^***P＜0.001，TMZ vs TMZ+LDM；##P＜0.01，LDM vs TMZ+LDM.。
图5.LDM与TMZ及联合处理对人神经胶质瘤U87细胞凋亡的作用
其中：A-对照组；B-TMZ(210μmol/L)组；C-LDM(0.05nmol/L)组；D-TMZ(210μmol/L)+LDM(0.05nmol/L)组。
图6.对照组人神经胶质瘤U87细胞与经过药物(LDM，TMZ，LDM+TMZ)处理72小时后的人神经胶质瘤U87细胞凋亡率
其中：A-对照组；B-TMZ(210μmol/L)组；C-LDM(0.05nmol/L)组；D-TMZ(210μmol/L)+LDM(0.05nmol/L)组；^***，P＜0.001，TMZ vs TMZ+LDM；###P＜0.001，LDM vs TMZ+LDM。
图7.LDM与TMZ联合对大鼠脑微血管内皮细胞小管形成能力抑制作用
其中：A-对照组；B-TMZ(200μmol/L)组；C-LDM(0.1nmol/L)组；D-TMZ(200μmol/L)+LDM(0.1 nmol/L)组。
图8.LDM与TMZ联合对大鼠脑微血管内皮细胞小管形成能力的协同抑制作用
其中：A-对照组；B-TMZ(200μmol/L)组；C-LDM(0.1nmol/L)组；D-TMZ(200μmol/L)+LDM(0.1nmol/L)组；^***P＜0.001 vs.TMZ；###P＜0.001 vs LDM。
图9.LDM与TMZ联合对大鼠主主动脉环发芽能力的联合抑制作用
其中：A-对照组；B-TMZ(300μmol/L)组；C-LDM(0.05nmol/L)组；D-TMZ(300μmol/L)+LDM(0.05nmol/L)组。
图10.LDM与TMZ联合对大鼠主动脉环发芽能力的协同抑制作用
其中：A-对照组；B-TMZ(300μmol/L)组；C-LDM(0.05nmol/L)组；D-TMZ(300μmol/L)+LDM(0.05nmol/L)组；^***P＜0.001 vs.TMZ；###P＜0.001vs LDM。
图11.LDM与TMZ联合对C6细胞VEGF信号通路和凋亡通路的调节
其中：A-LDM(0.1nmol/L)；B-TMZ(300μmol/L)；1-C6条件培养基中VEGF；2-C6细胞裂解物VEGF；3-C6细胞裂解物Actin；4-P53；5-Bax；6-procaspase 3；7-Bcl-2；8-Actin；9-p-c-raf；10-c-raf；11-COX2；12-VEGF；13-Actin。
图12.LDM与TMZ联合对U87细胞VEGF信号通路和凋亡通路调节
其中：A-LDM(0.01nmol/L)；B-TMZ(210μmol/L)；1-P53；2-Bax；3-procaspase 3；4-Bcl-2；5-Actin；6-p-c-raf；7-c-raf；8-COX2；9-VEGF；10-Actin。
图13.LDM，TMZ及LDM联合TMZ对人神经胶质瘤U87裸鼠移植瘤生长的影响
其中：对照组；TMZ(0.5mg/kg)；LDM(0.025mg/kg)；LDM(0.05mg/kg)；TMZ(0.5mg/kg)+LDM(0.025mg/kg)；TMZ(0.5mg/kg)+LDM(0.05mg/kg)。
图14.LDM与TMZ联合对人神经胶质瘤U87裸鼠移植瘤瘤重的协同抑制作用
其中：A-对照组；B-TMZ(0.5mg/kg)组；C-LDM(0.025mg/kg)组；D-LDM(0.05mg/kg)组；E-TMZ(0.5mg/kg)+LDM(0.025mg/kg)组；F-TMZ(0.5mg/kg)+LDM(0.05mg/kg)组；+P＜0.05；++P＜0.01，和对照组比较；^***P＜0.001，和TMZ组比较；##和###，分别代表P＜0.01和P＜0.001，和LDM组比较。
图15.LDM和TMZ及二者联合对裸鼠体内U87移植瘤微血管密度的影响(×200倍)
其中：A-对照组；B-TMZ(0.5mg/kg)组；C-LDM(0.025mg/kg)组；D-TMZ(0.5mg/kg)+LDM(0.025mg/kg)组；E-LDM(0.05mg/kg)组；F-TMZ(0.5mg/kg)+LDM(0.05mg/kg)组；红色荧光-CD31阳性区域；蓝色荧光-DAPI染色区。
图16.LDM与TMZ联合对人神经胶质瘤U87裸鼠移植瘤微血管密度的协同抑制作用
其中：A-对照组；B-TMZ(0.5mg/kg)组；C-LDM(0.025mg/kg)组；D-LDM(0.05mg/kg)组；E-TMZ(0.5mg/kg)+LDM(0.025mg/kg)组；F-TMZ(0.5mg/kg)+LDM(0.05mg/kg)组；^***、###P＜0.001。
图17.LDM和TMZ及二者联合对裸鼠体内U87移植瘤VEGF表达的影响(×200倍)
其中：A-对照组；B-TMZ(0.5mg/kg)组；C-LDM(0.025mg/kg)组；D-TMZ(0.5mg/kg)+LDM(0.025mg/kg)组；E-LDM(0.05mg/kg)组；F-TMZ(0.5mg/kg)+LDM(0.05mg/kg)组；红色荧光-VEGF阳性区域；蓝色荧光-DAPI染色区。
图18.LDM与TMZ联合对人神经胶质瘤U87裸鼠移植瘤组织VEGF表达的协同抑制作用
其中：A-对照组；B-TMZ(0.5mg/kg)组；C-LDM(0.025mg/kg)组；D-LDM(0.05mg/kg)组；E-TMZ(0.5mg/kg)+LDM(0.025mg/kg)组；F-TMZ(0.5mg/kg)+LDM(0.05mg/kg)组；^***，###P＜0.001。
实施方式：
本发明所提供的实施例，仅为帮助本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
<实施例1>LDM与TMZ联合应用对大鼠神经胶质瘤C6细胞和人神经胶质瘤U87细胞增殖的协同抑制作用
采用MTT法对两药的细胞毒作用进行检测，操作如下：
1).取对数生长期细胞，消化计数后以1×10³个/孔(C6细胞)，1.5×10³个/孔(U87细胞)或2×10³个/孔(rCMEC细胞)的密度接种细胞于96孔细胞培养板中，每组至少3个平行孔。
2).24h后加入不同浓度的药物处理。
3).72h后加入用PBS缓冲液配制的5mg/ml MTT溶液，每孔加入20μl，37℃温育4h。
4).吸出上清液，加入150μl DMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。
5).用酶标仪在570nm处测定每个孔的吸光度(A)。
6).存活率计算方法是：将各测试孔的A值减去本底A值(完全培养基加MTT，无细胞)，各平行孔的A值取平均数。细胞的存活率以T/C(％)表示，T为加药组细胞的A值，C为对照组细胞的A值。细胞存活率％＝(加药组细胞A值-本底A值)/(对照组细胞的A值-本底A值)×100％。
7).联合指数计算公式为：CI＝(C_Comb)/(V_LDM×V_TMz)，V_Comb为两药联合作用组的T/C比值，V_LDM、V_TMZ是药物单独作用组的存活分数T/C比值，T/C是指给药组与对照组的观察值比值。
结果表明：LDM(10^-10mol/L，10^-11mol/L，10^-12mol/L，10^-13mol/L，10^-14mol/L)与TMZ(90μmol/L，120μmol/L，150μmol/L)联合作用有明显的联合抑制大鼠神经胶质瘤C6细胞增殖的作用，LDM(10^-10mol/L，10^-11mol/L，10^-12mol/L，10^-13mol/L，10^-14mol/L)与TMZ(60μmol/L)的联合作用不明显(图1)。LDM(10^-10mol/L，10^-11mol/L，10^-12mol/L，10^-13mol/L，10^-14mol/L)与TMZ(60μmol/L，90μmol/L)联合作用有明显的联合抑制人神经胶质瘤U87细胞增殖的作用，LDM(10^-10mol/L，10^-11mol/L，10^-12mol/L，10^-13mol/L，10^-14mol/L)与TMZ(120μmol/L，150μmol/L)联合存在协同作用，结果显示如图(图2)
<实施例2>LDM与TMZ联合应用对大鼠神经胶质瘤C6细胞和人神经胶质瘤U87细胞凋亡的协同增效作用
采用Annexin V-FITC/PI(异硫氰酸荧光素标记的五型膜联蛋白/碘化丙啶)法检测药物联合应用对细胞凋亡的作用。操作如下：
1)接种细胞：以10×10⁴个/孔(C6细胞)，15×10⁴个/孔(U87细胞)或20×10⁴个/孔(rCMEC细胞)的密度接种细胞于6孔细胞培养板中。
2)37℃环境5％CO2浓度的培养箱中培养24h。
3)药物处理细胞，大鼠脑微血管内皮细胞和大鼠神经胶质瘤C6细胞分别以LDM 0.1nmol/L和TMZ 300μmol/L及二者联合处理；人神经胶质瘤U87细胞分别以LDM 0.05nmol/L和TMZ 210μmol/L或二者联合处理。
4)37℃环境5％CO2浓度的培养箱中继续培养72h。
5)收集细胞，PBS洗2-3次。
6)1000rpm 4℃离心10min
7)弃上清，细胞重悬于150μl Binding Buffer(结合缓冲液)中。
8)加入10μl Annexin V-FITC和5μl PI，轻轻混匀。
9)避光室温反应15min或4℃反应30min。
10)再加入150μl Binding Buffer，进行流式细胞仪测定。
结果表明：以LDM(0.1nmol/L)、TMZ(300μmol/L)及LDM(0.1nmol/L)+TMZ(300μmol/L)联合处理大鼠神经胶质瘤C6细胞72h后，TMZ+LDM组的凋亡比率要比对照组和两单药处理组要高，0.1nmol/L LDM、300μmol/L TMZ和0.1nmol/L LDM+300μmol/L TMZ作用于大鼠神经胶质瘤C6细胞的凋亡率分别为29.64％±2.65％，25.90％±2.35％，55.99％±5.38％，与对照组相比(5.03％±0.78％)，均存在明显差异，P值均＜0.001(图3，图4)。以LDM(0.05nmol/L)、TMZ(210μmol/L)及二者联合处理人神经胶质瘤U87细胞72h后，TMZ+LDM组的凋亡比率要比对照组和两单药处理组要高。其中0.05nmol/LLDM、210μmol/L TMZ和0.1nmol/L LDM+300μmol/L TMZ作用于人的神经胶质瘤U87细胞的凋亡率分别为43.13％±2.38％，43.80％±4.56％，80.91％±3.68％，与对照组相比(3.20％±0.63％)，均存在明显差异，P值均＜0.001(图5，图6)。
<实施例3>LDM与TMZ联合应用对大鼠脑微血管内皮细胞小管形成能力的协同抑制作用
采用小管形成(Tube formation)实验检测药物联合应用对血管生成的作用。操作如下：
1)预先冷却加样枪头和96孔培养板。
2)在冰台上操作，加入50μl的Matrigel胶，置于37℃预凝固30min。
3)收集取2～3代生长状况良好的细胞，用胰酶消化后离心并计数。
4)取加入180μl培养液(含10％普通胎牛血清)稀释的2×10⁴个/孔的细胞。
5)用不同的药物组合进行处理(LDM：0.1nmol/L，TMZ：200μmol/L，及LDM 0.1nmol/L+TMZ 200μmol/L)。
6)置培养箱中16h，待管腔样结构形成。
7)于倒置显微镜下×200倍照相，并计算管腔样结构的数目。
结果表明：LDM与TMZ联合可显著抑制大鼠脑微血管内皮细胞形成小管的能力，联合处理组小管形成数(14.83±1.47)与TMZ组(11.67±1.63)和LDM组(8±1.41)比较(表1)，均存在显著性差异，P值均＜0.001(图7，图8)。二者联合指数为0.86(表2)。
<实施例4>LDM与TMZ联合应用对大鼠动脉环发芽的协同抑制作用
采用大鼠动脉环实验(rat aortic ring)实验检测药物联合应用对血管生成的作用。操作如下：
1)将鼠尾胶原加入适量的NaOH和DMEM/F12(杜比克改良的伊格氏培养基/汉姆斯营养液)形成鼠尾胶工作液(0.1ml NaOH+10mlDMEM/F12+1ml鼠尾胶)。
2)在冰台上于48孔中加入250μl鼠尾胶原工作液，置于37℃预凝固1～2h。
3)取250g左右的大鼠1只，脱颈处死，
4)将大鼠置于75％的酒精中，消毒10～15min。
5)从腹正中线剖开大鼠胸腔与腹腔，显露出腹主动脉的位置。
6)尽可能长的剪取大鼠胸主动脉，注意无菌操作。
7)将所剪取大鼠胸主动脉置于无菌的PBS缓冲液中冲洗干净。
8)于立体显微镜下用眼科镊子与眼科剪细致剥离外围的结缔组织。
9)将所剩余的薄膜状内皮管腔结构于DMEM/F12无血清培养基冲洗干净，然后置于一新的含有抗生素的无血清DMEM/F12培养基中。
10)于软木板上放置无菌锡箔纸，将动脉放置于其上，并用书钉固定一端。
11)用刀片将主动脉切割成1mm左右的环，并将主动脉环置于已凝固好的鼠尾胶中，放置平稳。
12)再另加100μl鼠尾胶工作液覆盖动脉环。
13)37℃培养箱中放置30min。
14)待胶凝固后，轻轻加入0.25ml含有20％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM/F12培养基。
15)37℃放置培养48h，以平衡大鼠动脉环所受的损伤。
16)吸除培养液，更换为含有抗生素的无血清DMEM/F12培养基。
17)加入相应的药物处理(LDM 0.1nmol/L，TMZ 200μmol/L及二者联合)。
18)于37℃和5％的CO₂培养箱中培养7天。
19)于倒置显微镜下×40倍照相。
20)用Qwin pro3.0软件进行处理图片
21)计算内皮细胞铺展的面积。
结果表明：LDM与TMZ联合可显著抑制大鼠动脉环内皮细胞发芽的能力，联合处理组内皮细胞铺展的相对面积(959.67±111.36)与TMZ组(2120.33±205.16)和LDM组(3186.83±381.07)比较(表1)，均存在显著性差异，P值均＜0.001(图9，图10)。二者联合指数为0.8(表2)。
表1LDM与TMZ联合对内皮小管形成和大鼠动脉环的影响

注：^***，P＜0.001，与LDM组相比；##和###，分别与TMZ组比较，P＜0.01和P＜0.001。
表2LDM与TMZ联合对内皮小管形成和大鼠动脉环联合抑制效果评价

注：aF，Fraction(抑制分数)＝(实验组平均值)/(对照组平均值).
bExpected F(期望抑制分数)＝(LDM处理的F值)×(TMZ处理的F值).
cCI(Combine Index，联合指数)＝测量值F/期望值F，CI＜1表示协同，CI＝1表示相加，CI＞1表示拮抗
<实施例5>LDM与TMZ联合应用对大鼠神经胶质瘤C6细胞和人神经胶质瘤U87细胞VEGF信号通路的协同下调作用
1)取对数生长期生长状况良好的C6和U87细胞，消化后离心，将细胞接种于新的培养瓶中。
2)37℃和5％的CO2培养箱中培养24h。加入不同浓度的药物处理细胞。
3)72h后，收集培养液，于1000rpm离心收集培养液细胞。
4)弃掉培养基，加入150μl新鲜配制的细胞裂解液(RIPA裂解液：50mmol/LTris-HCl，pH 7.5；1％NP-40；150mmol/L NaCl；1mg/ml aprotinin(抑酞酶)；1mg/ml leupeptin(亮肽素)；1mmol/L Na₃VO₄；1mmol/LNaF)，充分混匀。4℃裂解，离心测定蛋白含量。
5)取各样品30μg，加5×上样缓冲液煮沸，加入分离胶为12％的SDS-PAGE中进行电电泳。
6)电泳完毕后，以半干法将蛋白转印至安PVDF膜上，
7)用含1％BSA的TBS-T溶液室温振摇封闭2h，将膜装入杂交袋中，用含1％BSA的TBS-T溶液稀释第一抗体，4℃过夜。
8)TBS-T室温清洗后，与辣根过氧化物酶标记的二抗室温振摇孵育3h。TBS-T室温润洗5次，每次5min。将化学发光剂和增强剂按1∶1混合后，滴加到PVDF膜上，通过化学发光成像系统ChemiImager 5500(AlphaInnotech)捕获图像。
结果表明：LDM与TMZ联合可以明显增强了对C6细胞和U87细胞VEGF表达的抑制，与VEGF信号通路相关的c-raf活性、COX2(环氧化酶2)的表达也受到明显的协同抑制。同时也激活了P53凋亡信号通路，明显上调了P53的表达，procaspase3(半胱天冬酶-3酶原)及Bcl-2(B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白)也明显受到抑制(图11，图12)。
<实施例6>LDM与TMZ联合应用对人神经胶质瘤U87裸鼠移植瘤模型的治疗作用
1)取体重为18-22g的BALB/c裸鼠2只，将人神经胶质瘤U87细胞接种于裸鼠腋窝皮下，每只接种5×10⁷个细胞。
2)待瘤块长至足够大小时，将其在无菌生理盐水中剪成1～2mm³的小块，用套管针将肿瘤分别移植到36只体重为18-22g的雌性BALB/c裸鼠右腋窝皮下，用火胶棉将切口粘住。
3)待瘤块长至100～150mm³大小时，将裸鼠按照瘤块大小、体重分6组，使各组瘤块大小和体重平均值接近，每组6只裸鼠。
4)实验分组为对照组(n＝6)、TMZ 0.5mg/kg组、LDM 0.025mg/kg组、LDM0.05mg/kg组、TMZ 0.5mg/kg+LDM 0.025mg/kg组和TMZ 0.5mg/kg+LDM 0.05mg/kg组。
5)瘤块接种后第7天和第14天尾静脉注射LDM，TMZ分别于第7天和第14天经腹腔注射2个周期，每个周期注射6次。
6)实验期间每3天测量一次肿瘤直径和体重，根据公式V＝ab²/2计算肿瘤体积(a：肿瘤长径，b：肿瘤短径)，绘制肿瘤生长曲线(图13)计算抑瘤率，观察体重变化(表3)。实验第30天处死动物，分离肿瘤称重，作图(图14)并计算抑瘤率(表3)。
7)将剥取的肿瘤组织冻存于液氮中，然后于冰冻切片机切成6μM的薄片，用冷丙酮固定5min后于-20℃保存。
8)将保存的冰冻切片进行CD31和VEGF的免疫组织化学分析。
实验结果表明，各实验组动物的体重没有受到明显的影响，LDM与TMZ联合对人神经胶质瘤U87细胞裸鼠癌移植瘤有显著的协同抑制作用，LDM0.025mg/kg和0.05mg/kg组的抑瘤率分别为37.1％和61％，与对照组相比具有显著性差异(图14，表3)。TMZ单独用药也具有明显的抑制肿瘤生长作用，抑瘤率分别为33.8％(图14，表3)，与对照相比具有明显差异，当与LDM 0.025mg/kg和LDM 0.05mg/kg联合应用可明显增强肿瘤抑制效果，TMZ 0.5mg/kg+LDM0.025mg/kg和TMZ 0.5mg/kg+LDM 0.05mg/kg组的抑瘤率分别为65.3％和80.4％，与两药相应的单独用药组相比，存在明显差异(图14，表3)，TMZ 0.5mg/kg与LDM 0.025mg/kg的联合指数为0.83，TMZ 0.5mg/kg与LDM 0.05mg/kg的联合指数为0.77(表4)。对肿瘤组织微血管密度分析结果表明，LDM与TMZ联合对人神经胶质瘤U87裸鼠移植瘤的血管生成有协同抑制作用，LDM治疗组(0.025mg/kg和0.025mg/kg)中CD31阳性细胞数与对照组相比较明显减少，当与TMZ(0.5mg/kg)联合治疗时，两个联合组的CD31阳性细胞明显比单独用药组要少，结果显示，二者联合对神经胶质瘤微血管密度存在协同抑制作用(图15)。对各药物处理后的微血管密度进行统计处理后可得知，TMZ(0.5mg/kg)+LDM(0.025mg/kg)微血管密度(17.83±3.49)和TMZ(0.5mg/kg)+LDM(0.05mg/kg)组微血管密度(9.16±1.94)与TMZ(0.5mg/kg)组微血管密度(52.17±6.49)进行比较，P值均小于0.001，存在着显著性差异，TMZ+LDM(0.025mg/kg)组与LDM(0.025mg/kg)的微血管密度(46.67±5.32)进行比较，P值小于0.001(图16)，也存在着明显的差异；TMZ+LDM(0.05mg/kg)组与LDM(0.05mg/kg)的微血管密度(20.17±3.06)进行比较，同样存在着明显的差异，P值小于0.001(图16)，TMZ(0.5mg/kg)与LDM(0.025mg/kg)及LDM(0.05mg/kg)的联合指数分别为0.53和0.65(表4)。对肿瘤组织进行VEGF的免疫组化染色，结果显示，LDM治疗组(0.025mg/kg和0.025mg/kg)中VEGF阳性细胞数与对照组相比较明显减少，当与TMZ联合治疗时，两个联合组的VEGF阳性细胞明显比单独用药组要少，结果显示，二者联合对神经胶质瘤VEGF的表达存在协同抑制作用(图17)。对药物处理后各组的VEGF表达进行统计处理，TMZ+LDM(0.025mg/kg)组的VEGF表达率(21.16％±3.05％)和TMZ+LDM(0.05mg/kg)组VEGF表达率(6.51％±1.91％)与TMZ(0.5mg/kg)组VEGF表达率(40.93％±7.25％)进行比较，存在着显著性差异，P值均小于0.001(图18)，TMZ+LDM(0.025mg/kg)组与LDM(0.025mg/kg)的VEGF表达率(33.68％±3.58％)进行比较，也存在着明显的差异，P值小于0.001(图18)；TMZ+LDM(0.05mg/kg)组与LDM(0.05mg/kg)的VEGF表达率(23.07％±4.79％)进行比较，同样存在着明显的差异，P值小于0.001(图18)，TMZ(0.5mg/kg)与LDM(0.025mg/kg)及LDM(0.05mg/kg)的联合指数分别为0.93和0.42(表4)。
表3.LDM与TMZ联合对人神经胶质瘤U87细胞裸鼠移植瘤的生长抑制


注：+与对照相比，P＜0.05，++与对照相比，P＜0.01，^***与TMZ相比，P＜0.001，##与LDM相比，P＜0.01，###与LDM组相比，P＜0.001
表4LDM与TMZ联合抑制肿瘤生长的体内协同指数

注：aF，Fraction＝(实验组平均值)/(对照组平均值).
b预期F值＝(LDMF值)×(TMZF值)
cCI，联合指数＝实测F值/预期F值
CI＜1表示协同，CI＝1表示相加，CI＞1表示拮抗