治疗人肿瘤细胞药替莫唑胺的增效方法 背景技术
已发现替莫唑胺，即8-氨基甲酰基-3-甲基咪唑并[5，1-d]-1，2，3，5-四嗪-4-(3H)-酮，(CCRG81045，NSC362856)有很好的抗肿瘤特性，见Newlands等，Br.J.Cancer，65：287(1992)。临床上，替莫唑胺对星形细胞瘤、神经胶质瘤、恶性黑素瘤及蕈样真菌病都有治疗作用。其重复剂量给药方案效果最佳。
甲基化O6-烷基鸟嘌呤[例如，通过与MTIC(有活性的甲基化替莫唑胺类化合物)反应得到的]，被蛋白O6-烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶(ATase)修复。以甲基化试剂(例如：Zlotogoski等，Carcinogenesis，5：83，1984；Gibson等，Cancer Res.，46：4995 1986)，O6-甲基鸟嘌呤(例如，Dolan等，Biophys.Res.Commun.，132：178 1985)或O6-苯甲基鸟嘌呤(O6-BG，Dolan等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87：5368，1990)预处理ATase表达细胞，表明增加了氯乙基化试剂的细胞毒作用，而对不表达ATase的细胞几乎观察不到这种致敏作用。
Moschel.Dolan及Pegg，在美国专利5,091,430中指出ATase活性的暂时降低正是提高氯乙基化试剂效力所需要的。又如，PCT申请公开WO91/13898指出当甲基罗氮芥(Me CCNU)与SF767细胞系中O6-苯甲基鸟嘌呤结合时，其ED50下降了3.8倍。因此，Moschel等指明了当一种烷化剂与一种烷基化转移酶的消耗剂联合使用时，其抗肿瘤活性有整体上的提高。
本发明与早期工作相比取得了惊人的且非显而易见的进步，即通过使用特定剂量给药方案配以ATase抑制剂，替莫唑胺的化疗效果急剧增加(对MAWI细胞系高达300倍)。因此，以往对替莫唑胺治疗不敏感或只轻度敏感的人细胞癌症，现在可用替莫唑胺与ATase抑制剂联合加以治疗。
综上所述，本发明的主要目的是提供组合物和方法以改善和拓宽替莫唑胺作为抗肿瘤剂的治疗效果，具体手段是用增效剂，即O6-烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶(ATase)的抑制剂进行结合治疗。
本发明的另一目的是提供使用这些组合物及方法的治疗方案，以使替莫唑胺对人癌细胞的毒性适量增加。
本发明更进一步的目的是提供替莫唑胺重复给药的治疗方案，该方案是通过ATase抑制剂提前或伴随给药来增强疗效。
本发明最后地目的是提供一种方法，该方法是通过确定特定人癌细胞产生的ATase数量，测定所述细胞的ATase抑制剂对替莫唑胺毒性的相对增效程度。
发明概述
本发明涉及使用O6-烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶(ATase)抑制剂使替莫唑胺对人癌细胞的毒性增效的方法。进一步提供一种适于最佳治疗的给药方案，以及一种确定潜在的对替莫唑胺敏感的人癌细胞的方法。
附图的简要说明
图1替莫唑胺(■)和CCNU(×)的细胞毒性(IC50)对下列人肿瘤细胞系细胞ATase水平(以ATase增加为序)的图：ZR-75-1，U87MG，U373，LS174T，LOVO，MCF-7及MAWI。
图2在pZipneoSV(X)1-转染的(○、■)或phAT-转染的(、▲)XP衍生细胞系中，当存在(■、▲)或不存在(O、)10μM BG时，替莫唑胺的细胞毒性。误差范围+/-1标准偏差。
图3MAWI(×)，MCF-7()或U373(≠)人肿瘤细胞系重复每日剂量替莫唑胺的细胞毒性比率图，只使用替莫唑胺的IC50(-BG)与先用BG孵育的IC50(+BG)的比较。
图4增大替莫唑胺浓度对下列人肿瘤细胞系ATase水平的影响图：LOVO(□)、MAWI(×)、MCF-7()、U373(≠)。
图5 4℃时，14C标记的替莫唑胺处理的细胞对放射标记物的摄入图，MAWI(□)、ZR-75-1(×)。
本发明的详细说明
替莫唑胺是适用于治疗人体癌症的抗肿瘤剂，其毒性可通过与增效剂(即O6-烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶(ATase)的抑制剂)联合使用得以大幅度提高。使用诸如O6-苯甲基鸟嘌呤(BG)的ATase抑制剂尤其可以增加替莫唑胺的毒性，例如对MAWI细胞系，当使用本发明所设计的给药方案时可使其毒性增加至300倍，并且使替莫唑胺能用于以往对其不敏感或只是轻度敏感的人体癌症的化疗。
在许多人肿瘤细胞系中可以看出，替莫唑胺及罗氮芥(CCNU)的毒性类似，都与ATase含量有关。替莫唑胺对DNA鸟嘌呤的O6位的甲基化造成细胞毒损伤。通过对人癌细胞进行其相应的ATase产量的筛选，便能确定其对替莫唑胺的敏感性。ATase产生量大的细胞比ATase产生量小的细胞对替莫唑胺的敏感性低。
用单剂量BG预处理细胞，替莫唑胺毒性增加幅度较小(＜4倍)替莫唑胺及罗氮芥(CCNU)提高幅度的数量级相似。在细胞群落试验中，人ATase cDNA转染的成纤维细胞以BG预处理时，尽管其ATase蛋白已被除去，但其对替莫唑胺的抗药性仍比对照组中转染的成纤维细胞强。这似乎并非是由于替莫唑胺转运的不同，可能只反映了phAT成纤维细胞ATase的再合成抵消了抑制剂预处理的效果。
然而，更令人惊奇的是，MAWI细胞系在预处理5天后，BG对替莫唑胺毒性显示了较强的增效(高达约300倍)。在含有高水平ATase的MCF-7细胞中也观察到相近的增大幅度，但在ATase水平低的U373细胞中只有很小的作用。对MAWI及MCF-7细胞系进行试验的结果意味着ATase抑制剂的持续存在导致DNA损伤加剧。
因而本发明提供了一种通过施用ATase抑制量的ATase抑制剂增加替莫唑胺对人癌细胞毒性的方法，并且提供了含有替莫唑胺和ATase抑制剂的产品作为联合制剂，该制剂可在上述治疗人癌细胞时，同时，分别或连续用药。
优选的ATase抑制剂的给药方式是：在几天内或多日内重复用药，且在替莫唑胺给药前施用。重复剂量可在1、2、3、4或5天时给药，4或5天是优选的治疗周期。
进一步和最优选的是，在几天内以重复剂量给患者施用替莫唑胺，在每次替莫唑胺给药前施用ATase抑制量的ATase抑制剂。这导致替莫唑胺对人癌细胞的毒性显著增强，例如，对MAWI细胞系增大约300倍。
在优选的实施例中，ATase抑制剂以ATase抑制量给药，即当ATase抑制剂与替莫唑胺伴随使用时，给药量足以致敏体内肿瘤细胞而不引起正常组织的异常致敏。
本发明ATase抑制剂的用量依治疗肿瘤细胞所需有效剂量而定。恰当的剂量是使被治疗肿瘤细胞中的ATase抑制剂达到致使ATase丧失活性的浓度，例如，化疗前使用的剂量约为1-2000mg/kg，优选为约10-800mg/kg 。
替莫唑胺特别适于治疗的肿瘤包括癌、黑素瘤、肉瘤、淋巴瘤和白血病，尤其适用于星形细胞瘤、神经胶质瘤、恶性黑素瘤、蕈样真菌病、尤因瘤、急性淋巴细胞白血病及肺和乳腺肿瘤。对于乳腺肿瘤、星形细胞瘤及结肠直肠肿瘤细胞，ATase抑制剂特别显著地提高替莫唑胺的活性。
替莫唑胺的典型剂量范围按体重每天一般在0.1至200mg/kg之间，优选1至20mg/kg，或按体表面积每天约40-400、优选约150-300mg/m2。
ATase抑制剂的增效量取决于特定癌细胞中ATase的常规存在量。若癌细胞的ATase水平高，则先行施用ATase抑制剂增效更显著。
本发明可使用的ATase抑制剂是已知具有这种活性的那些物质，例如：O6-烷基鸟嘌呤类如O6-甲基鸟嘌呤，链烯基鸟嘌呤类如O6-烯丙基鸟嘌呤，O6-芳基鸟嘌呤类如O6-苯甲基鸟嘌呤及O6-苯甲基化的鸟嘌呤，鸟嘌呤核苷和2′-脱氧鸟嘌呤核苷化合物，这些记载于PCT国际申请WO91/13898(1991年9月19日出版)中。特别适用于本发明的是O6-苯甲基鸟嘌呤。
ATase抑制剂的具体剂量取决于被治疗癌细胞中常规的ATase含量、患者的年龄和状况及所使用的ATase抑制剂的具体种类。
替莫唑胺最优选的给药方式为连续几天中使用重复剂量。本发明的显著增效作用由高度优选的治疗方案实现，这包括在每剂量替莫唑胺给药之前或同时施用ATase抑制剂量的ATase抑制剂。优选O6-苯甲基鸟嘌呤作为ATase的抑制剂以每天150-300mgm-2的剂量与替莫唑胺联合用药，所述剂量分成4或5个单独剂量给药，连续用药4或5天(总量750-1500mgm-2)。优选每剂量替莫唑胺用药前2-8小时施用每剂量ATase抑制剂。这使替莫唑胺的毒性得以最大程度地增强，并对患者的特定肿瘤提供最有效的治疗。最优选的是，此治疗方案在间隔约4周后重复进行。
替莫唑胺和O6-苯甲基鸟嘌呤的另一种用药方案为连续方式，其中在不少于4天的期间内以每天为基础施用这两种药物，这种联合治疗可根据需要而持续至症状缓解。
此外，特定人癌细胞的ATase生成量可以用作一种筛选方法，用以确定替莫唑胺对所述细胞毒性的增效作用。在优选的方法中，例如，通过Lee等在Cancer Res.，51：619(1991)中提供的方法，检测特定细胞系的ATase含量，并确定对替莫唑胺潜在的敏感性。这就能在治疗方案中使替莫唑胺和ATase抑制剂恰当地结合施用。
用本发明所述化合物制备药物组合物所用的惰性可药用载体可以是固体或液体。固体剂型包括粉末、片剂、分散颗粒剂、胶囊剂、扁囊剂及栓剂。粉末和片剂可含约5-70％的活性成分。适合的固体载体是现有技术已知的，例如碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、糖、乳糖。片剂、粉末、扁囊剂及胶囊剂可作为适于口服的固体剂型。
制备栓剂时，首先将低熔点的腊如脂肪酸甘油酯或可可脂的混合物熔化，并通过搅拌使活性成分均匀地分散在其中。再将熔融的均匀混合物注入适当尺寸的模子中，使其自然冷却固化。
液体剂型包括溶液剂、混悬剂和乳剂。可以提及的是，例如非肠道注射用的水溶液或水-丙二醇溶液剂。
在使用前即刻转化成液体制剂、用以口服或非肠道给药的固体剂型也包括在内。所述的液体制剂包括溶液剂、混悬剂和乳剂。
本发明的化合物也可透皮给药。透皮给药的组合物可以是霜剂、洗剂、气雾剂和/或乳剂，也可将其包含在一种透皮膏药的基质中或药物贮库中，这是本技术领域达此目的的惯用手段。
优选单位剂量形式的药物制剂。其中，制剂被细分成包括适量活性成分(例如达到所需目的的有效量)的单位剂量。
单位剂量制剂中活性化合物的量可在约0.1mg至1000mg之间变化或调整，依特定需要更优选约1mg至500mg。
所用的实际剂量可依据病人的需要及被治病症的严重程度而变化。确定具体情况所用的适合剂量是本领域的常规技术。为方便起见，若需要，则每天的总药量可以分成几部分给药。
替莫唑胺可按常规技术给药，如Wasserman等在Cancer，36：1258-1268(1975)中所述。如果合适，以每天40-400mgm-2、优选每天150-300mgm-2的剂量口服给药，以1～5个剂量、优选4-5个剂量，经过连续1-5天，优选连续4-5天给药。此方案最为优选。以日剂量25-250mgm-2静脉注射给药对于连续给药治疗方案来说是优选的。重复剂量方案可采用口服给药方式。
ATase抑制剂可在施用替莫唑胺之前或同时给药。如需要，则ATase抑制剂和替莫唑胺可以结合成一个单位剂量形式以便于病人用药。这种结合剂量形式可以是上述任何一种剂型，但如前所述，优选口服或静脉注射形式。
替莫唑胺和ATase抑制剂可包装成药盒。其中，针对特定用药途径，替莫唑胺和ATase抑制剂分别制成特定剂型，并附有用药量说明。在口服制剂的典型实施例中，此药盒中的替莫唑胺和ATase抑制剂的口服剂型可分别装在泡囊包装(blister package)内。
任何对剂量的必需调整很容易满足个别病人的化疗要求，而此调整应由熟练技术人员完成。
通过下列制备实施例举例说明本发明，但这不能被当做对本发明所公开范围的限制。
实施例1
材料和方法
材料
组织培养基购自1CN Biomedicals Ltd.(High Wycombe，UK)、胎牛血清购自Gibco Ltd.(Paisley，UK)。O6-苯甲基鸟嘌呤(BG)由Dr.R.C.Moschel(NCI-Frederick Cancer Research& Development Center，Frederick，Maryland，USA)无偿提供，替莫唑胺及它的氯乙基类似物咪托唑胺(8-氨基甲酰基-3-(2-氯乙基)咪唑并(5，1-d)-1，2，3，5-四嗪-4-(3H)-酮)由May and Baker Ltd.(Dagenhan，UK)合成并以DMSO的溶液形式贮存于-70℃。其它一切化学药品购自Sigma ChemicalCo.Ltd.(Poole，UK)。
细胞毒性研究
细胞系在DMEM及10％胎牛血清、25mM HEPES、谷氨酰胺、青霉素/链霉素中以单细胞层常规生长。细胞毒性试验在富含HEPES的培养基中，在5％CO2气氛中进行。在96孔板上每孔植750-1000个细胞，过夜孵育，用或不用33μM BG处理2小时。在上述培养基中加入替莫唑胺或CCNU 1小时，DMSO最终浓度不能超过1％。细胞在新鲜的培养基上再生长7天，用NCI硫氰化胺试验测定蛋白含量，(见Skehan等，J.Natl.Cancer Inst.，82：1107(1990))；生长研究表明试验过程中细胞以对数相生长，替莫唑胺重复给药方案中，细胞被连续处理24小时，每天都换新鲜培养基。测定试验至少重复一次。
人ATase cDNA转染的或对照的XP细胞[Fan等，NucleicAcid Res.，18：5723(1990)]在MEM中生长，每孔植1000个细胞。孵育3小时后，马上将替莫唑胺稀释到MEM中，加入上述培养基中后再孵育5天。按Morten等在Carcinogenesis，13：483(1992)中描述的方法测其存活量。在BG实验中，将300个细胞植在9cm板上一式三份，使其保持5小时。BG(10μM，于MEM中)在用替莫唑胺处理前3小时加入，替莫唑胺须立即稀释到含10μM BG的MEM中。7天后，对细胞群落进行吉母萨染色并计数。
O6-烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶测定
本试验依Lee等在Cancer Res.，51：619(1991)中所述的方法进行。于是，将不同量的细胞提取物与DNA一起孵育，此DNA含有甲基基团以[3H]标记的O6-甲基鸟嘌呤，优选在37℃、在含总容积300μl，浓度为1mg/ml胎牛血清白蛋白的缓冲液1中孵育2小时。孵育后，将胎牛血清白蛋白(100μl，在缓冲液1中的浓度为10mg/ml的溶液)及高氯酸(100μl，4M溶液)快速顺序加入。再加入1M高氯酸2ml，混合物在75℃加热40分钟，将DNA降解为可溶性酸性物质，含有甲基化ATase的蛋白质通过离心收集，用4ml 1M高氯酸洗涤后，再悬于300μl 0.01M NaOH溶液中，然后溶于3ml闪烁水液中(Ecoscint A：National Diagnostics)，并且计数。细胞蛋白含量通过BioRad蛋白检测试剂盒测定，用胎牛血清白蛋白作为标准，ATase活性以每mg提取物细胞总蛋白中转移到蛋白上的甲基(fmol)表示。
[14C]标记的替莫唑胺的细胞摄取
8-氨基甲酰基-3-[14C]甲基咪唑并[5，1-d]-1，2，3，5-四嗪-4-(3H)-酮(特异活性26.3mCi/m mole)由Dr.John Slack(Aston Molecules Ltd.，Birmingham，UK)无偿提供。细胞悬液(5×106ml)在4℃平衡，用200μM标记药物处理。将106个细胞注入埃芬诺夫(eppendorf)管中，离心通过250μl油混合物(4：1“三合一”/Dow Corning硅油)。吸出水层，用300μl生理盐水温和地洗涤油层。离心后将两层皆吸出，将细胞沉淀物溶于组织增溶解剂如Protoso1(氢氧化铵的甲苯溶液)，再加入含Optiphase(95-99％二异丙基萘)的闪烁杯中。
细胞毒性研究结果
数据见表1
表1
单剂量细胞毒性细胞系 替莫唑胺 CCNU ATase(fmol /mg蛋白)IC50 IC50 比率1[-BG] [+BG](μM) (μM)IC50 IC50 比率1[-BG] [+BG](μM) (μM)乳腺ZR-75-1MCF-7 32 23 1.4 325 171 1.9 l2 25 0.5 70 31 2.2 ＜10 581.3星形细胞瘤U87MGU373 172 131 1.3 131 78 1.7 28 8.8 3.2 15 12 1.2 21.9 53.2直肠结肠LS174TLOVOMAWI 873 632 1.4 848 323 2.6 1173 335 3.5 73 13 5.7 92 32 2.9 133 30 4.4 199.6 529.0 992.3XP细胞系pZipphAT 232 - - 1002 - -(0.8)2.3 - -(4.2)2.3 - - ＜2 1240
在组织培养过程中，细胞先接触+/-O6-苯甲基鸟嘌呤(BG)再接触单剂量的替莫唑胺或CCNU。
1. IC50[-BG]/IC50[+BG]
2. 本结果通过Wasserman等在Int.J.Radiat.Oncol.Biol.
Phys.，15：699(1988)描述的MTT试验获得。
3. 括号中的数据为眯托唑胺。
按表1数据做的图1说明，肿瘤细胞系对替莫唑胺(相关系数r＝0.87)或CCNU(相关系数r＝0.92)的敏感性(通过50％生长浓度或IC50测量)与其ATase含量有内在的关系。两线几乎平行，只是相同摩尔浓度的CCNU毒性大约高出5倍。MCF-7细胞系是个例外，其对替莫唑胺中度敏感而ATase活性却相对较高。用非毒性剂量的BG预处理的细胞系对替莫唑胺和CCNU的敏感性分别提高至3.5倍和6倍以上。
对照XP细胞(用pZipneoSV(X)1转染的着色性干皮病细胞)(Fan等，Nucleic Acids Res.，18：5723，1990)，其ATase水平仅可检测到，而对替莫唑胺或CCNU相关制剂咪托唑胺的敏感性却比人ATase cDNA转染细胞高4-5倍(见表1)。在用细胞群落形成测定替莫唑胺细胞毒性中(见图2)，对人ATase转染的XP细胞和对肿瘤细胞，BG预处理的增效程度相近，但是对不表达ATase的对照XP细胞却无可测出的作用。虽然BG损伤前者细胞的ATase活性(见下)，但其对替莫唑胺的抗药性却比对照组pZip转染的成纤维细胞更强。
重复剂量方案的数据在表II中列出。
表2
重复剂量替莫唑胺细胞毒性[IC50(μm)]细胞系 第1天 -BG +BG 第2天 -BG +BG 第3天-BG +BG 第4天-BG +BG 第5天 -BG +BGU373 51 18MAWI 319 196 350 59 383 21 383 7.2 326 1.0MCF-7 319 89 319 51 375 11
组织培养的细胞先与+/-O6-苯甲基鸟嘌呤(BG)接触，再与重复日剂量的替莫唑胺接触。
重复剂量方案显示出：对于MAWI及MCF-7细胞，BG对替莫唑胺的毒性有急剧的增效作用(参见图3)。
24小时剂量处理5次后，MAWI细胞系在BG存在时对替莫唑胺的敏感性增加了300倍以上。在每个细胞系中，多剂量的替莫唑胺本身并不比24小时单剂量更有毒性。在对ATase水平低的U373细胞进行的相似试验中，在24小时剂量4次给药后，BG仅增效3倍。
烷基转移酶水平
MAWI细胞系及人ATase cDNA转染XP成纤维细胞开始时的ATase含量很高，所用BG浓度迅速下降至无法检出的水平，HLPC分析表明37℃时组织培养基中BG至少在24小时内稳定存在。
孵育3小时后，发现替莫唑胺引起(U373、MCF-7、LOVO及MAWI细胞系的ATase含量降低。用药浓度为50-100μM时每个细胞系的ATase含量各降低了50％(见图4)，但MCF-7和结肠直肠细胞系(LOVO和MAWI)之间的单剂量替莫唑胺的细胞毒性有3-4倍的差别。虽然ATase水平已接近试验的检测极限，但仍可发现更敏感的U373细胞系有类似的降低现象。
为了排除替莫唑胺转运的不同的可能性，通过最敏感及最有抗药性的细胞系(分别是ZR-75-1和MAWI)研究细胞对[14C]标记化合物的摄取情况。图5的结果表明，4℃时摄取速度最快，两细胞系皆在5分钟内完成摄取。当校准蛋白浓度时，两细胞系中都发现有相似的药物含量。4℃的快速摄取与替莫唑胺的被动扩散是一致的，这最早见于两个淋巴细胞系，参见Bull等，Biochem.Pharmacol.，36：3215(1987)。
实施例2
口服制剂 mg/胶囊
替莫唑胺 100
乳糖、美国药典 213
微晶纤维素 30
十二烷基硫酸钠 20
玉米淀粉 25
硬脂酸镁 2
将替莫唑胺、乳糖、微晶纤维素、十二烷基硫酸钠和玉米淀粉一起混合。过80号筛。加入硬脂酸镁、混合并装入适当型号的两片明胶胶囊中。
实施例3
口服制剂 mg/胶囊
O6-苯甲基鸟嘌呤 100
乳糖、美国药典 213
微晶纤维素 30
十二烷基硫酸钠 20
玉米淀粉 25
硬脂酸镁 2
将O6-苯甲基鸟嘌呤、乳糖、微晶纤维素、十二烷基硫酸钠及玉米淀粉混合。过80号筛。加入硬脂酸镁、混合后加到合适型号的两片明胶胶囊中。
实施例4
口服制剂 mg/胶囊
替莫唑胺 100
O6-苯甲基鸟嘌呤 100
乳糖、美国药典 213
微晶纤维素 30
十二烷基硫酸钠 20
玉米淀粉 25
硬脂酸镁 2
将替莫唑胺、O6-苯甲基鸟嘌呤、乳糖、微晶纤维素、十二烷基硫酸钠及玉米淀粉混合。过80号筛。加入硬脂酸镁、混合后装到合适型号的两片明胶胶囊中。
实施例5
静脉注射制剂 mg/ml
替莫唑胺 100
亚硫酸氢钠，美国药典 3.2
依地酸二钠，美国药典 0.1
注射用水，加至适量 1.0ml
实施例6
静脉注射制剂 mg/ml
替莫唑胺 100
O6-苯甲基鸟嘌呤 100
亚硫酸氢钠，美国药典 3.2
依地酸二钠，美国药典 0.1
注射用水，加至适量 1.0ml
在不背离本发明的宗旨或实质特征的前提下，本发明也可以用其它药物剂型实施或以其它途径完成，因而本公开应视为对各方面的说明而非限制。本发明的保护范围由后面的权利要求书给出，并且在等同的含意和范围内的所有变化，都包括其中。