刺参腐皮综合征的抗菌免疫双效复方中草药 技术领域：
本发明属于防治养殖刺参重大疾病的专用药物，是一种对刺参腐皮综合征的抗菌免疫双效复方中草药。
背景技术：
21世纪初，刺参养殖在我国北方沿海蓬勃发展，年产值超过200亿元，成为我国第五次海水养殖浪潮的主体。由于刺参养殖规模迅速扩展，病害防治等配套技术相对滞后，加上生产过程中的不规范操作，导致病害问题日趋严重，每年因病害暴发造成的年经济损失超过30亿元，其中以刺参“腐皮综合征”造成的危害最为严重，是导致我国刺参大面积死亡的最重要疾病。
为治疗和预防水产动物疾病，传统防治方法是使用化学消毒剂、抗生素，且已有30多年的历史；因长期使用，不仅病原的抗药性越来越明显，而且其药物残留也日趋严重，造成疾病难以治愈，水产品质量安全受到影响；疫苗也是预防动物传染性疾病一个有效的办法，但有针对性强、作用范围小等缺陷，对于主要依靠非特异性免疫系统的低等无脊椎动物(如对虾、刺参、贝类等)作用有限，而且使用操作也很不方便，难以推广应用。
在本发明形成之前，关于养殖刺参“腐皮综合征”的报道主要集中在流行病学、病原学和组织病理学等方面的研究上。本发明人率先开展了我国海参疾病的研究，并且于2004年命名了养殖海参重大疾病“腐皮综合征”。腐皮综合征俗称“化皮病”，其主要症状包括：厌食、摇头、肿嘴、排脏、口肿溃烂、身体萎缩、体表大面积溃疡，1-2周内死亡率达到80％，其病传染性强，波及面广。该病致病原具有多样性，已报道的有4种，分别为灿烂弧菌(Vibrio splendidus)、假交替单胞菌(Pseudoalteromona nigrifaciens)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，其发病症状和主要病原详见表1。
表1：养殖刺参“腐皮综合征”的发病症状和主要病原：
采样时间 采样地点 发病症状 病原菌 报道者 2003.04 青岛地区 两个发病 养殖场 感染刺参厌食、摇头、肿嘴、排 脏、口肿溃烂、身体萎缩、体表 大面积溃疡，1-2周内个别参池 的死亡率达到80％ 灿烂弧菌 (V.plendidus) 张春云、 王印庚、 荣小军 2004.11 -2005.01 山东省牟 平、即墨、 胶南地区 3家发病 刺参养殖 场 初期感染刺参摇头，口部肿胀， 继而大部分刺参会出现排脏现 象；中期感染刺参身体萎缩、僵 直，口腹部先出现小面积溃疡， 形成蓝白色斑点；末期感染刺参 的体壁溃疡处增多，表皮大面积 腐烂，最后溶为鼻涕状胶体 假交替单胞菌 (P.nigrifaciens) 王印庚、 方波、张 春云、荣 小军 2005年春 山东省莱 州市金城 镇 发病初期患病刺参的口部或肛 门部位的皮肤上有小白点，部分 刺参有吐肠的现象，刺参活动性 降低；而后这个白点的范围迅速 扩大，3天内刺参就会出现死亡 现象；5天内刺参全部腐烂变成 一堆白色鼻涕样黏液 假交替单胞菌 (P.nigrifaciens) 孟庆国、 吴刘记、 吴信忠、 杨建波 2006.01 -2006.05 青岛即墨 市和城阳 区 肿嘴、摇头、排脏、体表蓝白色 溃烂，身体萎缩，最终解体死亡 恶臭假单胞菌 (P.putida) 王印庚、 黄华伟 2006.07 -2006.10 青岛即墨 市和城阳 区 肿嘴、排脏、身体微缩，体表出 现蓝白色溃烂继而解体死亡。解 剖发现未排脏的病参其肠道呈 橘红色，体内壁呈乳白色近乎溃 烂状 哈维氏弧菌(V. harveyi) 王印庚、 黄华伟
迄今为止，国内针对刺参“腐皮综合征”防治药物的研究报道主要是抗生素。用中草药进行口服治疗的有关报道，仅见有李华等“治疗刺参细菌性化皮病的中草药复方制剂”(专利申请号：200810012641.3)，未见该配方具有提高海参免疫力和预防化皮病的效果及相关报道。
发明内容：
本发明目的是提供一种复方中草药，解决其复方中草药的技术问题，使该复方的使用能有效提高刺参免疫力、并同时具备抑制刺参“腐皮综合征”多种病原菌的功能，提高刺参养殖存活率。
本发明所采用的技术方案是：
药物成分及配比为：药物成分为：穿心莲、大青叶、金银花和川芎，药物呈粉末状，粒度200目；药物按重量配比为：2∶1∶3∶2。
服用方式：口服。
药物用量是：口服预防或治疗轻症用量，每公斤饲料添加20g药粉，口服治疗重症用量为每公斤饲料添加30g药粉。
使用方法是：在口服预防和治疗使用时，均按照上述用量称取药物，与海参饲料搅拌均匀后投喂，每日投喂1次，连续20天为一个疗程。
本发明复方具有以下特点：
1、本发明是在对腐皮综合征多种致病原进行单方、复方药效学分析和海参免疫作用的基础上研制而成，具有提高刺参免疫、高效抗菌双效特点。
2、本发明所配制的刺参“腐皮综合征”专用药物，在幼参期和成参期均可以使用，对已患病刺参的治愈率可达到80％以上，存活率达到85％以上。
3、使用操作方法简便，只需按比例将药物添加到饲料中进行投喂即可，适用于幼参培育和养殖生产疾病控制。
4、复方成分采用绿色、无毒副作用的中草药，价格低廉。使用本发明可减少或替代抗生素的使用，对养殖刺参的商品质量和食品安全具有保障作用。
附图说明：
图1：体腔液中碱性磷酸酶(AKP)的变化；
空-表示为空白对照，只投喂基础饲料；葡-表示为1％β-1、3-葡聚糖为阳性对照；高-表示为3％复方中草药；中-表示为1％复方中草药；低-表示为0.5％复方中草药。
图2：体腔液中酸性磷酸酶(ACP)的变化。
具体实施方式：
本发明是在对腐皮综合征多种致病原进行单方、复方药效学分析和海参免疫作用的基础上研制而成，具有抗菌免疫双效特点。
下面以实施实例结合附图详细叙述本发明的技术内容：
一、本发明药物成分的筛选及配比的确定：
1、药物的筛选和处理：
根据中药药性，选用苍术、大黄、马齿苋、甘草、穿心莲、大青叶、鱼腥草、当归、金银花、五加皮、杜仲、淫羊藿、秦皮、川芎、柴胡、茯苓、黄柏、地榆、党参、五倍子、板蓝根和黄芩24种中草药干粉，依次编号为H-1、H-2、H-3......H-24。
中草药干粉通过200目过筛后，各称取5g，分别加入约50℃蒸馏水，即350mL，浸泡2小时后，用大火加热至沸腾，再小火熬制90min；浓缩至50mL时，用8层消毒纱布滤出药液，最后用双层滤纸加压过滤，即制成0.1g/mL浓度的中草药原液，121℃灭菌20min备用。
用无菌的96孔酶标板(有96个孔的透明塑料板，每孔最大工作容积约为250μL)其中的7个加样孔加测定中草药原液(0.1g/mL)，用液体TSB(TSB为胰蛋白胨大豆肉汤培养基，购自北京陆桥技术有限公司)进行2倍递进稀释，然后每孔中加5μL 0.5％红四氮唑指示剂，用于指示细菌生长与否。27℃湿盒中摇床培养6-8h，有菌生长者其对应酶标板孔中液体呈现红色，无颜色变化者的最低抑菌浓度即为MIC值。
对于因中草药本身带颜色而影响判断者，用无菌棉签蘸取酶标板孔中的混合液涂布于TSB平板上(TSB为胰蛋白胨大豆肉汤培养基，既可以配置成固体平板培养基，也可以配置成液体培养基)，直接采取培养法观察细菌生长与否来判断药物的药效和最低抑菌浓度，见表2。结果显示，单方中草药H-5(穿心莲)、H-6(大青叶)、H-9(金银花)和H-14(川芎)对4株海参腐皮综合征病原菌有良好抑菌效果，其MIC值分别为6.25、7.81、5.86和3.52mg/L。
表2：24种单方中草药水煎剂对4种细菌的最低抑菌浓度(mg/mL)：
2、抑菌圈测定：
取直径约90mm的平底双碟，注入经加热融化的TSB 7-9mL，均匀布于碟底，放置超净工作台，待其凝固后，在每一平底双碟中等分置入内径6.0±0.1mm，外径7.8±0.1mm牛津杯，再倒入经加热融化的TSB 15-17mL，凝固后再用灭菌镊子将牛津杯取出，便形成带孔的培养基平板。待平板冷却至室温后，将菌悬液(1×107cfu/mL)用灭菌棉签在带孔平板上均匀涂布，然后在孔中加入100μL中草药原液，每种中草药同时做2个平行组，测定记录抑菌圈大小(抑菌圈大小反映出药物抑菌效果的大小)，取其平均值(取平均值可以消除实验误差。是选出4种单方中草药的实验基础)。通过体外抑制“腐皮综合征”病原菌试验，从24种中草药中筛选出有最好抑菌效果的4种单方中草药，即穿心莲、大青叶、金银花、川芎，见表3。
表3：24种单方中草药水煎剂的抑菌圈测定：
单位(mm)
注：因为牛津杯形成的孔大约为10mm，故抑菌圈直径≤10mm时值为0。
然后再设计正交试验，见表4，复方中草药H-5(穿心莲)、H-6(大青叶)、H-9(金银花)、H-14(川芎)比例分别为20g、10g、30g和20g时，其抑菌圈平均直径分别达最大值，即为15.25mm、12.67mm、13.50mm和13.25mm。复方最佳配比即为H-5∶H-6∶H-9∶H-14＝2∶1∶3∶2。
表4：复方配伍与抑菌效果分析表：
注：MIC表示MIC平均值，BC表示抑菌圈直径平均值。
再进行体外抑菌试验，结果证明，该复方(H-5∶H-6∶H-9∶H-14＝2∶1∶3∶2)对4种致病菌的抑菌效果明显，见表5。
表5：复方中草药对4种细菌的体外抑菌试验：
“+”表示该浓度下未生长细菌“-”表示该浓度下生长了细菌。
二、药物地实施实验及效果：
1、免疫增强效果检测试验组：
2007年10月在山东烟台天源水产有限公司海参养殖场，选择健康海参个体，30-90g/头，饲养于约35L大小的白色塑料箱中，加水20L。每箱饲养6头，每组饲养3箱，试验共分6组，试验组用基础饲料为大连丰源达饵料有限公司生产的益参宝牌幼参专用配合饲料。每kg饲料中入穿心莲、大青叶、金银花、川芎(质量比为：2∶1∶3∶2)复方中草药，设定0.5％、1％、3％3个药物浓度梯度，每个实验组分别以0.5％、1％和3％的β-1、3-葡聚糖为其阳性对照组，只投喂基础饲料的为空白对照组，投喂饲料量按刺参体重的1％投喂。水源为深井海水，平均水温为16℃。早上虹吸法吸底，换水一次，傍晚投喂一次。
试验前暂养1周，前2天不投食，后5天投喂基础饲料。试验开始后，每5天采样一次，每次捞取4头刺参，各抽取0.3mL体腔液于离心管中，3小时内测定完毕离心管中体腔液碱性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)这2项与刺参免疫力高低相关的指标。由图1可知，各组增强剂对刺参免疫增强效果有显著差异。复方的高剂量添加组(3％)从第5天开始，AKP小幅度升高，第10天，极显著高于空白组(P＜0.01)，第20天达峰值，是空白组的5.5倍，是初始值(第0天)的4倍，25天后开始下降，但仍高于空白组。中剂量组1％和低剂量组0.5％则表现平稳。由图2可知，高剂量添加组3％对刺参体腔液ACP影响最明显，第10天时，高剂量添加组便极显著高于空白组(P＜0.01)，随后降低到低于空白组，但第25天时达峰值，显著高于空白组(P＜0.05)，同时显著高于其他试验组同期ACP值，极显著高于初始值(P＜0.01)。中剂量组与低剂量组在试验期间ACP活力与空白对照组相比差异不显著。通过免疫实验表明，复方中草药在添加3％剂量下能够显著提高刺参的免疫力，即每公斤饲料中加入30g复方中草药可获得最佳免疫效果。
2、药物安全性测试：
分2个实验组进行。实验组1饲料中加入20％的复方中草药(20g中草药/80g饲料)，实验组2饲料中加入25％中草药(25g中草药/75g饲料)，对照组只投喂基本饲料。每个实验组设3个重复组，每个重复组有6头刺参(30-90g/头)。实验前暂养2天不投饲料。实验时将上述比例的中草药加入流体饲料中(投喂流体饲料海参方可直接摄食)，搅拌均匀并浸泡2小时后投喂刺参，刺参养殖于白色塑料箱中。通过第2天刺参饵料剩余量及粪便情况确定刺参的进食状况。试验持续时间15天。结果表明：各实验组刺参无任何异常状况，各比例添加药物均没有对刺参造成毒性影响，刺参摄食正常，生长良好。
结论：口服用药进行疾病防治时，添加复方中草药30g/kg饲料，即可提高海参免疫力，并对海参无毒副作用。
三、应用本复方中草药对山东地区6个不同养殖场患“腐皮综合征”刺参进行治疗。效果如下表6：
表6复方中草药防治腐皮综合征临床中试结果
时间 地点 症状 复方配比及使用方法 疗程 效果 2007.11 烟台 50-120g刺参， 摄食能力弱，部 分已经体表大 面积溃烂 按穿心莲∶大青叶∶金银花∶川 芎＝2∶1∶3∶2的配比3％伴饲 投喂治疗 18天 治愈率 80％ 2007.11 蓬莱 2龄参，摇头， 穿心莲∶大青叶∶金银花∶川芎 20天 治愈率
肿嘴，体表溃烂 ＝2∶1∶3∶2的配比3％伴饲投 喂治疗 85％ 2007.12 青岛 稚参，摇头，肿 嘴，有自溶 穿心莲∶大青叶∶金银花∶川芎 ＝2∶1∶3∶2的配比3％伴饲投 喂治疗 14天 治愈率 80％ 2008.1 威海 50-120g参，部 分参体表烂透， 部分排脏 穿心莲∶大青叶∶金银花∶川芎 ＝2∶1∶3∶2的配比2％伴饲投 喂治疗 20天 治愈率 90％ 2008.3 日照 稚参肉刺秃钝， 部分排脏 穿心莲∶大青叶∶金银花∶川芎 ＝2∶1∶3∶2的配比2％伴饲投 喂治疗 17天 治愈率 90％ 2008.2 胶南 腐皮综合征高 发期 穿心莲∶大青叶∶金银花∶川芎 ＝2∶1∶3∶2的配比2％伴饲投 喂预防 20天 未见发 病，预防 效果显著 2008.2 蓬莱 腐皮综合征高 发期 穿心莲∶大青叶∶金银花∶川芎 ＝2∶1∶3∶2的配比2％伴饲投 喂预防 20天 未见发 病，预防 效果显著
通过大量临床防治试验证明：在腐皮综合征高发期，以2％伴饲投喂预防，未见发病，其预防效果良好；症状较轻者以2％伴饲投喂，症状较重者以3％伴饲投喂，投喂治疗20天内其治愈率为80-90％以上。临床实践过程中已在诸多养殖场进行了治疗中试试验，防治效果显著，为养殖单位挽回了大量的经济损失。本发明开创了利用中草药提高海参免疫力并同时有效抑制腐皮综合征病原菌的先例，具有免疫、抗病双效作用，可减少和取代抗生素的使用，对解决重大疾病“腐皮综合征”，提高养殖成活率和产品质量，保障养殖生产稳产、高产具有十分重要的意义。