一种树形聚合物靶向造影剂及其制备方法.pdf

本发明公开了一种树形聚合物靶向造影剂及其制备方法，其造影剂为纳米粒子，其结构为：处于最外端的靶向基团T；作为连接臂的亲水性聚乙二醇链；位于中心核的树形聚合物PAMAM；体内成像的顺磁性金属X；其通式为：PAMAM-PEG(n)-T/X。其制备方法：不同分子量的PEG和靶向基团反应得一端为靶向基团，一端为氨基的：NH2-PEG(n)-T；再将NH2-PEG(n)-T与PAMAM-COOH以32∶1的摩尔比反应，即得大分子配体：T-PEG(n)-PAMAM；将此配体与顺磁性金属离子溶液螯和得PAMAM-PEG(n)-T/X。本发明的制备方法操作简单，条件温和安全，适于推广应用。且所得造影剂，细胞毒性小，驰豫率高，白鼠体内体成像效果很好；荷瘤裸鼠，体内成像时，靶向性明显。

1、  一种树形聚合物靶向造影剂，其特征在于该造影剂为纳米粒子，具有以下结构：
处于最外端的靶向基团；作为连接臂的亲水性聚乙二醇链；位于中心核的树形聚合物PAMAM；体内成像的顺磁性金属X；
其通式为：PAMAM-PEG_(n)-T/X；其中X为顺磁性金属离子：Fe²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺、Dy³⁺或Gd³⁺；PEG为分子量为1000～10000Da的聚乙二醇；T为靶向基团；PAMAM为树形聚合物；靶向基团为叶酸、半乳糖或多肽。

2、  一种权利要求1所述造影剂的制备方法，其特征在于该方法是：将顺磁性金属离子配成溶液并用浓度为0.1M的盐酸调节至pH值为5.8～6.2，然后将树形大分子配体PAMAM-PEG(n)-T用水稀释后滴加到经调节的顺磁性金属离子溶液中，避光、滴加时间控制在30min～45min，室温下反应60～72小时后过凝胶柱，收集液浓缩后冻干得到造影剂PAMAM-PEG(n)-T/X，避光保存；其顺磁性金属离子与树形大分子配体PAMAM-PEG(n)-T的摩尔量比为10∶1～5∶1；顺磁性金属离子溶液的浓度为1～2M；树形大分子配体PAMAM-PEG(n)-T溶液的浓度为0.5～1mg/ml；
所述树形大分子配体PAMAM-PEG_(n)-T的制备包括以下步骤：
a)通过MA的迈克尔加成聚合反应制备整数代的PAMAM大分子；
b)PAMAM与丁二酸酐反应形成端基为羧基的PAMAM-COOH；
c)聚乙二醇二胺(NH₂-PEG_(n)-NH₂)与T等摩尔比反应，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)为缩合剂和催化剂在二甲基亚砜溶剂中反应，得到NH2-PEG(n)-T；
d)NH2-PEG(n)-T与PAMAM-COOH反应，其摩尔比为32∶1，反应液用截留分子量为3500-15000的透析袋，在H₂O中透析60～72h，旋转蒸发仪浓缩，冷冻机干燥，得树形大分子配体PAMAM-PEG(n)-T。

3、  一种权利要求1所述的造影剂，其特征在于该造影剂在肺癌早期影像诊断中的应用。

一种树形聚合物靶向造影剂及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药及纳米医学技术领域，涉及一种树形聚合物靶向造影剂及其制备方法，特别用于肺癌高敏感性MRI成像的造影剂。
背景技术
癌症正在成为一个日益严重的全球问题，目前每年几乎有700万人死于癌症，主要癌症种类为：肺癌(约130万死亡/年)、胃癌(约100万死亡/年)、肝癌(约66万死亡/年)、结肠癌(约66死亡/年)以及乳房癌(约50万死亡/年)，肺癌比任何其他癌症造成更多人死亡。肺癌是一种源于支气管黏膜或腺体的恶性肿瘤，发病率和死亡率在恶性肿瘤中位居首位并且呈逐年上升趋势。
肺癌的早期诊断和准确的临床分析直接关系到治疗方案的选择及预后评估。自1973年Lauterbur首次将核磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging，MRI)应用于人体诊断以来，这一技术在生物、医学等领域已得到迅速发展和广泛应用。MRI造影剂可以克服普通成像序列的限制，改变质子所产生的信号强度，从而提高正常和病变组织的对比度。作为应用于人体的MRI造影剂，除了满足生物适应性强、水溶性好和稳定性等药物基本要求外，还应具有较好的驰豫率、靶向性和适当的体内存留时间。顺磁性金属离子Fe²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺、Dy³⁺和Gd³⁺能与配体络合后形成水溶性顺磁造影剂。
树形聚合物(Dendrimers)是一种人工合成的纳米分子，其直径范围从G0代到G10代分别为1～13nm左右，最早由美国化学家D.A.Tomalia博士发明并成功合成。与线型高分子药物载体比较而言，树形聚合物呈球形，而不像线型高分子那样随机盘绕成团。分子量大小可精细调控(单分散性好)，药代动力学行为具有可重复性。在其合成过程中，可以人为控制聚合物的体积、形态以及末端基团的种类。树形聚合物具有溶解性高、粘附性低、高反应性以及可与其他物质混溶等特点，可以作为单分子纳米微粒运载药物或基因。10多年来，树形聚合物从材料科学到生物医学等诸多领域都受到了日益广泛的关注。更重要的是树形聚合物无免疫原性，不会引起机体的免疫反应，无遗传毒性与细胞毒性，不会导致细胞的转化与细胞死亡。如树形聚合物表面引入羧基，则可以构建理想的Gd³⁺配体。
靶向性造影剂可以提高其在靶器官或组织内的浓度并减少背景组织对造影剂的吸收量，从而提高成像的敏感度。研究表明肿瘤细胞表面上的叶酸受体数量一般比正常细胞上的更多，活性更强，把叶酸键连到造影剂上，可提高造影剂对肿瘤细胞的主动靶向性。从被动靶向性来说，正常组织的血管上的内皮细胞排列紧密，间隙较小，一般小于8nm，而癌变组织中血管壁的间隙要大得多，在100～800nm之间。因此可以利用特定纳米尺寸效应实现在血液流通过程中的纳米药物的被动靶向性。研究表明，静脉注射粒径700～3000nm的微粒，可被肺部毛细血管床机械过滤阻留，并停留相当长的时间，最终被单核巨噬细胞摄取进入肺组织或肺泡。为避免造影剂纳米粒子因肺部毛细血管床机械过滤截留而引起栓塞甚至导致错误的成像诊断结果，造影剂颗粒不能过大。叶酸受体也广泛存在于正常肾脏近曲小管上，但通常当颗粒粒径大于10nm时即不能通过肾小球过滤进入肾脏。
尽管在过去的二十几年中，医学成像技术有了不少进步，但我们对如何在早期阶段发现肿瘤的能力仍然有限。叶酸残基通过生物兼容性大分子键联到树形聚合物表面合成具有特定纳米尺度大小的粒子，利用被动靶向和主动靶向相结合，实现对肺癌高靶向性而敏感造影的体系国内外尚未见报道。基于纳米尺度效应的具有极高的生物兼容性的纳米复合粒子的设计与合成，可望克服目前肺癌临床诊断不及时而错过最佳治疗时机的情况，减轻肺癌这一癌症杀手中致死亡率最高的疾病带给人类的危害，具有重要的学术研究价值和应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生物相容性好，靶向性好，对肺癌早期检测起作用的MRI大分子造影剂。
本发明的又一目的在于提供一种对肺癌细胞具有靶向性的新一代树形纳米聚合物造影剂的制备方法和用途。
本发明的目的是这样实现的：
一种树形聚合物靶向造影剂，特点是该造影剂为纳米粒子，具有以下结构：
处于最外端的靶向基团；作为连接臂的亲水性聚乙二醇链；位于中心核的树形聚合物PAMAM；体内成像的顺磁性金属X；
其通式为：PAMAM-PEG_(n)-T/X；其中X为顺磁性金属离子：Fe²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺、Dy³⁺或Gd³⁺；PEG为分子量为1000～10000Da的聚乙二醇；T为靶向基团；PAMAM为树形聚合物；靶向基团为叶酸、半乳糖或多肽。
上述造影剂的制备方法是：将顺磁性金属离子配成溶液并用浓度为0.1M的盐酸调节至pH值为5.8～6.2，然后将树形大分子配体PAMAM-PEG_(n)-T用水稀释后滴加到经调节的顺磁性金属离子溶液中，避光、滴加时间控制在30min～45min，室温下反应60～72小时后过凝胶柱，收集液浓缩后冻干得到造影剂PAMAM-PEG(n)-T/X，避光保存；其顺磁性金属离子与树形大分子配体PAMAM-PEG_(n)-T的摩尔量比为10∶1～5∶1；顺磁性金属离子溶液的浓度为1～2M；树形大分子配体PAMAM-PEG_(n)-T溶液的浓度为0.5～1mg/ml；
所述树形大分子配体PAMAM-PEG_(n)-T的制备包括以下步骤：
a)通过MA的迈克尔加成聚合反应制备整数代的PAMAM大分子；
b)PAMAM与丁二酸酐反应形成端基为羧基的PAMAM-COOH；
c)聚乙二醇二胺(NH₂-PEG_(n)-NH₂)与T等摩尔比反应，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)为缩合剂和催化剂在二甲基亚砜溶剂中反应，得到NH₂-PEG_(n)-T；
d)NH₂-PEG_(n)-T与PAMAM-COOH反应，其摩尔比为32∶1，反应液用截留分子量为3500-15000的透析袋，在H₂0中透析60～72h，旋转蒸发仪浓缩，冷冻机干燥，得树形大分子配体PAMAM-PEG_(n)-T。
上述造影剂应用于肺癌早期影像诊断。
本发明的造影剂具有以下特点：
①、具有极高的生物兼容性，无免疫原性和细胞毒性；
②、核心结构大小精细可调，表面羧基数量可控；
③、树形聚合物表面羧基密集，可络合多个顺磁性金属离子，从而通过提高造影剂的驰豫率而增强造影的敏感性；
④、主动靶向和被动靶向相结合而对肺癌细胞具有高靶向性能进一步提高成像的灵敏性，实现对肺癌的早期检测，有利于肺癌的早发现、早治疗；
⑤、亲水高分子表面修饰能够延长纳米复合粒子的血液循环时间，增强含钆树形聚合物的水溶性而增强其在血液中的稳定性；
⑥、与线性高分子聚合物盘绕成团形成纳米粒子比较而言，树形聚合物配体形成的纳米粒子在血液流通过程中不会因解离而释放出金属离子从而造成对机体有害。
附图说明
图1为本发明造影剂结构示意图，图中：靶向基团；连接臂；树形高聚物PAMAM；·顺磁性金属离子。
图2为本发明造影剂PAMAM-PEG_(n)-FA/Gd红外谱图
图3为本发明造影剂PAMAM-PEG₍₁₀₀₀₎-FA/Gd形成的粒径在80nm纳米的SEM图
图4为本发明造影剂PAMAM-PEG₍₄₀₀₀₎-FA/Gd形成的粒径在100nm纳米的SEM图
图5为本发明造影剂PAMAM-PEG(n)-FA/Gd形成不同粒径的TEM图
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详述：
实施例1
1.PAMAM的合成
a)0.5G PAMAM-Me的合成
取9g乙二胺和30g甲醇，于三口烧瓶中，边搅拌边滴加103.2g丙烯酸甲酯，滴加速度为每秒一滴，在25℃、搅拌24h。然后将产物在-5℃、133.3Pa的条件下减压蒸馏3小时，得到淡黄色液体。
b)1.0G PAMAM-NH₂的合成
取20.2g 0.5代AMAM于三口烧瓶中，加入60g甲醇，搅拌、滴加72g乙二胺，滴加速度为1d/s，在25℃、搅拌24h。然后产物在-5℃、266.6Pa的条件下减压蒸馏3小时，得到淡黄色粘稠状液体，即1.0G PAMAM-NH₂。
c)重复a)，b)步骤，直到得到纯净的4.0G PAMAM
2.PAMAM-COOH的合成
取0.2mmol的PAMAM(4.0代)溶于无水DMSO中，N₂保护，加入0.02mmol催化剂DMAP和12.8mmol的丁二酸酐，在40℃、搅拌48小时，将溶剂DMSO透析除去，滤除不溶物、冷冻干燥得到PAMAM-COOH。
3.NH₂-PEG₍₁₀₀₀₎-FA的合成
将0.2mol的FA溶于DMSO中、搅拌、N₂保护，加入EDC/NHS活化2h，然后投入等摩尔比的聚乙二醇二胺(NH₂-PEG₍₁₀₀₀₎-NH₂)，室温、避光、搅拌24小时，将产物转移到截留分子量为1000的透析袋中，透析72h、浓缩、过硅胶柱分离提纯，冷冻干燥，得到NH₂-PEG₍₁₀₀₀₎-FA，避光低温保存。
4.FA-PEG₍₁₀₀₀₎-PAMAM的合成
取0.05mmol的PAMAM-COOH溶于DMSO中，加入催化剂量的EDC/NHS活化羧基，反应两小时后投入0.32mmol的单取代的NH₂-PEG₍₁₀₀₀₎-FA，N₂保护、室温、搅拌72h得FA-PEG₍₁₀₀₀₎-PAMAM(PP₍₁₀₀₀₎F)。截留分子量为5000的透析袋中透析，透析纯化，产物浓缩、冷冻干燥，得到大分子配体FA-PEG₍₁₀₀₀₎-PAMAM。用动态光散射测的粒径和Zeta电位，用凝胶渗透色谱测定其分散性。
5.FA-PEG₍₁₀₀₀₎-PAMAM/Gd的制备
称取3.75g(10mmol)GdCl₃.6H₂O溶于10mL水中，用0.01mol/L的稀盐酸调节pH值至6左右，再缓慢滴加10ml的PP₍₁₀₀₀₎F的水溶液10mg/(1mmol)，室温搅拌72小时，过Sephadex-G25凝胶柱，浓缩、冷冻干燥，得最终产物：造影剂FA-PEG₍₁₀₀₀₎-PAMAM/Gd。
实施例2
1.PAMAM的合成
a)0.5G PAMAM-Me的合成
取9g乙二胺和30g甲醇，于三口烧瓶中，边搅拌边滴加103.2g丙烯酸甲酯，滴加速度为每秒一滴，在25℃、搅拌24h。然后将产物在-5℃、133.3Pa的条件下减压蒸馏3小时，得到淡黄色液体，即为0.5G PAMAM-Me。
b)1.0G PAMAM-NH₂的合成
取20.2g 0.5代AMAM于三口烧瓶中，加入60g甲醇，搅拌、滴加72g乙二胺，滴加速度为1d/s，在25℃、搅拌24h。然后产物在-5℃、266.6Pa的条件下减压蒸馏3小时，得到淡黄色粘稠状液体，即1.0G PAMAM-NH₂。
c)重复a)，b)步骤，直到得到纯净的4.0G PAMAM
2.NH₂-PEG₍₂₀₀₀₎-FA的合成
将0.2mol的FA溶于DMSO、搅拌、N₂保护，加入EDC/NHS活化2h，后投入等摩尔比的聚乙二醇二胺(NH₂-PEG₍₂₀₀₀₎-NH₂)，室温、避光、搅拌24小时，截留分子量为2000的透析袋中透析72小时、浓缩、冷冻干燥，过硅胶柱分离提纯，得到产物单取代NH₂-PEG₍₂₀₀₀₎-FA，避光低温保存。
3.COOH-PEG₍₂₀₀₀₎-FA的合成
取20mmol的NH₂-PEG₍₂₀₀₀₎-FA溶于无水DMSO中，N₂保护，加入0.02mmolDMAP催化剂和40mmol的丁二酸酐，40℃、搅拌48h，截留分子量为2000的透析袋中透析，透析纯化，冷冻干燥，得到COOH-PEG₍₂₀₀₀₎-FA
4.FA-PEG₍₂₀₀₀₎-PAMAM的合成
取0.05mmol的PAMAM-NH₂溶于DMSO中，待全部溶解后投入0.32mmol的COOH-PEG₍₂₀₀₀₎-FA，N₂保护、室温搅拌72h，截留分子量为10000的透析袋中透析，透析纯化，产物浓缩、冷冻干燥。用动态光散射测PP₍₂₀₀₀₎F的粒径和Zeta电位，用凝胶渗透色谱测定其分散性。
5.FA-PEG₍₂₀₀₀₎-PAMAM/Gd的制备
称取3.75g(10mmol)GdCl₃.6H₂O溶于10mL水中，用0.01mol/L的稀盐酸调节pH值至6左右，再缓慢滴加10ml的PP₍₁₀₀₀₎F的水溶液10mg/(1mmol)，室温搅拌反应60h，过Sephadex-G25凝胶柱，收集物浓缩、冷冻干燥得最终产物：造影剂FA-PEG₍₂₀₀₀₎-PAMAM/Gd。
实施例3
1.PAMAM的合成
a)0.5G PAMAM-Me的合成：
取9g乙二胺和30g甲醇，于三口烧瓶中，边搅拌边滴加103.2g丙烯酸甲酯，滴加速度为每秒一滴，在25℃、搅拌24h。然后将产物在-5℃、133.3Pa的条件下减压蒸馏3小时，得到淡黄色液体。
b)1.0G PAMAM-NH₂的合成
取20.2g 0.5代AMAM于三口烧瓶中，加入60g甲醇，搅拌、滴加72g乙二胺，滴加速度为1d/s，在25℃、搅拌24h。然后产物在-5℃、266.6Pa的条件下减压蒸馏3小时，得到淡黄色粘稠状液体，即1.0G PAMAM-NH₂。
c)重复a)，b)步骤，直到得到纯净的4.0G PAMAM
2.NH₂-PEG₍₄₀₀₀₎-FA的合成
将0.2mol的FA溶于DMSO、搅拌、N₂保护，加入EDC/NHS活化2h，后投入等摩尔比的聚乙二醇二胺(NH₂-PEG₍₄₀₀₀₎-NH₂)，室温、避光、搅拌24小时，截留分子量为4000的透析袋中透析72小时、浓缩、冷冻干燥，过硅胶柱分离提纯，得到产物单取代NH₂-PEG₍₄₀₀₀₎-FA，避光低温保存。
3.COOH-PEG₍₄₀₀₀₎-FA的合成
取20mmol的NH₂-PEG₍₄₀₀₀₎-FA溶于无水DMSO中，N₂保护，加入0.02mmol催化剂DMAP和40mmol的丁二酸酐，40℃、搅拌48h，截留分子量为4000的透析袋中透析，透析除去溶剂DMSO，滤除不溶物，冷冻干燥，得到COOH-PEG₍₄₀₀₀₎-FA
4.FA-PEG₍₄₀₀₀₎-PAMAM的合成
取0.05mmol的PAMAM-NH₂溶于DMSO中，待全部溶解后投入0.32mmol的COOH-PEG₍₄₀₀₀₎-FA，N₂保护下室温搅拌72h。截留分子量为20000的透析袋中透析，除去溶剂和未反应物。产物浓缩、冷冻干燥。用动态光散射测PP₍₄₀₀₀₎F的粒径和Zeta电位，用凝胶渗透色谱测定其分散性。
5.FA-PEG₍₄₀₀₀₎-PAMAM/Gd的制备
称取3.75g(10mmol)GdCl₃.6H₂O溶于10mL水中，用0.01mol/L的稀盐酸调节pH值至6左右，再缓慢滴加10ml的PP₍₄₀₀₀₎F的水溶液10mg/(1mmol)，室温搅拌64h，，过Sephadex-G25凝胶柱，收集物浓缩、冷冻干燥，得最终产物，大分子造影剂FA-PEG₍₄₀₀₀₎-PAMAM/Gd。
实施例4-6
除分别用FeCl₃、FeCl₂、MnCl₂替代GdCl₃外，其它同实施例1。
实施例7-9
除分别用FeCl₃、FeCl₂、MnCl₂替代GdCl₃外，其它同实施例2。
实施例10-12
除分别用FeCl₃、FeCl₂、MnCl₂替代GdCl₃外，其它同实施例3。
实施例13-15
除用半乳糖替代叶酸(FA)外，其它分别同实施例1、2、3。
实施例16-18
除用多肽替代叶酸(FA)外，其它分别同实施例1、2、3。
在上述实施例中，制得了粒径小于100nm，基于树形聚合物的肺癌或肝癌靶向造影剂。上述实施例仅用以说明本发明但并不局限于此，应该理解在不脱离本发明的范围内还可有多种变通或替换方案。