一种siRNA肿瘤显像剂及其siRNA 【技术领域】
本发明涉及一种siRNA肿瘤显像剂及其siRNA。
背景技术
恶性肿瘤是一类多因素影响、多基因改变以及多阶段发展的疾病。它严重威胁人类生命健康和生活质量，为此，世界各国医学家、生命科学家和大量临床医疗工作者都致力于恶性肿瘤的基础理论研究和临床应用研究。其中利用若干有效手段对恶性肿瘤进行早发现、早诊断、早治疗的“三早”原则受到广泛重视。但是目前大多数的检测手段都有一定的局限性，有的缺乏高特异性，有的灵敏度较低，有的在制备诊断试剂上程序复杂、造价昂贵等。它们在临床应用中都受到程度不同的限制。
自从1998年Andrew Fire和Craig Mello首次证实了双链RNA分子可诱导同源靶向mRNA降解并导致基因沉默的RNA干扰(RNA interference，RNAi)机制后，RNAi技术已经成为基因功能研究和基因治疗研究等领域中最热门的技术之一。小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)作为RNAi过程中的关键因子，具有强大的靶向基因沉默能力。siRNA的发现很大程度上丰富了反义核酸技术。siRNA的特异靶向性不仅为反义核酸显像提供了候选探针的种类，而且其有效的基因沉默效应更是为核酸治疗技术提供了有效手段。同位素标记技术与反义核酸技术的结合，极大的推动了反义显像和反义治疗的发展，实现了体内分子水平的基因显像和治疗。虽然针对反义寡聚核苷酸同位素标记的反义核酸技术在显像及治疗领域已取得一定发展，但是RNA在自然环境中易受多种理化因素的影响而降解的不稳定性，大大限制了RNA反义技术在分子显像和治疗领域中的应用。因此，开发一种适合RNA分子的放射性核素标记方法，构建一种基于siRNA的放射性核素标记探针，对于发展RNA反义显像技术，特别是达到放射性治疗与RNAi基因治疗双重治疗有着重要意义。
尽管RNAi技术已广泛用于基因功能研究以及疾病治疗研究，但是将RNAi技术运用于基因显像研究在国内外均尚未见有报道。目前在核医学领域的研究热点之一是反义显像，即将人工合成的放射性核素标记的反义寡核苷酸引入体内，追踪其与病变组织中过度表达的目标DNA或mRNA发生特异性结合的过程，从而达到在基因水平早期、定性诊断疾病的目的。自1994年，Dwanjee等以DTPA(二乙三胺五醋酸)为螯合剂制备111In标记反义探针，成功进行荷乳腺癌小鼠模型的癌基因c-myc mRNA显像，开始第一次完全意义上的反义显像以来，该技术的发展日趋成熟，但也遇到了同反义技术一样的进一步发展乃至临床应用的瓶颈。
端粒是由端粒DNA和端粒结合蛋白组成，其长度随着细胞分裂的持续进行而不断缩短，当达到一个临界长度，细胞染色体即失去稳定性，阻止细胞进一步分裂的信号便发出，细胞将发生凋亡。端粒酶是一种核糖核蛋白DNA聚合酶，通过为细胞染色体末端结构即端粒加上必要的重复序列TTAGGG，以弥补细胞分裂引起的染色体末端端粒丢失，起到稳定染色体、防降解和融合的作用。端粒激活与细胞的癌源性和永生性相关。正常体细胞不表达端粒酶活性或表达水平很低，因此数次有丝分裂后端粒末端结构逐渐丧失而最终死亡。而人类肿瘤细胞、生殖细胞与干细胞均表达不同程度的端粒酶活性。
人类端粒酶主要包括三种成分，即人端粒酶RNA成分(hTR)，人端粒酶催化亚单位(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)以及端粒酶相关蛋白hTEP1(TP1/TLP1)。
研究发现，大约85％-90％恶性肿瘤细胞和永生化细胞中可以检测到高表达的端粒酶活性，而在大多数的体细胞中则检测不到端粒酶的活性，且hTERT的表达和端粒活性的激活可以降低肿瘤对化疗药的敏感性。由于端粒酶在肿瘤细胞表达相对特异，且与人体正常细胞表达有显著差异，因此hTERT可以作为医学上诊断肿瘤的标志物之一。另一方面，在某些肿瘤类型，恶变前端粒酶即已被激活，随着肿瘤的进展，端粒酶活性逐渐上升，因而端粒酶活性监测可作为早期诊断或预警的一个指标。再者，端粒酶活性也可能是肿瘤患者预后评估的良好指标，至少在部分肿瘤是这样，比如在胃癌患者，端粒酶往往与肿瘤尺寸、转移情况和患者存活时间相关，端粒酶活性高者预后不良。
其中hTERT是端粒酶活性的决定因素，其上调可能是人肿瘤发生、发展的关键事件。hTR和hTERT基因的对照表达研究显示，hTR基因可在增殖力强的胎儿细胞-非永生化细胞中表达，而hTERT基因仅在肿瘤细胞-永生化细胞中表达，因此hTERT基因更显示出肿瘤特异诊断和治疗的潜在应用价值。
目前没有将端粒酶基因用于RNA探针显像中的研究报道。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种siRNA显像剂及其siRNA。
本发明所提供的用于制备siRNA显像剂及其siRNA，其干扰靶点为人端粒酶催化亚单位(hTERT)基因mRNA地第14个外显子的第3119-3137位核苷酸(19bp)，即5’-TTTCATCAGCAAGTTTGGA-3’，其正义链序列为序列表中序列2，其反义链序列为序列表中序列1。
所述siRNA的正义链和反义链均为经全程2’-OMe修饰。
所述siRNA的反义链的5’端还连接有一个伯胺。
所述伯胺通过连接子与所述siRNA的反义链连接，所述连接子为己基；所述siRNA的反义链的3’端连接有两个脱氧胸腺核苷酸；所述siRNA的正义链的3’端连接有两个脱氧胸腺核苷酸。
本发明的siRNA显像剂，是首次以上述针对hTERT mRNA的siRNA，以放射性核素标记制备的siRNA分子探针；
所述放射性核素为99mTc、131I、18F、111In、68Ga或188Re。所述放射性核素为优选为99mTc。
所述放射性核素99mTc是利用螯合剂NHS-MAG3标记到所述siRNA上的。
本发明的siRNA显像剂，由于其siRNA可以干扰人端粒酶催化亚单位(humantelomerase reverse transcriptase，hTERT)表达的原理，可用于检测各种实体肿瘤，如肝细胞肝癌、乳腺癌、小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、皮肤癌、宫颈癌、阴道癌、结肠癌等hTERT表达阳性的恶性肿瘤。
上述siRNA显像剂的获得方法，包括下述步骤：
1)将权利要求1-4任一项所述siRNA的反义链分别与NHS-MAG3反应生成MAG3螯合RNA，然后将该MAG3螯合RNA与权利要求1-4任一项所述siRNA的正义链退火形成MAG3螯合siRNA；
2)将MAG3螯合siRNA在含有1-2μg/μLSnCl2·2H2O和放射性同位素化合物的反应体系中反应1小时；所述反应体系以50mg/mL酒石酸钠缓冲液为溶剂；所述放射性同位素化合物优选为99mTcO4-。
本发明的克服了siRNA稳定性差，标记难的问题，成功的制备了siRNA显像剂。
通过大量的验证该siRNA显像剂在肿瘤显像中的应用效果实验表明，该siRNA显像剂具有稳定性高、特异性强的特点，能够在活体上，通过显像及时发现肿瘤并对其精确定位，实现识别恶性肿瘤，还具有早期性、灵敏性、定量性、无创性、安全性等特点。
本发明的siRNA显像剂，根据其标记的放射性核素的不同，可达到不同的作用，实验中以99mTc标记反义寡核苷酸为例，本发明的siRNA显像剂利用发射γ射线的放射性核素(99mTc)标记针对人端粒酶逆转录酶hTERT基因所设计的特异性的siRNA，制备肿瘤基因显像的分子探针；对该分子探针的稳定性、特异性以及抑制基因表达有效性等方面进行体外实验研究；将该分子探针引入荷瘤动物体内进行显像研究，根据RNAi技术的高专一性特点，与肿瘤组织中高表达的hTERT基因结合，通过体外探测仪器(如SPECT)了解放射性核素在体内的分布情况，从而发现肿瘤部位、形态、大小、肿瘤灶的多寡、是否存在转移部位以及鉴别肿瘤的良恶性等，并且确定最佳给药剂量、最佳显像时间以及图像评价方法，以期建立有效的肿瘤基因表达显像的诊断方法。如应用其它放射性核素(如18F、111In、68Ga等)进行标记，亦能在PET或PET/CT诊断平台上达到特异诊断肿瘤的目的，更增加了诊断的敏感性和分辨率；另外，如果应用治疗性的放射性核素(如131I、188Re等)进行标记，还能达到特异治疗肿瘤的目的。
本发明的siRNA显像剂具体具有如下特点
(1)本研究证明以hTERT为靶点的siRNA显像剂可有效的用于肿瘤分子显像，特异性高，阳性率高。
(2)通过标记活性和体外多种条件的稳定性实验，本发明的siRNA显像剂通过2’-OMe修饰后，使其具有很好的稳定性。
(3)本发明的siRNA显像剂通过双功能螯合剂NHS-MAG3被放射同位素99mTc标记，获得了较理想和稳定的标记率、放化纯和比活度。
总之，本发明的siRNA显像剂选择适当的具有高特异性的肿瘤标志物基因-人端粒酶逆转录酶(hTERT)，在国内外首次应用RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术进行基因表达显像的实验研究，具有稳定性高、特异性强的特点，能够在活体上实现识别恶性肿瘤，通过显像及时发现肿瘤并对其精确定位，是一种高特异性、高灵敏度、具有较理想临床应用价值的肿瘤基因诊断显像剂，具有广阔的应用前景。
【附图说明】
图1为通过S-Acetyl-NHS-MAG3螯合的99mTc标记siRNA反应路线图
图2为螯合产物经Sephadex G25纯化产物在紫外分光光度计分析结果
图3为螯合前后RNA质谱分析结果
图4为使用纸层析法测定99mTc-siRNA放射性化学纯度结果
图5为不同反应时间对标记率的影响
图6为SnCl2·2H2O的用量对标记率的影响。
图7为99mTc-siRNA显像剂在体外的稳定性
图8为99mTc-siRNA显像剂对hTERT mRNA(a)和hTERT蛋白表达量的影响(b)
图9为99mTc-siRNA与99mTc-Control探针分别在有/无脂质体介导下的HepG2肝癌细胞摄取率
图10为99mTc-siRNA与99mTc-Control探针分别在0.5h、1h、2h、4h和6h时的Tumor/Non-Tumor比值。
图11为注射99mTc-siRNA探针后0.5h、1h、3h和6h在BALB/c荷瘤裸鼠体内显像。
图12为分别注射99mTc-siRNA与99mTc-Control探针后6h时荷瘤裸鼠体内显像。
【具体实施方式】
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、siRNA显像剂的制备
本研究采用全程2’-OMe修饰的siRNA作为研究对象，拟通过双功能螯合剂S-乙酰基-NHS-MAG3(N-hydroxysuccinimidyl derivative of S-Acetylmercaptoacetyltriglycine)使之被放射性核素99mTc标记，其具体合成及反应路线见图1。
1、hTERT siRNA的序列与合成
hTERT siRNA的干扰靶点选择hTERT基因mRNA的第14个外显子的第3119-3137位核苷酸(19bp)，该hTERT siRNA双链均为全程2’-OMe修饰，序列如序列1所示。其反义链为5’-NH2-(CH2)6-UCCAAACUUGCUGAUGAAAd(TT)-3’，其5’端连接6碳己基及氨基伯胺结构，作为与MAG3螯合的基团，其3’端加2个脱氧胸腺核苷酸d(TT)用于提高RNA分子活性。其正义链仅3’端加d(TT)结构，即5’-UUUCAUCAGCAAGUUUGGAdTdT-3’(序列如序列2所示)。
对照组Control siRNA的靶点序列为5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’，其为人类基因无关序列，不会以任何人源序列相互作用，其结构修饰与hTERT siRNA的结构完全相同。
全程2’-OMe修饰的hTERT siRNA和Control siRNA双链(两对互补的单链)均由上海GenePharma公司合成，通过HPLC纯化及RNA变性胶分子量鉴定后以冻干形态保存于-80℃。
2、siRNA反义链与NHS-MAG3螯合反应
取适量冻干全程2’-OMe修饰hTERT siRNA反义链或Control siRNA反义链溶于0.30M HEPES缓冲液(pH 8.0)中，浓度达到10μg/μL。在震荡条件下，将无水DMF新鲜配制的NHS-MAG3溶液加入RNA溶液中，使MAG3∶RNA的最终摩尔比为15∶1，室温下静置反应1h～2h。反应产物经过醋酸铵溶液(0.25M，pH 7.2)洗脱在Sephadex G25层析柱(0.7×28cm)纯化后，按照0.5mL/管依次收集30管。根据每管洗脱产物在260nm波长处的吸光度值(OD260nm)，计算RNA浓度。合并RNA峰管后将其真空冻干，保存于-80℃备用。
本实验中螯合产物经过Sephadex G25层析柱纯化后，使用ND1000紫外分光光度计对其吸光度进行测定，发现第7管～第9管和第19管～第21管产物均在260nm处有一定的吸收峰(图2中A)。但第7管～第9管产物经紫外分光光度计测定发现仅仅在260nm处有吸收峰，且峰值较高，提示含有螯合产物MAG3-RNA(图2中B)。而第19管～第21管的吸收峰主要位于230nm处，而260nm处的吸收峰仅为230nm锋的延续，提示主要为未螯合的游离MAG3离子峰(图2中C)。
将螯合产物MAG3-RNA与螯合前的RNA进行质谱分子量分析，螯合前RNA分子量为7061.4(图3中A)，螯合后MAG3-RNA分子量为7307.1(图3中B)，螯合前后分子量差别为245.7。MAG3基团螯合后的理论分子量为245.23，可见螯合前后的分子量差别与理论相符，验证了本实验对RNA分子的成功螯合。NHS-MAG3作为一种双功能螯合剂，与RNA的5′或3′末端连接的胺基而结合，去除保护巯基的乙酰基基团，通过转螯合作用而与99mTc螯合被标记。其优点是可以在室温和中性条件下进行标记反应，这种温和的反应环境对保护反应中的RNA起到重要作用，且该螯合剂具有稳定性高、标记率高、脱靶少的优势，对RNA99mTc后续标记其中支持作用。
3、MAG3-siRNA双链形成
取适量螯合hTERT siRNA反义链与未螯合的hTERT siRNA正义链RNA进行AXIMA-CFRplus质谱分析，检测其分子量差以确认螯合产物的正确性，再将螯合后的反义链和正义链退火形成siRNA双链。取等量的RNA互补链分别溶于1×退火缓冲液(0.05M NaCl，10mM dithiothreitol，10mM MgCl2，10mM Tris-Cl，pH 7.5)中，使得浓度为1μg/μL。将二者混匀后90℃加热1min，再置于37℃水浴1h退火形成双链即得到MAG3-siRNA。最后将RNA退火产物以10μg/管浓度分装、冻干，保存于-80℃备用。同样，将Control siRNA反义链与未螯合的Control siRNA正义链按照同样的方法退火得到双链MAG3-Control siRNA。
4、99mTc标记反应
使用碳酸氢钠(0.5M)、醋酸铵(0.25M)和氢氧化铵(0.175M)的混合溶液配制50mg/mL浓度的酒石酸钠缓冲液(pH 9.2)。标记前使用该缓冲液配制新鲜的SnCl2·2H2O溶液。取适量MAG3-siRNA溶于醋酸铵缓冲液(0.25M，pH 5.2)配制成300～500μg/mL。向MAG3-siRNA溶液中加入酒石酸钠缓冲液(50mg/mL)使其终浓度达到7μg/μL。加入新鲜的37-74MBq 99mTcO4-淋洗液后随即加入适量的SnCl2·2H2O 1μL)，使反应体系中的SnCl2·2H2O浓度为1μg/μL。室温下静置1小时充分反应。反应产物通过Sephadex G25层析柱(0.7×28em)纯化后按0.5mL/管收集，并测定各管的放射性活度和OD260nm吸光度值。收集OD260nm值与放射性活度均高的产物即为标记产物(99mTc-siRNA)。将对照Control siRNA的标记产物命名为99mTc-Control。
5、标记率和放射化学纯度的测定
采用新华一号试纸为固定相，丙酮和生理盐水为双展开剂的纸层析法测定。
标记反应产物有三种：游离锝(未被亚锡离子还原的99mTcO4-)、水解锝(99mTcO2·nH2O)和络合锝(99mTc-siRNA)。根据不同标记产物在纸层析展开体系中的比移值(Rf)的差异从而计算出标记率或放化纯。当丙酮作展开剂时，Rf(99mTcO4-)＝0.9～1.0，Rf(99mTcO2·nH2O)＝0～0.1，Rf(99mTc-siRNA)＝0～0.1；当生理盐水作展开剂时，Rf(99mTcO4-)＝0.9～1.0，Rf(99mTcO2·nH2O)＝0～0.1，Rf(99mTc-siRNA)＝0.8～1.0。根据表1结果，可得99mTc-siRNA标记率或放化纯计算公式为100％-99mTcO4-％-99mTcO2·nH2O％。
表1.使用丙酮和生理盐水双展开剂的纸层析检测结果
结果表明，当反应体系中加入1μg/μL SnCl2·2H2O室温反应1h时，其标记率可达73.4％±3％(n＝5)。经过Sephadex G25纯化，放化纯在92％以上(图4)，比活度可达25.9Gbq/μmol(50μCi/μg)。相比之下，未使用NHS-MAG3螯合的RNA其标记率仅为3％±1.3％(n＝5)，提示螯合剂NHS-MAG3是99mTc标记RNA的关键。
1)反应时间对标记率的影响
如图5所示，在使用1μg/μL SnCl2·2H2O的条件下，测定了从5min到5h的反应时间的标记率，其余标记步骤按照步骤4所述。结果可见在反应1h内，随着反应时间的增加，标记率显著提高，1h时达77％。可是再随着反应时间的增加，标记率无显著提高。考虑到反应时间长，则RNA受到理化降解因素的危险就越大，因此本实验选择1h作为标记反应时间。既保证了高标记率，还降低了RNA降解的风险。
2)SnCl2·2H2O用量对标记率的影响
SnCl2·2H2O可以在标记反应中还原高锝99mTc使MAG3-siRNA被99mTc标记，但同时过多的SnCl2·2H2O会产生过多的锝胶体而影响标记率。本研究按照步骤4所述标记步骤，分别在反应体系中加入1μg/μL、2μg/μL、4μg/μL、8μg/μL、10μg/μL的SnCl2·2H2O，发现1μg/μL或2μg/μL的使用量可得较高的标记率。当SnClx·2H2O使用量增大时，标记率迅速下降，此结果和预期相符(图6)，亦和以往针对寡核苷酸99mTc标记时SnCl2·2H2O使用量一致。
6、标记稳定性分析
取99mTc-siRNA产物分别溶于适量体积的生理盐水和人新鲜血清中，终浓度为0.01μg/μL。分别置于室温和37℃中，孵育0.5h、1h、2h、3h、4h、6h后，分别取样，纸层析法测定放化纯。
本研究显示99mTc-siRNA探针在生理盐水和人新鲜血清中孵育6小时均保持较好的放化纯稳定性，维持94％以上(图7)。99mTc-siRNA在血清中的放化纯稳定性与在生理盐水中无显著差异，说明标记探针在血清中没有受到多种酶成分的影响而降解，且无脱标现象。而且探针在37度的稳定性与室温条件相比亦无显著差异。以上结果提示2’-OMe修饰可以大大提高RNA分子在多种理化条件下的稳定性，且通过MAG3螯合的99mTc标记的产物可在多种条件下保持标记的稳定性，都为将来siRNA反义探针在体内试验的研究奠定了研究基础。
实施例2、本发明99mTc-siRNA显像剂的效果验证
一、体外生物实验
1、99mTc-siRNA体外活性的测定
我们通过测定该分子探针对肝细胞癌细胞系HepG2的hTERT的mRNA和蛋白表达的抑制效果，来评价该99mTc-siRNA显像剂在标记前后是否有活性丧失的情况。如果活性无改变，则说明我们的标记方法不会对99mTc-siRNA的分子活性有影响，是成功的。步骤为：首先将未标记的的探针(实施例1的步骤3制备的siRNA)和标记的探针(实施例1的步骤4制备的99mTc-siRNA显像剂)均进行转染至HepG2细胞中，孵育2-3天后，收集细胞，提取RNA或者蛋白质，分别进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹(Western Blotting)方法，检测hTERT的mRNA和蛋白量的变化。具体步骤如下所述：
1)细胞转染
HepG2细胞系(购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏编号为HB-8065)，饲养于高糖培养基(DμLbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM，购自Gibco))中。转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。转染时，细胞要达到80～85％的融合度。每孔准备240μl的无血清培养基(Opti-MEM I Reduced Serum Medium，购自Gibco)和10μl转染脂质体(Lipofectmine 2000，购自Invitrogen)(总体积250μl)的混合液，温育5min。分别再准备每孔10nmol的99mTc-siRNA或未标记的的探针(实施例1的步骤3制备的siRNA)和无血清培养基(Opti-MEM I Reduced SerumMedium，购自Gibco)的混合液，总体积也为250μl。分别将二者混合，室温下孵育20min。与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml无血清培养基。再将孵育后的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在37℃，5％的CO2中孵育6小时后，更换含有10％的胎牛血清(Gibco)的全培养基，在37℃，5％的CO2中48～72h检测转染水平。设置未处理组和脂质体组作为对照，未处理组为正常培养的肿瘤细胞，未做转染处理；脂质体组仅在转染过程中加入了转染试剂，但是未加入任何RNA的细胞。实验设置三个重复。
2)RT-PCR检测
将HepG2用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗3次后，使用Trizol(Invitrogen)来提取细胞中的总RNA。接着使用随机引物和逆转录酶(moloneymurine leukemia virus reverse transcriptase)合成cDNA。具体如下：首先在20μL体系中，按以下体系加入反应液：随机引物Random Primer(150ng/μL)1μL，dNTPmixture(10mM)1μL，Total RNA 3μL(1ng-5ug)，无RNA酶的水7μL。65度加热5min，迅速冰上冷却，短暂离心后，再加入以下成分：5×first strand buffer 4μL，0.1M 10×DTT 2μL，RNA酶抑制剂1μl。轻轻混匀，25度温浴2min，再加入1μL(200U)的Turbo RT逆转录酶，轻混匀，再25度10min。接着42度温浴50min，最后70度温浴15min以灭活逆转录酶活性。所得产物即为cDNA产物，4度保存，待PCR使用。
PCR反应中扩增hTERT所用引物序列：上游为
5’-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3’，下游为5’-GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3’。
扩增GAPDH mRNA的引物：上游为5’-CATCAAGAAGGTGGTGAAGC-3’，下游为5’-ACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3’。所用的DNA聚合酶为美国CHIMERx公司产。反应序列为95℃5mins后，95℃30s、60℃30s、72℃30s共30个循环，最后72℃10分钟。所得产物利用2％的琼脂糖胶进行分子量鉴定。
3)蛋白印迹(Western-blot)检测hTERT蛋白的表达
收集2×106个细胞，加入0.5～1ml预冷细胞裂解液(50mmol/L HEPES，PH7.O，500mmol/L Nacl，1％NP-40，100μg/ml PMSF，1μg/ml AEBSF)，充分混匀，冰浴放置30分钟，期间漩涡振荡2～3次。10,000rpm，4℃离心10分钟，取上清，测定蛋白浓度。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的分离胶浓度为8％。上述提取的细胞总蛋白的上样量为150μg/孔道，恒压5V/cm电泳，电泳毕，置凝胶于转膜缓冲液中平衡5分钟。取聚偏氟乙烯膜(Hybond-polyvinylidene difluoride membranes，PVDF)，先用甲醇浸润后再用纯水漂洗5分钟，置转膜缓冲液中平衡10分钟。采用湿转系统(Bio-rad)，恒流200mA，转膜2h。转膜毕，将PVDF膜置于含5％脱脂牛奶的1×TBS溶液中常温封闭1h。一抗分别用加入1∶500稀释的hTERT一抗和1∶5000稀释的对照蛋白β-TubμLin抗体，4度孵育过夜。用0.05％Tween-20的TBST溶液洗涤三次，每次5分钟。二抗：1∶5000稀释的HRP标记的二抗IgG(北京中山生物科技公司)，室温振荡孵育1h后，0.05％Tween-20的TBST溶液洗涤3次，每次10分钟。按试剂说明，加发光试剂Chemiluminescence Luminant Reagent(Santa Cruz)孵育1分钟，X光胶片曝光成像。
结果见图8，可见99mTc标记过的siRNA和未标记的siRNA探针均具有非常显著的基因沉默效果，且二者之间无显著差异。分别参照管家基因和蛋白的表达量，其mRNA的抑制率为79.2％，其蛋白表达抑制率为76.7％，与未经处理的及只加入脂质体转染的细胞相比，转染了未标记和标记过的siRNA的细胞的hTERT mRNA和hTERT蛋白表达量均有显著减低，平均抑制率分别达到79.2％和76.7％。此结果说明本实验采用的MAG3螯合以及99mTc标记并未影响siRNA探针的生物活性，保证了siRNA仍然具有良好的肿瘤特异靶向性。其中，未处理组为正常培养的肿瘤细胞，未做转染处理；脂质体组仅在转染过程中加入了转染试剂，但是未加入任何RNA的细胞；未标记RNA组指转染使用的RNA未进行99mTc标记；99mTc-RNA组为转染使用的RNA探针经过99mTc标记(99mTc-siRNA)。图8中a为99mTc-siRNA显像剂对hTERT mRNA表达量的影响，b为99mTc-siRNA显像剂对hTERT蛋白表达量的影响。
2、分别测定有或无脂质体介导作用下实验及对照组探针的的肿瘤细胞摄取率
当24孔板中的HepG2细胞生长密度达到80％左右时，向每孔中加入等量的99mTc-siRNA(1pmol)和99mTc-Control(序列为实施例1的步骤1所述的人类基因无关序列，标记方法按照实施例1所述的siRNA标记方法进行)。对于无转染组，直接将探针99mTc-siRNA(1pmol)或99mTc-Control加入细胞培养基中，无需任何脂质体转染；而对于转染组，则按照步骤1的步骤1)的细胞转染步骤操作，分别将HepG2细胞转染99mTc-siRNA(1pmol)或99mTc-Control进行转染操作。因此实验总共分为99mTc-siRNA转染组(图9中siRNA(+))、99mTc-siRNA无转染组(图9中siRNA(-))、99mTc-Control转染组(图9中Control(+))、转染99mTc-Control无转染组(图9中Control(-))。加入后，分别在10min，0.5h，1h，2h，4h和6h时分别收集上清和细胞。将培养液与3次的PBS洗液合并，并用井型计数器测定放射性计数，计做Cout；之后用含有0.5M氢氧化钠和1％的SDS细胞裂解液裂解细胞后，收集裂解液及3次PBS洗液，同样测定其合并的放射性计数，计做Cin，细胞摄取率计算按照如下公式计算Cin/(Cin+Cout)。结果如图9所示，有无脂质体转染的探针的肿瘤摄取率均随着时间的延长而不断增加。对于99mTc-siRNA组，脂质体介导的探针肿瘤细胞摄取率高于无脂质体组，均在6h时达到最大，分别为32.86±3.1％(n＝4)和50.22±2.6％(n＝4)，二者存在显著差异(P＜0.05)。且99mTc-siRNA组的肿瘤细胞摄取率明显高于99mTc-Control组。
二、体内动物实验部分
1、动物模型的构建
动物选择BALB/c nu/nu裸鼠(雌性，20±4g，4-6周龄)，购买及饲养于北京大学医学部动物中心。于每只裸鼠右上肢腋下注射1×107HepG2肿瘤细胞，饲养20天左右即可在注射部位成瘤。当肿瘤成长至直径为1em时，分别作生物学分布实验和体内显像实验。
2.99mTc-siRNA和99mTc-Control探针在荷瘤裸鼠体内的分布实验
当肿瘤达到合适大小的时候，分别通过尾静脉注射1μg(50μCi)的99mTc-siRNA和1μg(50μCi)99mTc-Control探针，体积均为200μL。分别于注射后0.5h，1h，2h，4h和6h，对每组5只裸鼠进行取血，并脊髓拖断处死。分别解剖取心、肝、脾、肺、肾脏、胃、小肠、膀胱、小腿长骨、肌肉和肿瘤，称重并利用NaI(T1)计数仪测定放射性计数。分布结果分别记为每克组织的放射性计数的百分数(％ID/g)和肿瘤/非肿瘤(T/NT)比值。
体内分布实验显示各脏器放射性计数随时间延长而下降(表2和表3)，但是实验组肿瘤放射性下降慢于对照组。99mTc-siRNA探针在血液和肌肉的T/NT比值显著高于对照组(图10)。图10为99mTc-siRNA与99mTc-Control探针分别在0.5h、1h、2h、4h和6h时的Tumor/Non-Tumor比值。图10中，A为99mTc-siRNA的T/NT比值；B为99mTc-Control探针的T/NT比值。
表2.99mTc-siRNA分布结果ID/g(％)
表3.99mTc-Control的放射性分布ID/g(％)
3.在HepG2荷瘤小鼠模型的显像实验
同样待裸鼠肿瘤长至1cm3时，尾静脉注射200μL的4μg (200μCi)的99mTc-siRNA(实验组)和99mTc-Control(对照组)。将裸鼠置于SPECT(GE Healthcare)的探头上，配以低能、高分辨平行孔准直器，分别在30min、1h、3h、6h采集静态图像，采集计数为200,000个计数，图像储存为256×256像素，2.0倍。
注射99mTc-siRNA探针的荷瘤裸鼠显示出较清晰的肿瘤影像，特别是在6h(图11，箭头所指为肿瘤部位)，而对照组肿瘤影像随时间延长而减弱明显，在6h时实验组肿瘤显像显著高于对照组(图12，箭头所指为肿瘤部位)。
综上所述，本发明的99mTc-siRNA显像剂具有如下特点
(1)本研究证明以hTERT为靶点的99mTc-siRNA显像剂可有效的用于肿瘤分子显像。
(2)通过标记活性和体外多种条件的稳定性实验，本发明的99mTc-siRNA显像剂通过2’-OMe修饰后，使其具有很好的稳定性。
(3)本发明的99mTc-siRNA显像剂通过双功能螯合剂NHS-MAG3被放射同位素99mTc标记，获得了较理想和稳定的标记率、放化纯和比活度。
【序列表】
<160>1
<210>1
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
uccaaacuug cugaugaaa 19
<210>2
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
uuucaucagc aaguuugga 19