选择性检测细胞内锌离子的荧光探针及其合成方法和用途.pdf

本发明涉及选择性检测细胞内锌离子的荧光探针及其合成方法和用途。该荧光探针在体外对锌离子具有良好的选择性，而且可用于细胞内锌离子的快速成像。将带有R1，R2，R3、R4和R5取代基的香豆素-3-羰基化合物溶于干燥有机溶剂中，回流搅拌下缓慢滴加带有R6取代基的2-肼基吡啶，回流搅拌反应后过滤，除去有机溶剂，得到选择性检测细胞内锌离子的荧光探针(I)。该荧光探针可用于生物活细胞和活组织内锌离子的分析检测和荧光成像检测，以及临床医学上病变组织中锌离子的检测。

1.  一种选择性检测细胞内锌离子的荧光探针，其特征是：所述的选择性检测细胞内锌离子的荧光探针具有式(I)所示的结构：

式(I)中的R₁，R₂，R₃，R₄，R₅，R₆分别或者同时为氢、烷基、取代烷基或芳基。

2.  根据权利要求1所述的选择性检测细胞内锌离子的荧光探针，其特征是：所述的R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆中的烷基为：1至50个碳原子的烷基或3至50个碳原子的环烷基；
所述的R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆中的取代烷基为：芳基取代的1至50个碳原子的烷基、ω-羟基取代的1至50个碳原子的烷基、ω-羧基取代的1至50个碳原子的烷基或ω-酯基取代的1至50个碳原子的烷基；
所述的R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆中的芳基为：邻、对、间位1至50个碳原子的烷基苯基，邻、对、间位卤代苯基，邻、对、间位1至50个碳原子取代或未取代的烷氧基苯基或邻、对、间位胺基苯基。

3.  根据权利要求2所述的选择性检测细胞内锌离子的荧光探针，其特征是：所述的R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆中的1至50个碳原子的烷基分别或者同时选自甲基，乙基，丙基，烯丙基，异丙基，丁基，异丁基，戊基，异戊基，己基，2-甲基戊基，庚基，2-甲基己基，辛基，2-甲基庚基，壬基，2-甲基辛基，癸基，2-甲基壬基，十一烷基，十二烷基，十三烷基，十四烷基及十五烷基中的一种；
所述的R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆中的3至50个碳原子的环烷基分别或者同时选自环丙烷基，环丁烷基，环戊烷基，环己烷基及环庚烷基中的一种。

4.  根据权利要求2所述的选择性检测细胞内锌离子的荧光探针，其特征是：所述的R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆中的芳基取代的1至50个碳原子的烷基分别或者同时选自芳基甲基，芳基乙基，芳基丙基，芳基烯丙基，芳基异丙基，芳基丁基，芳基异丁基，芳基戊基，芳基异戊基，芳基己基，2-甲基芳基戊基，芳基庚基，2-甲基芳基己基，芳基辛基，芳基2-甲基庚基，芳基壬基，2-甲基芳基辛基，芳基癸基，2-甲基芳基壬基，芳基十一烷基，芳基十二烷基，芳基十三烷基，芳基十四烷基及芳基十五烷基中的一种；
所述的R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆中的ω-羟基取代的1至50个碳原子的烷基分别或者同时选自ω-羟基甲基，ω-羟基乙基，ω-羟基丙基，ω-羟基异丙基，ω-羟基丁基，ω-羟基异丁基，ω-羟基戊基，ω-羟基异戊基，ω-羟基己基，ω-羟基-2-甲基戊基，ω-羟基庚基，ω-羟基-2-甲基己基，ω-羟基辛基，ω-羟基庚基，ω-羟基壬基，ω-羟基-2-甲基辛基，ω-羟基癸基，ω-羟基-2-ω-羟基甲基壬基，ω-羟基十一烷基，ω-羟基十二烷基，ω-羟基十三烷基，ω-羟基十四烷基及ω-羟基十五烷基中的一种；
所述的R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆中的ω-羧基取代的1至50个碳原子的烷基分别或者同时选自ω-羧基甲基，ω-羧基乙基，ω-羧基丙基，ω-羧基异丙基，ω-羧基丁基，ω-羧基异丁基，ω-羧基戊基，ω-羧基异戊基，ω-羧基己基，ω-羧基-2-甲基戊基，ω-羧基庚基，ω-羧基-2-甲基己基，ω-羧基辛基，ω-羧基庚基，ω-羧基壬基，ω-羧基-2-甲基辛基，ω-羧基癸基，ω-羧基-2-ω-羧基甲基壬基，ω-羧基十一烷基，ω-羧基十二烷基，ω-羧基十三烷基，ω-羧基十四烷基及ω-羧基十五烷基中的一种；
所述的R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆中的ω-酯基取代的1至50个碳原子的烷基分别或者同时选自ω-酯基甲基，ω-酯基乙基，ω-酯基丙基，ω-酯基异丙基，ω-酯基丁基，ω-酯基异丁基，ω-酯基戊基，ω-酯基异戊基，ω-酯基己基，ω-酯基-2-甲基戊基，ω-酯基庚基，ω-酯基-2-甲基己基，ω-酯基辛基，ω-酯基庚基，ω-酯基壬基，ω-酯基-2-甲基辛基，ω-酯基癸基，ω-酯基-2-ω-酯基甲基壬基，ω-酯基十一烷基，ω-酯基十二烷基，ω-酯基十三烷基，ω-酯基十四烷基及ω-酯基十五烷基中的一种。

5.  根据权利要求2所述的选择性检测细胞内锌离子的荧光探针，其特征是：所述的R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆中的邻、对、间位1至50个碳原子的烷基苯基分别或者同时是邻、对、间位取代甲基苄基，邻、对、间位取代乙基苄基，邻、对、间位取代丙基苄基或邻、对、间位取代异丙基苄基；
所述的R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆中的邻、对、间位卤代苯基分别或者同时是邻、对、间位氟代苄基，邻、对、间位氯代苄基，邻、对、间位溴代苄基或邻、对、间位碘代苄基；
所述的R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆中的邻、对、间位1至50个碳原子取代的烷氧基苯基分别或者同时是邻、对、间位取代甲氧苄基，邻、对、间位取代乙氧基苄基或邻、对、间位取代丙氧基苄基。

6.  一种根据权利要求1～5任一项所述的选择性检测细胞内锌离子的荧光探针的合成方法，其特征是：
将带有R₁，R₂，R₃、R₄和R₅取代基的香豆素-3-羰基化合物溶于干燥有机溶剂中，回流搅拌下缓慢滴加溶于有机溶剂中的带有R₆取代基的2-肼基吡啶，其中带有R₁，R₂，R₃、R₄和R₅取代基的香豆素-3-羰基化合物与带有R₆取代基的2-肼基吡啶的摩尔比是1∶1～2；回流搅拌反应后过滤，除去有机溶剂，真空干燥后得到式(I)所示的荧光探针；

所述的取代基R₁、R₂、R₃、R₄、R₅及R₆的定义同权利要求1～5任一项所述。

7.  根据权利要求6所述的方法，其特征是：所述的回流搅拌反应时间是1～8小时。

8.  根据权利要求6所述的方法，其特征是：所述的有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、1，2-二氯乙烷、四氢呋喃、甲醇、乙醇、乙醚、乙腈、丙酮、苯及甲苯中的一种以上。

9.  一种根据权利要求1～5任一项所述的选择性检测细胞内锌离子的荧光探针的用途，其特征是：所述的荧光探针用于生物体系中锌离子的检测，生物活细胞和活组织内的锌离子的分析检测和荧光成像检测，以及临床医学上病变组织中锌离子的检测。

选择性检测细胞内锌离子的荧光探针及其合成方法和用途
技术领域
本发明涉及选择性检测细胞内锌离子的荧光探针及其合成方法和用途。
背景技术
锌是人体必需微量元素之一，在人体内的含量仅次于铁而排在第二位。生物体内大部分的锌离子都与蛋白质结合，其在金属蛋白中作为一种辅助因子调控蛋白质或酶的活性。另外锌离子还具有神经调节功能，锌离子能够通过电位调控型离子通道进入细胞，通过金属蛋白(锌指蛋白)来改变染色质的构象或阻断DNA的合成从而影响基因表达。缺锌时可引起神经生长发育受阻，而且会导致性器官发育迟缓，表现为前列腺和精囊发育不全，精子减少，导致性生理机能降低。此外还发现肝硬化患者血清中锌水平降低，尿中锌的排出量增加，肝中含锌量减少。因此在治疗过程中应适当的补充锌。
锌离子的分析测定一般是利用其还原性及其与某些有机试剂发生反应后，用原子吸收光谱法，电化学、分光光度法、化学发光法、催化动力学方法及荧光方法进行分析测定，但这些分析测定方法不能够对生物体内金属离子进行实时、原位动态检测，灵敏度不高并且选择性较差；并且测试样品的预处理较复杂，使得其应用受到了一定的限制。
光化学传感器是近年来迅速发展起来的一个新的科学技术，它的出现显然和超分子科学的进展诸如分子组装、主客体化学、非共价相互作用、氢键作用、疏水作用等以及光诱导电子转移(PET)过程、分子内共轭的电荷转移化合物结构及其发光特性等研究密切相关：它的发展也和许多科学技术领域诸如生物化学、临床医学、药物化学以及环境科学中提出的大量实际问题密切相关。由于上述种种原因，有力的推动了光化学传感器的研究进展。光化学传感器按其信号检测方法的不同，主要分为荧光探针(Fluorescent probe)又称为荧光化学传感器(Fluorescent Chemosensor)和比色化学传感器(Colorimetric Chemosensor)。荧光探针主要是依靠荧光信号为检测手段，通常有荧光的增强、猝灭或者发光波长的移动，而比色化学传感器主要是借助于色调的变化，通过肉眼观察就可以检测，方便实际应用。用于对外来物种进行检测的荧光探针的设计和研究，是近年来受到广泛关注的一个科学技术。荧光探针的检测过程主要是通过器件接受体(Receptor)部分对外来物种(包括阳离子，阴离子及中性分子等)的选择性接纳，然后经不同的作用机制，如光诱导电子转移(PET)或能量转移、金属-配体电荷转移(MLCT)、分子内电荷转移(ICT)，再通过器件的信号报告部分给出有关器件在接纳物种过程中的信息变化。荧光探针由于其有选择性好、灵敏度高、响应时间快等优点，在微量化学物种的检测方面得到了很好的应用。
香豆素类化合物因其较大的摩尔消光系数和高的荧光量子产率，已作为荧光标记物在生物技术方面有一定的应用，但把它作为直接用来识别特定客体的化学传感分子的例子还很少见报道。在本发明中，本发明设计合成了基于香豆素氨基硫脲的衍生物作为选择性检测细胞内锌离子的荧光探针，与前人的工作相比(1，Hirano，T.；Kikuchi，K.；Drano，Y.；Higuchi，T.；Nagano，Y.J.Am.Chem.Soc.，2002，124，6555～6562.；2，Burfrtte，S.C.；Frederickson，C.J.；Bu，W.；Lippard，S.J.J.Am.Chem.Soc.2003，125，1778～1787.)有这样的优点：荧光探针分子对锌离子有识别作用时，使荧光发射有较大的增强，而且可进一步用于细胞内锌离子的荧光成像，这为临床医学中相关疾病的诊断提供了参考。
发明内容
本发明的目的之一在于克服现有荧光探针的性能和结构上的不足之处，提供一种性能优良的选择性检测细胞内锌离子的荧光探针。
本发明的目的之二是提供选择性检测细胞内锌离子的荧光探针的合成方法。
本发明的目的之三是提供选择性检测细胞内锌离子的荧光探针的用途。
本发明的选择性检测细胞内锌离子的荧光探针具有式(I)所示的结构：

式(I)中的R₁，R₂，R₃，R₄，R₅，R₆分别或者同时为氢、烷基、取代烷基或芳基。
所述的R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆中的烷基为：1至50个碳原子的烷基或3至50个碳原子的环烷基。
所述的R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆中的取代烷基为：芳基取代的1至50个碳原子的烷基、ω-羟基取代的1至50个碳原子的烷基、ω-羧基取代的1至50个碳原子的烷基或ω-酯基取代的1至50个碳原子的烷基。
所述的R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆中的芳基为：邻、对、间位1至50个碳原子的烷基苯基，邻、对、间位卤代苯基，邻、对、间位1至50个碳原子取代或未取代的烷氧基苯基或邻、对、间位胺基苯基。
所述的R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆中的1至50个碳原子的烷基分别或者同时选自甲基，乙基，丙基，烯丙基，异丙基，丁基，异丁基，戊基，异戊基，己基，2-甲基戊基，庚基，2-甲基己基，辛基，2-甲基庚基，壬基，2-甲基辛基，癸基，2-甲基壬基，十一烷基，十二烷基，十三烷基，十四烷基及十五烷基中的一种。
所述的R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆中的3至50个碳原子的环烷基分别或者同时选自环丙烷基，环丁烷基，环戊烷基，环己烷基及环庚烷基中的一种。
所述的R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆中的芳基取代的1至50个碳原子的烷基分别或者同时选自芳基甲基，芳基乙基，芳基丙基，芳基烯丙基，芳基异丙基，芳基丁基，芳基异丁基，芳基戊基，芳基异戊基，芳基己基，2-甲基芳基戊基，芳基庚基，2-甲基芳基己基，芳基辛基，芳基2-甲基庚基，芳基壬基，2-甲基芳基辛基，芳基癸基，2-甲基芳基壬基，芳基十一烷基，芳基十二烷基，芳基十三烷基，芳基十四烷基及芳基十五烷基中的一种。
所述的R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆中的ω-羟基取代的1至50个碳原子的烷基分别或者同时选自ω-羟基甲基，ω-羟基乙基，ω-羟基丙基，ω-羟基异丙基，ω-羟基丁基，ω-羟基异丁基，ω-羟基戊基，ω-羟基异戊基，ω-羟基己基，ω-羟基-2-甲基戊基，ω-羟基庚基，ω-羟基-2-甲基己基，ω-羟基辛基，ω-羟基庚基，ω-羟基壬基，ω-羟基-2-甲基辛基，ω-羟基癸基，ω-羟基-2-ω-羟基甲基壬基，ω-羟基十一烷基，ω-羟基十二烷基，ω-羟基十三烷基，ω-羟基十四烷基及ω-羟基十五烷基中的一种。
所述的R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆中的ω-羧基取代的1至50个碳原子的烷基分别或者同时选自ω-羧基甲基，ω-羧基乙基，ω-羧基丙基，ω-羧基异丙基，ω-羧基丁基，ω-羧基异丁基，ω-羧基戊基，ω-羧基异戊基，ω-羧基己基，ω-羧基-2-甲基戊基，ω-羧基庚基，ω-羧基-2-甲基己基，ω-羧基辛基，ω-羧基庚基，ω-羧基壬基，ω-羧基-2-甲基辛基，ω-羧基癸基，ω-羧基-2-ω-羧基甲基壬基，ω-羧基十一烷基，ω-羧基十二烷基，ω-羧基十三烷基，ω-羧基十四烷基及ω-羧基十五烷基中的一种。
所述的R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆中的ω-酯基取代的1至50个碳原子的烷基分别或者同时选自ω-酯基甲基，ω-酯基乙基，ω-酯基丙基，ω-酯基异丙基，ω-酯基丁基，ω-酯基异丁基，ω-酯基戊基，ω-酯基异戊基，ω-酯基己基，ω-酯基-2-甲基戊基，ω-酯基庚基，ω-酯基-2-甲基己基，ω-酯基辛基，ω-酯基庚基，ω-酯基壬基，ω-酯基-2-甲基辛基，ω-酯基癸基，ω-酯基-2-ω-酯基甲基壬基，ω-酯基十一烷基，ω-酯基十二烷基，ω-酯基十三烷基，ω-酯基十四烷基及ω-酯基十五烷基中的一种。
所述的R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆中的邻、对、间位1至50个碳原子的烷基苯基分别或者同时是邻、对、间位取代甲基苄基，邻、对、间位取代乙基苄基，邻、对、间位取代丙基苄基或邻、对、间位取代异丙基苄基。
所述的R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆中的邻、对、间位卤代苯基分别或者同时是邻、对、间位氟代苄基，邻、对、间位氯代苄基，邻、对、间位溴代苄基或邻、对、间位碘代苄基。
所述的R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆中的邻、对、间位1至50个碳原子取代的烷氧基苯基分别或者同时是邻、对、间位取代甲氧苄基，邻、对、间位取代乙氧基苄基或邻、对、间位取代丙氧基苄基。
本发明的选择性检测细胞内锌离子的荧光探针的合成方法是：
将带有R₁，R₂，R₃、R₄和R₅取代基的香豆素-3-羰基化合物溶于干燥有机溶剂中，回流搅拌下缓慢滴加溶于有机溶剂中的带有R₆取代基的2-肼基吡啶，其中带有R₁，R₂，R₃、R₄和R₅取代基的香豆素-3-羰基化合物与带有R₆取代基的2-肼基吡啶的摩尔比是1∶1～2；回流搅拌反应(反应时间是1～8小时)后过滤，除去有机溶剂，真空干燥后得到橙黄色晶体即荧光探针(I)；

所述的取代基R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、的定义同上述发明内容中所述。
所述的有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、1，2-二氯乙烷、四氢呋喃、甲醇、乙醇、乙醚、乙腈、丙酮、苯及甲苯等中的一种以上。
本发明的选择性检测细胞内锌离子的荧光探针可用于生物体系中锌离子的检测，生物活细胞和活组织内的锌离子的分析检测和荧光成像检测，以及临床医学上病变组织中锌离子的检测。
本发明提供了一种以香豆素为母体、用于选择性检测细胞内锌离子的荧光探针。该荧光探针对锌离子有很好的选择性，其它离子对检测没有影响，溶液的荧光强度与锌离子的浓度在1×10^-6M到1×10^-5M的范围内有一定的线性关系，表现出了良好的实际应用性；该系列探针分子结构简单，合成方法简单且效率高，易推广于实际检测。
附图说明
图1a及图1b.本发明实施例1荧光探针(I-1)对锌离子的选择性识别；其中：
图1a是荧光探针与各种金属离子作用的荧光光谱。从图中上方的荧光曲线可看出，荧光探针(I-1)对锌离子Zn²⁺有很专一的荧光增强的识别效果；从图中下方荧光曲线(从上到下依次为：Cd²⁺，Pb²⁺，Ca²⁺，Na⁺，Mg²⁺，Hg²⁺，Fe²⁺，Ni²⁺，Co²⁺，Cu²⁺)可看出，荧光探针(I-1)对其它金属离子几乎没有识别；
图1b是在510nm处荧光探针与各种金属离子作用的荧光强度柱形图。
图2.本发明实施例1中荧光探针(I-1)加入各种金属离子后(从左到右依次为Hg²⁺，Ni²⁺，I-1，Cd²⁺，Zn²⁺，Pb²⁺，Ca²⁺，Mg²⁺，Fe²⁺，Co²⁺，Cu²⁺)的荧光照片。
图3.本发明实施例1中荧光探针(I-1)的荧光强度与锌离子浓度的关系。
图4a及图4b.本发明实施例1中荧光探针(I-1)对锌离子的细胞内成像；其中：
图4a是明场下的HepG2细胞；图4b是在孵育了荧光探针I-1的HepG2细胞中加入锌离子15分钟后的细胞内荧光成像图，细胞呈现出很强的绿色荧光。
具体实施方式
实施例1
5.4g 7-N，N-二甲基香豆素-3-甲基酮溶于10ml二甲基亚砜中，在回流下缓慢滴加4g 2-肼基吡啶溶于100ml乙醇的溶液。回流搅拌反应3小时后过滤，除去二甲基亚砜及乙醇溶剂，真空干燥后得橙色块状晶体(I-1)。
EI-MS，m/e，350.1[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝470nm，Φ＝0.08。

      荧光探针(I-1)的结构
将荧光探针(I-1)分别加入到各种金属离子水溶液中，由图1a，1b可看出荧光探针(I-1)对锌离子Zn²⁺有很专一的荧光增强的识别效果。
荧光探针对锌离子Zn²⁺的选择性识别见图2照片，可以看出加入锌离子后荧光大大增强，而加入其它离子后变化不明显。
荧光探针(I-1)的荧光强度对锌离子浓度的关系见图3。
荧光探针(I-1)能对细胞内的生物活性巯基化合物进行细胞成像，图4a是明场下的HepG2细胞；图4b是在孵育了荧光探针I-1的HepG2细胞中加入锌离子15分钟后的细胞内荧光成像图，细胞呈现出很强的绿色荧光。
实施例2
5.6g 7-N，N-二甲基香豆素-3-甲基酮溶于10ml四氢呋喃中，在回流下缓慢滴加7g 2-肼基-4-甲氧基吡啶溶于100ml乙腈的溶液。回流搅拌反应5小时后过滤，除去四氢呋喃及乙腈溶剂，真空干燥后得橙色块状晶体(I-2)。
EI-MS，m/e，380.1[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝470nm，Φ＝0.08。

   荧光探针(I-2)的结构
实施例3
5.4g 7-N，N-二甲基香豆素4-乙基-3-醛溶于10ml乙醇中，在回流下缓慢滴加4g 2-肼基吡啶溶于200ml乙醇的溶液。回流搅拌反应5小时后过滤，除去乙醇溶剂，真空干燥后得橙色块状晶体(I-3)。
EI-MS，m/e，363.1[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝478nm，Φ＝0.12。

    荧光探针(I-3)的结构
实施例4
5.8g 7-N，N-二(ω-羧基丙基)香豆素-3-醛溶于10ml四氢呋喃中，在回流下缓慢滴加7g 2-肼基吡啶溶于100ml乙腈的溶液。回流搅拌反应3小时后过滤，除去四氢呋喃及乙腈溶剂，真空干燥后得橙色块状晶体(I-4)。
EI-MS，m/e，424.1[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝471nm，Φ＝0.1。

   荧光探针(I-4)的结构
实施例5
5.4g 7-N，N-二戊基香豆素-3-醛溶于10ml乙醇中，在回流下缓慢滴加4g 2-肼基吡啶溶于200ml乙醇的溶液。回流搅拌反应5小时后过滤，除去乙醇溶剂，真空干燥后得橙色块状晶体(I-5)。
EI-MS，m/e，420.1[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝480nm，Φ＝0.18。

    荧光探针(I-5)的结构
实施例6
8g 7-N，N-二(ω-甲酯基戊基)香豆素-3-醛溶于10ml二甲基亚砜中，在回流下缓慢滴加8g 2-肼基-4-乙基吡啶溶于100ml乙腈的溶液，回流搅拌反应8小时后过滤，除去二甲基亚砜及乙腈溶剂，真空干燥后得橙色片状晶体(I-6)。
EI-MS，m/e，536.1[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝471nm，Φ＝0.1。

   荧光探针(I-6)的结构
实施例7
8g 7-N，N-二(ω-羟基丙基)香豆素4-甲基-3-醛溶于10ml乙腈中，在回流下缓慢滴加8g 2-肼基-3-乙基吡啶溶于100ml乙醇的溶液，回流搅拌反应7小时后过滤，除去乙腈及乙醇溶剂，真空干燥后得橙色片状晶体(I-7)。
EI-MS，m/e，468.1[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝471nm，Φ＝0.1。

  荧光探针(I-7)的结构
实施例8
7.3g 7-N，N-二(烯丙基)香豆素-3-醛溶于10ml二甲基亚砜中，在回流下缓慢滴加7.8g 2-肼基-4-乙基吡啶溶于100ml乙醇的溶液，回流搅拌反应3小时后过滤，除去二甲基亚砜及乙醇溶剂，真空干燥后得橙色固体(I-8)。
EI-MS，m/e，388.2[M+1]⁺λ^ab._max/nm＝475nm，Φ＝0.11。

   荧光探针(I-8)的结构
实施例9
10g 7-N，N-二(对氯苄基)香豆素-3-醛溶于10ml N，N-二甲基甲酰胺中，在回流下缓慢滴加13g 2-肼基-4-苯基吡啶溶于100ml三氯甲烷的溶液。回流搅拌反应4小时后过滤，除去N，N-二甲基甲酰胺及三氯甲烷溶剂，真空干燥后得橙色片状晶体(I-9)。
EI-MS，m/e，604.1[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝479nm，Φ＝0.13。

  荧光探针(I-9)的结构
实施例10
7.8g 7-N，N-二(对乙氧苄基)-4-乙氧基香豆素-3-醛溶于10ml N，N-二甲基甲酰胺中，在回流下缓慢滴加7g 2-肼基-4-叔丁基吡啶溶于100ml乙腈的溶液。回流搅拌反应5小时后过滤，除去N，N-二甲基甲酰胺及乙腈溶剂，真空干燥后得橙色片状晶体(I-10)。
EI-MS，m/e，672.2[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝475nm，Φ＝0.09。

  荧光探针(I-10)的结构
实施例11
7.6g 7-N，N-二(对氟苄基)-4-乙氧基香豆素-3-醛溶于10ml乙醇中，在回流下缓慢滴加6.5g 2-肼基吡啶溶于100ml三氯甲烷的溶液。回流搅拌反应8小时后过滤，除去乙醇及三氯甲烷溶剂，真空干燥后得橙色片状晶体(I-11)。
EI-MS，m/e，540.2[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝475nm，Φ＝0.1。

  荧光探针(I-11)的结构
实施例12
7.9g 7-N，N-二环戊烷基-4-乙氧基香豆素-3-醛溶于10ml乙醇中，在回流下缓慢滴加7.2g 2-肼基-4-丙基吡啶溶于100ml乙腈的溶液。回流搅拌反应8小时后过滤，除去乙醇及乙腈溶剂，真空干燥后得橙色片状晶体(I-12)。
EI-MS，m/e，502.3[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝485nm，Φ＝0.1。

  荧光探针(I-12)的结构
实施例13
7.9g 7-N，N-二(环己烷基)-4-乙氧基香豆素-3-醛溶于10ml N，N-二甲基甲酰胺中，在回流下缓慢滴加8g 2-肼基-4-丙氧基)吡啶溶于100ml三氯甲烷的溶液。回流搅拌反应4小时后过滤，除去N，N-二甲基甲酰胺及三氯甲烷溶剂，真空干燥后得橙色片状晶体(I-13)。
EI-MS，m/e，532.2[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝487nm，Φ＝0.11。

  荧光探针(I-13)的结构
实施例14
10g 7-N，N-二苄基-4-甲氧基香豆素-3-甲基酮溶于10ml三氯甲烷中，在回流下缓慢滴加12g 2-肼基-3-乙基吡啶溶于100ml乙腈的溶液。回流搅拌反应4小时后过滤，除去三氯甲烷及乙腈溶剂，真空干燥后得橙色片状晶体((I-14)。
EI-MS，m/e，518.2[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝475nm，Φ＝0.07。

  荧光探针(I-14)的结构
实施例15
11g 7-N，N-二(对甲氧苄基)-4-甲氧基香豆素-3-醛溶于10ml N，N-二甲基甲酰胺中，在回流下缓慢滴加13g 2-肼基-3-乙基吡啶溶于100ml乙腈的溶液。回流搅拌反应4小时后过滤，除去N，N-二甲基甲酰胺及乙腈溶剂，真空干燥后得橙色片状晶体(I-14)。
EI-MS，m/e，388.2[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝472nm，Φ＝0.08。

  荧光探针(I-15)的结构
应当理解，所附权利要求概括了本发明的范围，在本发明构思的引导下，本领域的技术人员应意识到，对本发明的各实施例方案所进行的一定的改变，都将被本发明的权利要求书的精神和范围所覆盖。