预测和/或诊断发展成胃癌危险性的方法 【技术领域】
本发明涉及预测癌症危险性的方法，尤其是诊断和/或预测幽门螺杆菌感染者发展成胃癌危险性的方法。发明背景
目前认为，幽门螺杆菌感染是发生胃癌的重要因素之一。约30％的人被感染并发生慢性胃炎。以上情况常会并发胃溃疡或十二指肠溃疡，也可能表现为非溃疡性消化不良。相当多的带菌者是无症状的。然而，少数幽门螺杆菌感染者却逐步(经上皮细胞化生和消化不良等一系列阶段)恶化成了肿瘤。导致这种恶化的原因很复杂，但与地域、环境及遗传因素有关。特别重要的是宿主应答性。目前的证据支持这样的理论，即特定T细胞即Th1应答(其特征在于产生γ干扰素(γIFN)但不产生白介4(IL-4))促进粘膜损伤。也可能发生Th0应答，这包括以上细胞因子(γIFN和IL-4)生产平衡，因而有助于保护粘膜免受损伤。目前还没有有关肿瘤形成及发展相关粘膜细胞因子应答模式的论述。目前对幽门螺杆菌感染的处理方法
幽门螺杆菌是导致慢性胃炎和消化性溃疡的一系列事件中的重要因素。用抗生素根除感染对消化性溃疡的治愈率是80-90％。一种已广泛认可的治疗范例是以抗体试验检测感染为基础，不预先进行內窥镜诊断而直接采用抗生素治疗。在根除性治疗前的內窥镜检查一般用于出现“危险”症状(例如严重疼痛，出血等)或明显存在发生胃癌危险的时候。然而，內窥镜本身具有危险性，因此应尽可能避免采用。
目前还没有对幽门螺杆菌感染者进行胃癌预测或诊断的非侵害性检测。对于中度症状但归为“高危”人群的对象和必须进行內窥镜检查并承受其风险的对象来说，这样地检测特别有意义。即使在具有“危险症状”而仍然需要內窥镜检查的对象中，这样的非侵害性检测也可用作辅助诊断工具。这种方法上的改变将对医疗保健行业产生重大影响。
本发明目的之一就是要克服或减轻现有技术缺陷至少其一，即提供另一种有用的选择。
发明概述
出人意料的发现是：在发生胃癌或癌前损伤(化生和消化不良)的幽门螺杆菌感染者中，抗幽门螺杆菌粘膜IgG2抗体和γIFN水平降低，IL-4水平升高。这些改变也会反映在此类对象的血液中。但是，在胃粘膜被幽门螺杆菌感染的其他疾病中则没有这样的改变。
首先，本发明提供了以下诊断和/或确定螺杆菌感染者发展成胃癌危险性的方法，该方法包括：
a)检测对象的抗幽门螺杆菌IgG2抗体水平；
b)将以上抗幽门螺杆菌IgG2抗体水平与预定的对照水平相比，该水平低于对照说明发展成胃癌的危险性存在和/或升高。
其次，本发明提供了以下诊断和/或确定螺杆菌感染者发展成胃癌危险性的方法，该方法包括：
a)检测对象的γIFN水平；
b)将以上γIFN水平与预定的对照水平相比，该水平低于对照说明发展成胃癌的危险性存在和/或升高。
第三，本发明提供了以下诊断和/或确定螺杆菌感染者发展成胃癌危险性的方法，该方法包括：
a)检测对象的IL-4水平；
b)将以上IL-4水平与预定的对照水平相比，该水平高于对照说明发展成胃癌的危险性存在和/或升高。
第四，本发明提供了一种诊断和/或确定螺杆菌感染者发展成胃癌危险性的方法，该方法包括将第一，和/或第二，和/或第三种方法相互联用。
第五，本发明提供了一种诊断和/或确定螺杆菌感染者发展成胃癌危险性的方法，该方法包括将以上第二与第三种方法联用。
所述螺杆菌感染最好是幽门螺杆菌感染。
测定的是诸如血液、唾液、胃液等生物液样品中的抗幽门螺杆菌IgG2抗体、γIFN和/或IL-4水平。
所述抗幽门螺杆菌IgG2抗体、γIFN和/或IL-4水平测定可同时作为反映幽门螺杆菌感染情况的方法，或与这样的方法联用。
最好通过近体试验(near-subjectassay)中检测所述抗幽门螺杆菌IgG2抗体、γIFN和/或IL-4。然而，该试验也可以是实验室试验。较好的是，所述试验为抗体试验，但是其他已知检测方法也同样可用且有效。所述试验最好是ELISA。
第六，本发明提供了以下诊断和/或确定螺杆菌感染者发展成胃癌危险性的方法，该方法包括：
a)检测对象血液中抗幽门螺杆菌IgG2抗体、γIFN和/或IL-4产生细胞的频率；
b)将以上抗幽门螺杆菌IgG2抗体、γIFN和/或IL-4产生细胞频率与预定的对照水平相比，对象的抗幽门螺杆菌IgG2抗体和/或γIFN产生细胞频率低于对照，和/或IL-4产生细胞频率高于对照说明发展成胃癌的危险性存在和/或升高。
本领域技术人员都知道，可纯化血液以富集白细胞，然后进一步将此白细胞群分离成特定细胞群。
较好的是，在检测抗幽门螺杆菌IgG2抗体、γIFN和/或IL-4前，用幽门螺杆菌刺激抗幽门螺杆菌IgG2抗体、γIFN和/或IL-4产生细胞。
第七，本发明提供了以下诊断和/或确定螺杆菌感染者发展成胃癌危险性的方法，该方法包括：
a)检测对象胃粘膜上抗幽门螺杆菌IgG2抗体、γIFN和/或IL-4产生细胞的频率；
b)将以上抗幽门螺杆菌IgG2抗体、γIFN和/或IL-4产生细胞频率与预定的对照水平相比，对象的抗幽门螺杆菌IgG2抗体和/或γIFN产生细胞频率低于对照，和/或IL-4产生细胞频率高于对照说明发展成胃癌的危险性存在和/或升高。
所述细胞最好来自组织活检样本。
抗幽门螺杆菌IgG2抗体、γIFN和/或IL-4产生细胞最好用流式细胞计数法检测。
可以用正常个体即无幽门螺杆菌感染的个体的生物液样品，或用患有未并发慢性胃炎或无症状的幽门螺杆菌感染者的样品来确立抗幽门螺杆菌IgG2抗体、γIFN和/或IL-4的对照水平。某些时候，对于进行预后随访的对象，对照水平可以是内部的，即对象自身的对照水平。
本发明方法还可通过检测抗幽门螺杆菌IgG2抗体、γIFN和/或IL-4来诊断和/或确定发生诸如化生或消化不良等癌前损伤的危险性。
本领域技术人员可以看出，可将抗幽门螺杆菌IgG2抗体、γIFN和/或IL-4与其他参数(例如抗幽门螺杆菌IgG抗体总量)之比用作胃的癌变前期或癌性病变(包括化生和消化不良)的指标或用于其诊断。对癌变前期或癌性病变更精确的预测和/或诊断需要使用特定的比值，例如IL-4∶γIFN之比，IgG2∶总IgG之比或IgG2∶IgG1之比。也可采用其他比值。
本发明说明书中，“γIFN”与“IFNγ”混用，都表示细胞因子γ干扰素。附图简述
图1：胃癌或癌前损伤(化生或消化不良)患者胃粘膜培养物上清液中的IL-4检测。在未并发幽门螺杆菌感染(或良性消化性溃疡)中可观察到细胞因子(例如γIFN)的Th1应答方式。
图2显示粘膜活检样本中的IL-4分泌与幽门螺杆菌抗原刺激后血液T细胞之间高度相关。没有接收处理的、未并发性慢性胃炎的幽门螺杆菌感染者的抗原激发T细胞不分泌IL-4。
图3：幽门螺杆菌感染者胃粘膜中的细胞因子(IL-8，IL-4和γIFN)的产生。
图4：患各种胃肠疾病的幽门螺杆菌感染者血清中的抗幽门螺杆菌IgG1和IgG2水平。
图5：患各种胃肠疾病的幽门螺杆菌感染者血清中的抗幽门螺杆菌IgG1和IgG2水平。优选实施方式
以下将更详细的描述本发明，但并非对本发明的限定。
已知，可将血液和胃粘膜中的抗幽门螺杆菌IgG总水平作为幽门螺杆菌感染情况的指标。所以，在以下实施例中，在用抗幽门螺杆菌IgG作为幽门螺杆菌感染情况常规指标的同时，本发明还包括用IgG2亚类测得值作为胃癌预测指标或用于其诊断。
检测人样品中细胞因子和抗体的方法是本领域熟知的，所用方法和试剂可方便地获得。有些可用的技术如后文所述，用来说明如何进行某些测定。
除非另做说明，所用的都是标准教科书和实验室手册中的各种标准技术。实施例1：测定血样中的细胞因子和抗体水平
标准试验包括：用抗IL-4单克隆抗体(MoAb)包被96孔微滴板的微孔。去除抗体并用PBS/Tween20洗涤后，在含有100μl AIM-V培养基的各孔中加入100μl全血。37℃孵育24小时后，分离出血浆上清液，用ILISA检测γIFN(图1)。用ELISA法测定各孔中被IL-4 MoAb俘获的IL-4量(图1和图2)。用ELISA法测定凝血的血清或上述血浆上清液中的抗幽门螺杆菌IgG1和IgG2亚类水平，或IgG2/IgG之比(图4和图5)。试验前，所有样品保存于-80℃。单独测定IL-4或同时测定IL-4和抗幽门螺杆菌IgG抗体的试验系统
用含2μg/ml抗IL-4单克隆捕捉抗体的pH8.5碳酸氢钠溶液包被96孔平底微滴板的各孔。去除抗体溶液后，在各孔中加入等量的新鲜收集的全血。37℃孵育24小时后，分离血浆上清液，通过与生物素化抗IL-4抗体和链霉亲和素-过氧化物酶偶联物的反应检测结合的IL-4。在读板仪中，使用合适的标准，根据显色测定IL-4量。
在同一板上，将血浆上清液加入以4μg/ml幽门螺杆菌包被的孔，可同时用ELISA试验检测抗幽门螺杆菌IgG抗体。结果见表1。
表1：全血中的IL-4产生和抗幽门螺杆菌IgG抗体
对象 IL-4产生(pg/ml) 抗幽门螺杆菌IgG
(ELISA指数)
S1 42.77 0.696
S2 9.4 1.61
S3 13.49 1.86
S4 108.25 0.95
S5 9.4 1.83
S6 18.1 0.67
S7 9.4 4.32
S8 19.41 3.22
S9 56.64 3.48
S10 15.1 3.42
S11 9.4 0.12实施例2：胃粘膜内的IL-4和γIFN产生细胞频率
从內窥镜检查获得的活检样本中分离胃T细胞。用1mM二硫苏糖醇和1mMEDTA洗涤这些组织以去除上皮细胞和上皮内细胞，然后用含40U胶原酶(Worthington Biochemical)的无血清AIM-V培养基萃取层间T细胞2-3小时。根据台盼蓝排除法，去除杂质后单核细胞的活度在90％以上。分离自个体样品的胃单核细胞通常因太少(约0.503×105个细胞/份样品)而无法进行大规模的抗原介导的再刺激。于是测定各份分离细胞中的IL-4和γIFN产生细胞频率：进行细胞内染色，然后在FACS Vantage上用3色流式细胞计数法进行分析。分离的胃细胞用PMA和PMA加离子霉素激活，用PerCP-CD3单克隆抗体(Becton Dickinson)染色，然后用上述FITC-γIFN和PE-IL-4单克隆抗体进行胞内染色。
除非另做说明，所用的都是标准实验室教科书中的标准技术。
表2例举了可基于上述检测做出的预测/诊断。
表2抗幽门螺杆菌IgG+veIL-4-ve低患癌危险性只有年龄性征兆的，不需要內窥镜检查抗幽门螺杆菌IgG+veIL+4-ve高患癌危险性需要进行內窥镜检查作为早期干预抗幽门螺杆菌IgG-veIL-4-ve没有幽门螺杆菌感染迹象实施例3：外周血中的IL-4和γIFN产生细胞频率
用胞内细胞因子染色和流式细胞计数法估测不同对象的IL-4和γIFN产生细胞频率。这可以在因每份样品分离细胞数过低而无法在抗原再刺激后用限制稀释法迹象分析时对从胃组织样本中获得的结果进行比较。外周血单核细胞或全血用佛波豆蔻酸乙酸酯(PMA，50ng/ml)和1μM离子霉素在2μM莫能菌素存在下活化4-5小时，固定，透化，并用FITC/PE标记的γIFN/IL-4(Bectin-Dickinson)染色。然后以匹配的同型IgG为对照，用流式细胞计数法分析γIFN/IL-4频率，并就淋巴细胞进行选通。
表3和表4列举了有或无幽门螺杆菌感染对象外周血中的IL-4和γIFN产生细胞频率。幽门螺杆菌感染者的γIFN∶IL-4产生细胞之比高于无感染者。
用Hp重组抗原(Hp0310柠檬酸合成酶)刺激短期培养物，然后用限制稀释法定量测定血液中循环IL-4和γIFN产生细胞频率。用非保护性重组抗原Hp-0162作为阴性对照。将细胞接种在V形底96孔微滴板上，用两倍稀释法从105稀释至2.5×103，每一细胞浓度一式24孔。培养物用预定浓度的柠檬酸合成酶或Hp0310抗原在rIL-2(5U/ml)存在下进行3天的刺激。对照为不含应答细胞，或培养于无抗原培养基和rIL-2中的应答细胞。因为IL-4不稳定，所以采用了一种抗体捕捉法，其中用配对抗体(Engogen/CSL)通过ELISA检测结合的IL-4。用标准方法检测上清液中的γIFN。用合法软件，用最大似然估计法计算产生IL-4和γIFN的外周血单核细胞频率。
表3：抗幽门螺杆菌抗体阳性对象中的细胞因子产生细胞
对象 γIFN％ IL-4％ γIFN∶IL-4之比
S1 18.3 2.5 7.3
S2 25.4 3.3 7.6
S3 26.0 11.5 2.3
S4 9.6 2.6 3.7
S5 14.8 5.6 2.6平均值±SE 4.7±1.15*
表4：抗幽门螺杆菌抗体阴性对象中的细胞因子产生细胞
对象 γIFN％ IL-4％ γIFN∶IL-4之比
S6 24.8 28.3 0.9
S7 8.9 3.0 3.0
S8 8.1 2.6 3.1
S9 29.9 29.1 1.0
S10 25.9 17.2 1.5平均值±SE 1.9±0.48*P＝0.054
图1至图5是用对返流、胃炎、十二指肠溃疡、胃溃疡和胃癌等不同胃肠道疾病患者进行研究所得的结果。图本身说明并反映出：IgG2、γIFN和IL-4水平可作为幽门螺杆菌感染者患胃癌的预测指标或用于相应诊断。
虽然以上通过具体实施例对本发明进行了描述，但是本领域技术人员可以看出，在本发明范围内，本发明还可以有多种其他实施方式。