一种香豆素的制备方法 【技术领域】
本发明属于中药制药技术领域， 涉及香豆素的制备方法。背景技术 香豆素类药物是一类口服抗凝药物。它们的共同结构是 4- 羟基香豆素。同时， 双香豆素还可以用于对付鼠害。当初人们在牧场牲畜因抗凝作用导致内出血致死的过程 中发现的双香豆素， 意识到了这一类物质的抗凝作用， 引起了之后对香豆素类药物的研究 和合成， 从而为医学界提供了多一种重要的凝血药物。常见的香豆素类药物有双香豆素 (dicoumarol)、 华法林 (warfarin， 苄丙酮香豆素 ) 和醋硝香豆素 (acenocoumarol， 新抗 凝 )。
香豆素类药物的作用是抑制凝血因子在肝脏的合成。香豆素类药物与维他命 K 的 结构相似。香豆素类药物在肝脏与维他命 K 环氧化物还原酶结合， 抑制维生素 K 由环氧化 物向氢醌型转化， 维生素 K 的循环被抑制。可以说香豆素类药物是维生素 K 拮抗剂， 或者是 竞争性抑制剂 ( 参见酶 )。含有谷氨酸残基的凝血因子 II、 VII、 IX、 X 的羧化作用被抑制， 而其前体是没有凝血活性的， 因此凝血过程受到抑制。但它对已形成的凝血因子无效。 。表 现在 (1) 在体内具抗癌活性， 并能促进人体的免疫功能 ； 所含香豆素对肉瘤 S-180 的抑制效 率可达 96.88％。 (2) 浸剂对正常兔作腹腔注射有利尿作用 ； 乙醚或乙醇提取物能使离体蛙 心收缩加强， 对家兔血糖则先使升高而后降低。(3) 茯神煎剂对小鼠有镇静作用， 茯苓的镇 静作用次于茯神。[ 药性 ] 甘、 淡、 平、 归肺、 胃、 肾经。败毒抗癌、 利水化饮、 健脾宁心。利水 渗湿， 健脾， 化痰， 宁心安神。
香豆素 (Pachymaran) 来源于多孔菌科真菌茯苓 (Poriacocos Wolf)。有健脾健 肾、 宁心安神等功效。现代药理学作用表明， 香豆素能增强人体免疫功能， 提高人体抗病能 力， 起到防病、 延缓衰老的作用。选择适合茯苓的提取方法， 最大限度的提取茯苓的有效成 分是研究茯苓药理作用的基础。现有两种最新的提取方法， 能使水溶性多糖的提取率得到 明显的提高。
发明内容
本发明采用的技术方案如下 ：
一种香豆素的制备方法， 其特征在于， 以如下的方法制备 ：
(1) 称取茯苓切片后粉碎， 加入 3-12 倍重量份数的水， 回流提取 2-3 次， 在料液比 1 ∶ 40， 提取温度 40-95℃， 提取 30-60min/ 次合并提取液滤过， 除去不溶性杂质 ；
(2) 取提取液减压蒸馏浓缩， 浓缩液边搅拌边加入乙醇， 使含醇量达到 80 ％， 静 置， 过滤， 收集沉淀。
本发明所述的制备方法， 其中提取温度为 40℃。
本发明所述的制备方法， 其中提取时间为 30min/ 次。
本发明所述的制备方法， 其中加入 95％乙醇。本发明的目的是实验设计优化香豆素的提取方法和工艺条件。 方法利用单因素实 验优化香豆素的提取方法， 在单因素实验的基础上利用响应表面实验设计考察碱法提取过 程中碱浓度、 提取时间、 料液比对多糖提取量的影响。 结果香豆素中多糖的最佳提取方法为 碱法提取， 其提取条件可用回归方程 Y ＝ 7.89+15.249X1-35.4X12+8.375X2-0.885X22+7.3 33X1X2 描述。结论最佳提取方法为碱法， 最佳提取工艺条件为 ： NaOH 浓度 0.84mol/L， 时间 8.89h， 料液比 1 ∶ 150。
器材
1、 A 主要仪器 UV752 型可见紫外分光光度计 ； JJ 系列电子天平 ； 赛多利斯 BS 系列 电子天平 ； HH·S 型电热恒温水浴锅 ； HS10260D 超声波提取器 ； XYJ802 离心沉淀机。
B 香豆素云南思茅地区加工茯苓白块所切削的茯苓皮干品， 粉碎备用。
C 主要试剂浓硫酸、 氢氧化钠、 苯酚、 无水葡萄糖均为国产分析纯。苯酚溶液 ： 称取 苯酚 6g， 加水至 100ml 即得。葡萄糖标准液 ： 精密称取 105℃下干燥恒重的葡萄糖 100.3mg 加蒸馏水溶解并定容至 100ml。
2、 方法与结果
A 香豆素测定采用硫酸苯酚的方法测定。 B 水提法称取一定量茯苓皮， 在料液比一定的条件下， 考察提取次数、 提取时间和 提取温度与香豆素提取量的关系。
C 超声波提取法称取一定量茯苓皮， 在料液比一定的条件下， 考察超声提取时间和 提取温度与多糖提取量的关系。
D 碱法提取多糖称取一定量香豆素， 在料液比一定的条件下， 室温提取 30min， 考 察碱浓度与多糖提取量的关系。
E 水提法
(1) 提取次数的考察称取一定量香豆素， 在料液比 1 ∶ 40， 提取温度 95 ℃， 提取 30min/ 次的条件下， 考察提取次数与香豆素提取量的关系。茯苓皮提取的多糖量随累积提 取次数的增加而增加， 但从第 2 次开始提取的多糖量并迅速减小， 综合考虑提取过程中的 能耗、 水耗等因素， 宜采用一次提取。
(2) 提取时间的考察称取一定量茯苓皮， 在料液比 1 ∶ 40， 提取温度 95℃， 提取一 次的条件下， 考察不同提取时间与多糖提取量的关系。在 10 ～ 20min 之间， 香豆素多糖的 提取量随提取时间的增加快速增加， 20min 之后则变化缓和， 故提取时间以 20 ～ 30min 为 宜。
(3) 提取温度的考察称取一定量茯苓皮， 在料液比 1 ∶ 40， 提取时间 30min， 浸提一 次的条件下， 考察提取温度与多糖提取量的关系。 茯苓皮中多糖提取量在 20 ～ 40℃之间随 提取温度的增加而增加， 温度高于 40℃后则呈下降趋势， 60 ～ 80℃之间变化不大， 在沸腾 状况 (95℃ ) 下原料处于不断运动状态， 其多糖提取量有所上升， 提示搅拌使茯苓皮不断运 动有利于多糖的提取， 故宜选用 40℃搅拌提取。
F 超声波提取法
(1) 超声提取时间的考察称取一定量茯苓皮， 在料液比 1 ∶ 40， 超声频率 40kHz， 超 声提取一次的条件下， 考察超声提取时间与多糖提取量的关系。 ， 茯苓皮多糖提取量随超声 时间的增加而增大， 当提取时间达到 30min 后， 提取时间对提取量的影响减小， 曲线变得较
平缓。故一次超声提取的时间以 30min 为宜。
(2) 超声提取次数的考察称取一定量茯苓皮， 在料液比 1 ∶ 40， 超声频率 40kHz， 超 声提取 30min/ 次的条件下， 考察超声提取次数与多糖提取量的关系。
G 碱法提取称取一定量茯苓皮， 在料液比 1 ∶ 200， 室温浸提 30min 条件下， 考察碱 浓度与多糖提取量的关系。结果表明茯苓皮多糖提取量在 NaOH 浓度 0.25 ～ 0.5mol/L 之 间呈上升趋势， 当浓度大于 0.5mol/L 以后呈下降趋势， 故宜选 NaOH 浓度为 0.5mol/L 为中 心点进行二次旋转正交组合实验。
H 二次旋转正交组合实验为了全面分析碱提过程中各因素交互作用对茯苓皮提取 过程的影响， 在料液比 1 ∶ 150 条件下， 本研究采用 23 旋转响应表面实验设计进行， 影响因 子为 NaOH 浓度、 浸提时间， 结果指标为茯苓皮的多糖提取量。实验结果采用二次回归分析 和方差分析， 根据回归方程得出适宜的碱提工艺条件。
用两因子二次旋转正交组合实验统计程序对表 2 结果进行回归分析和方差分析， 得到以多糖提取量为指标， 以 NaOH 浓度 X1(mol/L) 和提取时间 X2 为变量的二次回归方程 及其方差分析结果 ( 见表 3)， 结果表明茯苓皮多糖碱浸提中， 在 α ＝ 0.05 水平上对多糖提 取量影响显著的因素是 X1、 X2 的一次作用， X2 的二次作用及 X1X2 的交互作用 (P ＜ 0.05)。
香豆素类药物是一类口服抗凝药物。它们的共同结构是 4- 羟基香豆素。同时， 双 香豆素还可以用于对付鼠害。 当初人们在牧场牲畜因抗凝作用导致内出血致死的过程中发 现的双香豆素， 意识到了这一类物质的抗凝作用， 引起了之后对香豆素类药物的研究和合 成， 从而为医学界提供了多一种重要的凝血药物。
常见的香豆素类药物有双香豆素 (dicoumarol)、 华法林 (warfarin， 苄丙酮香豆 素 ) 和醋硝香豆素 (acenocoumarol， 新抗凝 )。
香豆素类药物的作用是抑制凝血因子在肝脏的合成。香豆素类药物与维他命 K 的 结构相似。 香豆素类药物在肝脏与维他命 K 环氧化物还原酶结合， 抑制维生素 K 由环氧化物 向氢醌型转化， 维生素 K 的循环被抑制。可以说香豆素类药物是维生素 K 拮抗剂， 或者是竞 争性抑制剂 ( 参见酶 )。含有谷氨酸残基的凝血因子 II、 VII、 IX、 X 的羧化作用被抑制， 而 其前体是没有凝血活性的， 因此凝血过程受到抑制。但它对已形成的凝血因子无效。多糖 碱浸提过程中， NaOH 浓度 X1、 浸提时间提 X2 的一次作用、 二次作用、 交互作用对多糖提取量 影响的数学模型为 ： Y ＝ 7.8899+15.248 8X1-35.3996X12+8.372 6X2-0.884 7X22+7.3333 X1X2。该数学模型的相关系数 0.967 7， 标准误差 3.792 1， 方差分析结果显著 (P ＜ 0.05， 见表 3)， 可用于预测茯苓皮多糖碱浸提过程中的多糖提取量。各因素对茯苓皮多糖提取量 的表面应答图及其等高线图见图 8。
3 结论
以香豆素提取量为指标， 比较水提法、 超声波提取法和碱提取法， 茯苓皮中香豆素 的提取宜用碱法提取。茯苓皮碱浸提过程中， NaOH 浓度 X1 及浸提时间 X2 对多糖提取量 影响的数学模型为 ： Y ＝ 7.8899+15.248 8X1-35.399 6X12+8.372 6X2-0.884 7X22+7.333 3X1X2。通过方程预测得到最佳碱浸提工艺条件为 ： NaOH 浓度 X1 ： 0.84mol/L， 时间 X2 ： 8.89h。此条件下香豆素多糖提取量达 54.99％。具体实施方式
以下实施例用来帮助理解本发明， 并且不用于也不应被解释为以任何方式对所列 出的权利要求中发明的限制。其中原料可以参考实施例的方法制备或在市面上购买。
实施例 1
(1) 称取香豆素 500g 切片后粉碎， 加入 12 倍重量份数的水， 回流提取 3 次， 在料液 比 1 ∶ 40， 提取温度 40℃， 提取 30min/ 次合并提取液滤过， 除去不溶性杂质 ；
(2) 取提取液减压蒸馏浓缩， 浓缩液边搅拌边加入 95％乙醇， 使含醇量达到 80％， 静置， 过滤， 收集沉淀得到香豆素， 茯苓皮中多糖提取量达 54.99％。
实施例 2
(1) 称取香豆素 500g 切片后粉碎， 加入 10 倍重量份数的水， 回流提取 2 次， 在料液 比 1 ∶ 40， 提取温度 80℃， 提取 60min/ 次合并提取液滤过， 除去不溶性杂质 ；
(2) 取提取液减压蒸馏浓缩， 浓缩液边搅拌边加入 95％乙醇， 使含醇量达到 80％， 静置， 过滤， 收集沉淀得到香豆素， 茯苓皮中多糖提取量达 55.9％。
实施例 3
在每 1000 毫升注射液中加入香豆素 500mg， 吐温 -80 30g， 余量为氯化钠等渗溶 液。 加入少量活性炭加热搅拌， 压滤， 滤液经微孔滤膜过滤， 滤液补足注射用水， 混匀， 灌封， 灭菌配成注射液。 实施例 4
在每 1000 毫升注射液中加入香豆素 150mg， 吐温 -80 10g， 余量为等渗氯化钾溶 液。 加入少量活性炭加热搅拌， 压滤， 滤液经微孔滤膜过滤， 滤液补足注射用水， 混匀， 灌封， 灭菌配成注射液。
实施例 5
在每 1000 毫升注射液中加入香豆素 200mg， 吐温 -80 15g， 余量为等氯化镁渗溶 液。 加入少量活性炭加热搅拌， 压滤， 滤液经微孔滤膜过滤， 滤液补足注射用水， 混匀， 灌封， 灭菌配成注射液。
实施例 6
在每 1000 毫升注射液中加入香豆素 280mg， 吐温 -80 25g， 余量为注射用水。加入 少量活性炭加热搅拌， 压滤， 滤液经微孔滤膜过滤， 滤液补足注射用水， 混匀， 灌封， 灭菌配 成注射液。
实施例 7
在每 1000 毫升注射液中加入香豆素 300mg， 吐温 -80 18g， 余量为乳酸钠等渗溶 液。 加入少量活性炭加热搅拌， 压滤， 滤液经微孔滤膜过滤， 滤液补足注射用水， 混匀， 灌封， 灭菌配成注射液。
实施例 8
在每 1000 毫升注射液中加入香豆素 400mg， 吐温 -80 28g， 余量为注射用水。加入 少量活性炭加热搅拌， 压滤， 滤液经微孔滤膜过滤， 滤液补足注射用水， 混匀， 灌封， 灭菌配 成注射液。
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