干细胞增生的抑制剂及其应用 【发明领域】
本发明涉及干细胞增生抑制剂在治疗人或动物的自身免疫性疾病、衰老、癌症、脊髓发育不良、前白血病、白血病、牛皮癣或与过度增生状况有关的其它疾病时在调节干细胞周期中的应用。本发明还涉及治疗准备或正在遭遇化疗剂或其他损害循环干细胞的制剂或暴露于辐射的人或动物的方法。最后，本发明涉及为了进行自体或异体移植或基因转移而改善干细胞的维持或培养物的扩充。发明背景
更新系统的大多数终末细胞是短寿期的，在整个寿命中必须被不断地更新替换。例如，血细胞起源于多能造血干细胞(HSC)的自我更新细胞群。因为造血干细胞是造血和免疫系统的所有成熟细胞发育所必须的，因此它们的存活对于重建受化疗剂或其它制剂治疗的个体的完整功能性宿主防御系统是不可缺少的。
造血细胞的产生受到一系列剌激造血细胞生长和分化的因子的调节，其中一些因子，例如促红细胞生成素和G-CSF目前已被应用于临床实践中。然而，还未被充分鉴定特征的调控网络的一部分是形成调节过程的负性支流的反馈机理(Eaves et al.Blood 78：110-117，1991)。
Lord及其同事的早期研究证明了在正常的鼠和猪骨髓提取物中存在可溶性蛋白质因子，它能可逆地抑制HSC地循环(Lord etal.Br.J.Haem.34：441-446，1976)。这一抑制性蛋白质(50-100kD)被称为干细胞抑制剂(SCI)。
由原始来源中纯化该抑制因子的过程因需要大量经辐射处理的小鼠的体内检测法所固有的困难而未能完成。在克服这些问题的尝试中，Pragnell及其同事开发研究了一种用于原始造血细胞(CFU-A)的体外检测方法，并筛选了作为抑制活性来源的细胞系。
因为较早期的研究认定了巨噬细胞作为SCI来源的可能性(Lordet al.，Blood Cells 6：581-593，1980)，因此选择了小鼠巨噬细胞系J774.2(Graham et al.，Nature 344：442-444，1990)。由该细胞系调理的培养基用于纯化，被分离的抑制性肽也被证实与以前描述的细胞因子巨噬细胞炎性蛋白质1-α(MIP-1-α)相一致。因此，MIP-1-α从细胞系而非原始材料中被分离。Graham等人观察到MIP-1-α的抗体能消除粗骨髓提取物的活性，而其他研究人员证明其它的抑制活性很重要。例如，Graham等人(J.Exp.Med.178：925-32，1993)认为TGFβ而非MIP-1α是造血干细胞的初级抑制剂。此外，Eaves等人(PNAS90：12015-19，1993)认为MIP-1α和TGFβ都以次理想水平存在于正常骨髓中，产生抑制效应需要两者的协同作用。
其它的研究人员描述了另外一些干细胞抑制因子。Frindel及其同事从胎牛骨髓和肝脏提取物中分离出具有干细胞抑制活性的四肽(Lenfant et al.，PNAS 86：779-782，1989)。Paukovits等人(CancerRes.50：328-332，1990)已鉴定了一种五肽的特征，它以单体形式存在时是干细胞循环的抑制剂，但其二聚体却是激活剂。据称还有其它一些因子在体外对各种系统有抑制作用(参考Wright and Pragnell inBailliere’s Clinical Haematology V.5，P723-29，1992(Bailliere Tinadall，Paris))。
到目前为止，这些因子无一被证实能应用于临床。然而，临床治疗中需要有效的干细胞抑制剂。与化疗或放疗有关的主要毒性在于正常的增生细胞的结构遭到破坏，从而导致骨髓抑制或胃肠道毒性。有效的干细胞抑制剂能够保护这些细胞，因而使得这些治疗方案达到满意的效果。正如根据临床情况证实了需要各种有刺激作用的细胞因子(如G-CSF、GM-CSF、促红细胞生成素、IL-11)，也很有可能需要各种抑制因子满足不同临床需要。I.癌症的化疗和放疗
对刺激性生长因子进行生产性研究导致了许多这些因子(促红细胞生成素、G-CSF、GM-CSF等)的临床应用。这些因子降低了与化疗和放疗相关的死亡率和发病率。通过另一种策略即阻断干细胞进入细胞循环从而防止其毒副作用，可帮助人们认识到所说因子对正在进行化疗或放疗的病人更进一步的临床治疗益处。II.骨髓移植
骨髓移植(BMT)是各种血液病、自身免疫性疾病和恶性疾病的一种有效治疗方法。细胞的体外操作目前被用于将原始干细胞扩充至适宜移植的细胞群。该过程的优化要求：(1)足够数量能维持长效造血重建的干细胞；(2)除去移植物抗宿主诱导的T淋巴细胞；(3)不存在残余的恶性细胞。该过程可以通过引入一种或数种用于体外扩充的干细胞抑制剂而优化。
为了除去残余恶性细胞而用细胞毒性药物净化骨髓细胞的效果因这些化合物对正常造血细胞尤其是干细胞的毒性而受限。这就需要在净化过程中存在对正常细胞的有效保护作用；该保护作用可以通过用一种有效的抑制剂将干细胞调离循环而得到。III.收获外周血干细胞
外周血干细胞(PBSC)对于骨髓的自体移植提供了诸多潜在的益处。因肿瘤浸染或先前的放疗而不具有合适的骨髓收集部位的病人仍能收集PBSC。血干细胞的应用排除了不能很好地耐受一般的麻醉和外科手术过程的病人的上述需要。收集血细胞所必需的除血浆技术在大多数大的医疗中心是有效的，并得以广泛使用。该方法的主要局限在于在用药物或生长因子(如环磷酰胺、G-CSF、干细胞因子)进行动员之后出现外周血干细胞正常静止状态频率低而循环状态频率高。有效的干细胞抑制剂可用于使这类细胞回复静止状态，从而防止其在分化过程中丧失。IV.过度增生紊乱的治疗
许多疾病以过度增生状态为特征，其中失调的干细胞导致终末细胞的过度产生。这类疾病状态包括但不限于内皮细胞过度产生形成的牛皮癣和以出现肠息肉为特征的胃肠道恶化前病变。干细胞抑制剂可用于治疗这类疾病。V.基因转移
人们将遗传信息转移至造血细胞中的能力正被用于临床实践中。对于基因治疗而言，骨髓是一个很有用的目标，这是因为它易于到达、在体外操作和处理该组织方面有广泛经验，也因为血细胞有穿透组织的能力。而且，通过在人造血系统的原始骨髓干细胞中插入功能性基因有可能矫正某些人类遗传缺陷。
无论是利用逆转录病毒载体或是基因转移的物理技术将基因导入人造血细胞，都将存在数种限制：(1)造血组织中的低频干细胞要求开发高效的基因转移技术；(2)更快循环的干细胞被证实对载体感染更易感，但已证实通过用生长因子刺激干细胞增生来增加感染频率将对长效基因表达产生负性作用，因为含有转基因的细胞将被迫进行不可逆性分化并丧失其自我更新的能力。这些问题可通过应用干细胞抑制剂防止分化和自我更新的丧失得以改善。本发明概述
本发明涉及干细胞增生的抑制剂，其特征在于如下特性：
(a)鼠集落形成脾(CFU-S)测定(参见实施例4)中比活性(IC50)小于或等于20ng/ml
(b)分子量大于10,000道尔顿，小于100,000道尔顿(用超滤法)
(c)具有对胰蛋白酶降解敏感的活性
(d)比MIP-1α或TGFβ更具疏水性，借助反相层析可从两者中分离开来(参见实施例12)
(e)于水溶液中在37℃、55℃或75℃加热1小时后仍保留生物活性
(f)在含1％盐酸的丙酮中沉淀后保留生物活性
本发明更进一步的特征及与其它待选干细胞抑制剂(如MIP-1α、TGFβ及各种寡肽)的区别在于本发明的干细胞抑制剂在经过短时的预保温期之后的体外测定中能够产生抑制作用(参见实施例5)。
本发明还包括含有INPROL的药物组合物，它用于治疗各种紊乱。
本发明提供了一种治疗遭受某种能够杀伤或损害干细胞的制剂的个体的方法，包括向治疗对象施用有效量的干细胞抑制剂组合物。受所说方法保护的干细胞可以是通常存在于骨髓并在其中分裂的造血干细胞。另外，干细胞可以是例如肠或头皮或身体其它部位的上皮细胞或生殖器官的生殖细胞。本发明的方法适用于人体，但该方法也包括动物治疗。
另一方面，本发明提供了保护和恢复化疗病人的造血、免疫或其它干细胞系统的方法，包括给病人施用有效量的INPROL。
另一方面，本发明提供了附属治疗任何癌症(包括以实体瘤为特征的癌症)的方法，包括给癌症患者施用有效量的INPROL，以防止骨髓、胃肠道或其他器官的干细胞受到化疗或放疗的毒性作用。
另一方面，本发明涉及治疗白血病，包括用有效量的INPROL处理其中有增生性白血病细胞的骨髓细胞以抑制正常干细胞的增生，和用细胞毒性剂处理骨髓以破坏白血病细胞。该方法的效果可以借助利用刺激骨髓增生的其它因子(如集落刺激因子)处理骨髓的后续方法得以提高。在一个实施方案中，该方法是于体内完成的。另外，该方法也用于体外净化和扩充进行移植的骨髓细胞。
再一方面，本发明方法涉及治疗具有由增生的干细胞所致的任何紊乱的病人。这类紊乱如牛皮癣、骨髓发育不良、某些自身免疫性疾病和老年性免疫机能降低，治疗这些紊乱是通过给治疗对象施用有效量的INROL以部分抑制所说干细胞的增生。
本发明提供了可逆性地保护干细胞不受能够杀伤或损害干细胞的细胞毒性剂损伤的方法。该方法包括给遭受所说毒剂的治疗对象施用有效量的INPROL。
本发明在其范围内包括纯化猪INROL，并希望利用这类纯化的蛋白质得到用于克隆INPROL cDNA或基因的序列资料。
本发明还提供：
一种干细胞增生的抑制剂，它通过下列过程从猪或其它骨髓中分离(参见实施例12)：
(a)提取骨髓，经过滤除去颗粒物
(b)于56℃热处理40分钟，接着冰浴冷却
(c)在40℃下以10,000g离心30分钟除去沉淀
(d)向上清液中加入10个体积经搅拌的冰冷丙酮(含1％(v/v)浓盐酸)进行酸沉淀，然后于4℃保温16小时。
(e)于4℃以20,000g离心30分钟分离沉淀物，用冷丙酮冲洗，然后干燥
(f)用反相层析分离，监测其活性是通过观察对用5-氟尿嘧啶预处理和与鼠IL-3一起保温的骨髓细胞的集落形成抑制作用以及读取280nm的吸光率和进行SDS-PAGE。
本发明还提供：
一种基本上不含其他蛋白质的干细胞增生抑制剂的纯化方法，它包括上述步骤，同时也将在下文作更详细的描述。
本发明还提供：
一种治疗人或动物的方法，其中的干细胞增生抑制剂起改善由干细胞过度增生所致免疫抑制的作用。
本发明还提供：
一种治疗人或动物的方法，其中所说的干细胞增生抑制剂在干细胞遭受细胞毒性药物或辐射过程而被诱导增生之后施用。干细胞通常处于静止状态，但在化疗后因受刺激而进入细胞循环，这就使之对于第二次化疗更为敏感，本方法防止受到所说治疗的不利影响。
本发明还提供：
一种治疗人或动物的方法，其中所说的干细胞增生抑制剂作为佐剂在为了增加免疫应答而进行接种前或同时施用。
本发明还提供：
一种治疗接受细胞毒性药物或放射治疗的人或动物的方法，包括施用有效量的干细胞增生抑制剂以防止干细胞受到损害。
本发明描述了一种称为INPROL的干细胞抑制剂，它不同于现有技术中已知的那些抑制剂，如MIP-1α、TGF-β、Frindel等人的四肽或Paukovits等人的五肽(参见Wright & Pragnell，1992(在所引的文献中)。用超滤法测得INPROL的分子量大于10,000道尔顿，这使之区别于四肽及五肽。它在反相层析系统中比MIP-1α或TGFβ更具疏水性，使之不同于这两种细胞因子。而且，它的作用方式与任何以前描述的抑制剂的区别在于，在体外测定中，当它仅在一段预保温期中应用时仍具活性。例如，MIP-1α仅在一段预保温期中应用时则已经失效(实施例5)。更进一步，在检测“高增生性潜能细胞(HPP-PHC)”的试验中INPROL具有活性，而MIP-α则不然(实施例6)。附图的简要说明
图1-4表示各纯化阶段所得产物的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。
图5表示终纯化的HPLC色谱图。
图6表示氚化的胸苷掺入(cpm)未用(对照＝100％)和用各种浓度INPROL处理的FDCP-混合系细胞，所示数据是针对对照值标化过的。
图7表示在用丙酸睾丸甾酮(TSP)、TSP＋INPROL或载体(对照)处理小鼠之后处于细胞周期S期的细胞的百分数。每组包括25只动物(每个时间点3-4只)。
图8表示用二剂5-FU处理小鼠、用或不用INPROL处理小鼠的存活情况。每组包括30只动物。
图9表示用或不用INPROL处理被辐射过的小鼠的存活情况。每组包括50只动物。
图10A和图10B表示正常骨髓的长程培养细胞在用Ara-C或Ara-C＋INPROL处理后1周(10A)和3周(10B)的再生情况。
图11表示在经致死性辐射和将3×104骨髓细胞与培养基(对照)或INPROL(25ng/ml)一起预保温4小时再移植后的小鼠存活情况(每组75只)。存活情况监测30天。
图12表示培养来自经致死性辐射处理并用与INPROL或培养基一起预保温4小时的供体骨髓细胞进行恢复的小鼠的骨髓细胞14天后形成的CFU-GM数。
图13表示来自淋巴长程培养物的悬浮细胞，它们在与培养基或INPROL一起预保温4小时后每周被取出，冲洗并与IL-7(10ng/ml)一起涂布平板。
图14表示用INPROL处理的白血病外周血细胞提高了群体重建能力。长程培养物起始细胞(LTC-IC)通过平皿接种用和未用INPROL处理的粘附和非粘附LTC细胞并在第七天对CFU-GM进行计数来检测。所示数据已对对照值标化。
图15A表示以53％乙腈洗脱的、纯化的INPROL的C4反相色谱图。图15B表示以43.9％乙腈洗脱的MIP-1α的C4反相色谱图。图15C表示粗INPROL制备和经反相色谱纯化的制备物的SDS-PAGE色谱。
为了使本文的描述得到更充分的理解而提出了下文更详尽的描述。作为本发明举证的描述并非用于具体地限定本发明，在本领域技术人员预见之内的改变被认为落入本发明范围之中。优选实施方案的详细描述
INPROL可逆地抑制干细胞的分裂。具体地说，INPROL可以有效地暂时抑制造血干细胞的分裂。因此，本发明的方法通过防止干细胞遭受因用于消除癌症或病毒感染细胞的化疗剂或辐射所致的损害而用于减轻化疗对病人的造血、骨髓和免疫系统所产生的不良的副作用。在本发明的一个实施方案中，INROL以足以抑制干细胞分裂的剂量施用于病人，而化疗剂对病变细胞起作用。在化疗剂执行了其功能之后，被INPROL抑制的干细胞在不进行进一步处理的情况下回复为分裂细胞。如果有必要增强造血的再生作用，可另外加用刺激性生长因子或细胞因子。
在典型的临床情况中，给病人施用INPROL是在标准的化疗或放疗前例如4-60小时用例如0.01-1mg/kg的纯化或重组的INPROL经静脉注射或输注进行的。在本发明的另一实施方案中，用INPROL进行预处理可以将化疗剂或辐射的剂量提高到病人通常能够耐受的剂量之上。可以选择的是，在化疗或放疗之后应用刺激性生长因子(如G-CSF、干细胞因子)来进一步改善造血功能的重建。
在本发明另一实施方案中，INPROL被用于制备进行移植的自体骨髓的方法中，该骨髓在体外用有效量的INPROL处理以抑制干细胞的分裂，然后通过给骨髓培养物施用有效量的化疗剂或辐射来净化癌细胞。对循环细胞具特异性的化疗剂是优选的。如此处理的骨髓被重新注入自体供体。可以选择的是，病人可以用已知能刺激造血的因子进行治疗以改善其造血重建功能。
在本发明另一实施方案中，INPROL被用作白血病治疗中的辅助性治疗。例如，在白血病细胞对INPROL不产生反应的疾病状态下，用INPROL体外处理白血病性骨髓细胞。正常干细胞的增生受到施用INPROL的抑制。因此，在用细胞周期特异性细胞毒剂处理增生的白血病细胞期间，正常的干细胞群免受损害。另外，在药物治疗或辐射治疗期间选择性地施用刺激性细胞因子(如IL-3或GM-CSF)以诱导白血病细胞的循环，而正常的干细胞因用INPROL而受到保护。用化疗剂或辐射治疗病人以破坏白血病细胞，然后再将净化的骨髓移植入病人体内以建立造血重建功能。
类似地，在本发明另一个治疗涉及血细胞或淋巴细胞的严重病毒感染(如HIV感染)的病人的实施方案中，用INPROL在体外处理骨髓，继而再用抗病毒剂、破坏感染细胞的药物或者除去感染细胞的抗体系统处理。在经骨髓破坏性抗病毒或化疗以从病人体内根除病毒宿主细胞后，INPROL处理的细胞被送回病人体内。
在本发明的另一个实施方案中，INPROL被用于治疗与过度增生的干细胞相关的紊乱。例如，牛皮癣是因皮肤的上皮细胞过度增生所致的紊乱，有时用细胞毒性药物治疗。其它一些涉及干细胞增生的瘤形成前损害也适于用有效量的INPROL来完全或部分抑制干细胞的增生。为此用途，使用了含INPROL的局部或透皮释放组合物，适当的话，这可作为胃肠外给药的一种选择。在大多数白血病病例中，白血病祖代细胞是不受INPROL影响并因此而借助利用INPROL的方法(如上述方法)处理的分化细胞群。如果白血病祖代细胞非常原始，并直接对INPROL的抑制作用敏感，则可通过施用有效量的INPROL来减弱白血病细胞的增生。
利用标准技术生产针对INPROL多肽的单克隆或多克隆抗体。用可检测的标记物标记这些抗体或INPROL多肽，所说标记物中的许多类型是本领域已知的。为达到诊断的目的，再将这些被标记的INPROL或抗INPROL抗体用作干细胞标志直接用于病人以鉴定和分离干细胞。另外，这些被标记的多肽或抗体在体外用于鉴别骨髓制备物中的干细胞，使其在净化骨髓中的肿瘤细胞之前被除去。以类似的方法将这类标记的多肽或抗体用于分离和鉴定上皮或其它干细胞。此外，这类标记的或未标记的抗体通过INPROL活性的中和作用达到治疗性应用，或通过循环INPROL水平的检测进行诊断性应用。
如果猪因子不诱发人体免疫系统产生明显有害的抗体，那么它可以用于本发明的方法中。具有类似于INPROL活性的类似或同源人蛋白质属于本发明范围。利用标准技术，从表达重组人INPROL的人基因或cDNA文库中克隆这类蛋白质。例如，利用得自纯化蛋白质的序列信息构建寡核苷酸探针，它可以用例如32P标记，并用于筛选适当cDNA文库(例如从骨髓中)。另外，用抗体或用适当的功能性测定(如实施例2所述)从适当来源(如骨髓)的表达文库中筛选编码INPROL的cDNA。
其它种的INPROL同源或类似物形式具有各种兽医学应用，这类似于上述的本发明治疗性实施方案。
更进一步，干细胞抑制因子通过将循环的干细胞可逆地置于不分裂的“静止”状态而对其产生作用。当需要刺激静止的干细胞进入分裂状态，如在癌症病人经化疗剂或辐射治疗后，可将集落刺激因子和其它造血刺激因子施用于治疗对象。这类因子的例子包括但不限于M-CSF、CSF-1、GM-CSF、G-CSF、巨核细胞-CSF或其它细胞因子，如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14或促红细胞生成素。
具有干细胞抑制活性的INPROL多肽或活性片段，如下文所述的方案所举例说明的，利用常规的化学方法结合检测干细胞抑制活性的适当生物检测法来纯化或合成。
在本发明的一个实施方案中，治疗有效量的INPROL蛋白质或其治疗有效片段是与药用载体混合使用的。该INPROL组合物一般是经胃肠外注射或输注来施用的。根据需要达到的治疗效果，可以选择皮下、静脉内或肌肉内注射途径。
当全身施用时，用于本发明的治疗性组合物是不含热原质、胃肠道外给药可接受的水溶液形式。具有适当pH、等渗性、稳定性、载体蛋白质等的药用蛋白质溶液属于本领域技术范围内。为了在治疗过度增生性干细胞的方法中施用，含INPROL的组合物是经局部或通过透皮斑给药，以将其作用局限并优化至过度增生的区域。
在治疗将遭受细胞毒剂的个体或治疗过度增生的干细胞的方法中所牵涉到的剂量方案由主治医生根据改变药物作用的各种因素来确定，所说的影响因素如病人状况、体重、性别、病人的饮食、感染的严重程度、给药时间及其它临床因素。一般情况下，每天的给药剂量范围是1-100μg/kg体重INPROL蛋白质或其片段。
在治疗对象接触了细胞毒性剂或辐射之后，本发明的治疗方法可以选择性地给病人施用一种或多种淋巴因子、集落刺激因子或其它细胞因子、促红细胞生成素、白细胞介素或生长因子，以一般性地刺激因INPROL的在前治疗而受抑制的干细胞(及其子代)的生长和分裂。这类可以增强造血功能的治疗因子包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、Meg-CSF、M-CSF、CSF-1、GM-CSF、G-CSF或促红细胞生成素。这些因子的剂量可以根据从其在临床试验中用于化疗或骨髓移植后促进造血功能重建的效力所得的知识来选择。这些剂量还可以调整，以补偿病人身体状况及病人所接受的化疗剂或辐射的量和类型的改变。用常规方法监测被治疗病人因施用INPROL所致的干细胞抑制作用的逆转进程。
在治疗白血病时，与细胞毒性药物治疗同时或在辐射治疗过程中，施用抑制正常干细胞循环的INPROL和白血病细胞生长的刺激剂(如IL-3或GM-CSF)是有益的，利用这一方案，有可能达到正常细胞及白血病细胞的循环状态和药物敏感性之间的最大差别。实施例1 体内干细胞增生抑制测定
为了检测干细胞增生，用3H-胸苷“自杀”法(Becker et al.，Blood26：296-308，1965)测量处于细胞周期的S期的CFU数目。
未成熟的造血祖代细胞，即脾中的集落形成单位(CFU-S)，可以通过给经致死性辐射过的小鼠静脉内注射造血细胞8-12天后观察脾中形成的肉眼可见集落来进行体内检测(Till & Mc Culloch，1961)。
3H-胸苷“自杀”法是通常所用的标准CFU增生测定法(Becker etal.，1965)。该方法以被放射标记的胸苷(3H-胸苷)作为DNA前体在DNA合成过程中掺入细胞为基础。测试时处于细胞周期S期的CFU-S被高剂量的放射性杀伤，因而不能在脾中形成集落。因此，注射未与3H-胸苷一起保温的细胞样品和与3H-胸苷一起保温过的相同细胞所形成的CFU-S数目之差表示原始样品中增生的CFU-S的百分比。
抑制剂试验可以用未被刺激动物的骨髓干细胞群进行，只要抑制剂的确作用于循环的CFU，后者在正常小鼠的骨髓中低至7-10％。
为刺激CFU增生使用了苯肼(PHZ)或亚致死性辐射(Lord，1976)。
我们根据丙酸睾丸甾酮(TSP)对CFU循环的刺激作用(Byron etal.，Nature 228：1024，1970)发明了TSP注射液，它简化了试验，不引起任何副作用。TSP在注射后20-24小时内诱导对CFU增生刺激作用，至少7天可以观察到效果。
用于筛选抑制剂纯化过程中的级分的方法如下：
小鼠：BDF1或CBF1小鼠品系被用于所有的测试中。
用TSP(10mg/100g)经腹膜内注射(0.2ml/小鼠)处理供体小鼠，使在S期产生30-35％CFU。
24小时后，从股骨取骨髓制备细胞悬液。然后将5～10×106细胞/ml的悬液与不同的对照和测试级分在水浴中于37℃保温3.5小时，每组用2只试管(热和冷)。
3.5小时后，3H-胸苷(1mCi/ml，比放射18-25Ci/mmole)以200μl/ml细胞悬液加入热试管中，冷试管中什么也不加，于37℃继续保温30分钟。
30分钟后，通过加入10ml含400μg/ml非放射性胸苷的冷(4℃)培养基来中止杀伤反应。充分洗掉细胞(洗3次)。
重悬细胞，并稀释至注射所需的浓度，通常是2-4×104细胞/小鼠，0.3-0.5ml。
受体小鼠分成每组8-10只，在不晚于注射前6小时进行辐照。
在第9-12天收获受体脾，并固定于Tellesnitsky溶液中，用肉眼给所形成的集落计数，再用公式计算S期的细胞百分数。
其中a-无3H-胸苷的CFU数
b-有3H-胸苷的CFU数
表4中所示INPROL的测试数据表明，循环的干细胞在用INPROL处理后变得对3H-胸苷的作用产生抗性。对于S期具有特异性的细胞毒性药阿糖胞苷和羟基脲也是如此(数据未给出)。如果再用含非放射性胸苷的冷培养基洗涤被处理的干细胞，那么存活的干细胞在小鼠脾中增生，正常地形成集落。
表4
INPROL与骨髓细胞一起保温4小时过程中
对CFU增生的抑制活性 组 CFU/2X-3H-TdR 104细胞＋3H-TdR 被3H-TdR杀伤的 CFU(％) 未保温 22.2±2.0 13.7±2.4 38.3±1.7与培养基保温4 小时 18.7±3.0 11.4±1.3 43.1±1.4与INPROL保温 4小时 21.2±2.3 20.7±2.6 2.1±0.08实施例2 体外干细胞增生抑制测定
利用下面的测试系统(Lord et al.，in The Inhibitors of HematopoiesisP227-239，1987)证明INPROL的直接作用。多谱系因子(IL-3)依赖性干细胞系FDCP mix A4(A4)在补充了20％马血清和10％WEHI-3条件培养基的IMDM培养基中维持，作为集落刺激性IL-3的来源。
用于检测增生作用的氚化胸苷掺入测定法：维持于10μl含有20％马血清和50％WEHI-3 CM的培养基中的A4细胞(5×104)于37℃、5％CO2条件下保温16小时。
一开始就加入INPROL或粗制BME(级分IV)。然后每组加入3HtdR(50μl中有3.7KBq，740GBq/mmole)继续保温3小时。用收获的细胞检测增生水平。
图6说明3H-Tdr掺入在分级剂量的正常骨髓提取物或INPROL存在下培养的FDCPmix-A4细胞。由此可见纯化的INPROL组合物比起始材料的活性至少高1,000倍。接触的时间(16小时)对于有效的抑制作用而言是一个重要的因素，它表明了对A4细胞系的干细胞产生直接作用的证据。实施例3 体内注射的INPROL对CFU增生的抑制
作用：剂量及作用的持续时间
对体内注射的INPROL的作用进行研究表明，INPROL能有效地阻断CFU回复至循环中，因此，保护那些细胞免受显示出其潜在临床用途的进一步治疗的细胞毒性作用。
本实验方案有两个目的：核查INPROL在注入体内后对CFU的作用和确定INPROL对循环干细胞具有活性的有效持续时间。
为刺激CFU增生，在上面实施例1所述作用的基础上使用了丙酸睾丸甾酮注射液。
在第0天用TSP(10mg/100g)注射BDF1小鼠；24小时后每个实验组的小鼠(每组4只)接受剂量范围为0μg、5μg、10μg、15μg/小鼠的单剂SCPI腹膜内注射。
注射SCPI24小时后，处死小鼠，用实施例1所述方法检测循环CFU的百分数。注射TSP诱导了约50％CFU-S进入循环，与此相比，未处理的小鼠中只有7％。用低至2μg/小鼠剂量的INPROL能够抑制TSP诱导的增生至正常水平。
为了评估作用持续的时间，一组小鼠(每组21只)只用TSP注射，另一组则用TSP和INPROL注射(在注射TSP24小时后)。在一周中每24小时，通过从每组取3个供体并用所述方法(参见实施例1)检测其骨髓中的CFU-S循环状况来检测CFU-S循环。图7中所示数据表明，当TSP的作用持续时间至少是7天时，单剂注射INPROL能使CFU-S处于静止状态，并维持其脱离循环不超过48-72小时。因为用于癌症和白血病化疗的大部分化疗剂在体内的半寿期较短，通常短于24小时，所以，根据所得数据显示的INPROL的作用比化疗剂(如阿糖胞苷或羟基脲)在体内具有活性的有效时间要维持得长。更重要的是，第一次(对干细胞不损害)和第二次化疗和放疗之间需要较长的间隔时间(长于24小时，短于96小时)，所以于损害的CFU细胞毒性方法，在两次应用化疗剂或放疗的间隔过程中注射单剂INPROL必须足够。对于细胞毒性治疗或放疗的数次可重复性循环，可以INPROL作用的持续时间为根据应用同样的对策。实施例4 用5-FU处理后被刺激进入快速循环的大多数原始
造血干细胞由INPROL保护不受第二次接触5-FU的损害
药物5-FU明显地减少骨髓和淋巴部分的细胞数。因为细胞周期S期或之前核苷酸类似物掺入DNA中导致细胞死亡，所以通常认为5-FU是细胞周期特异性的，它快速定靶于增生细胞。小鼠骨髓的长期存活和免疫造血重建不受单剂5-FU的影响；但是，据证明(Harrison et al.Blood 78：1237-1240，1991)，多能造血干细胞(PHSC)在首剂5-FU之后大约3-5天的短期时间变得易受损于第二剂5-FU。这可以解释为PHSC对于单剂5-FU通常循环得太慢而无效，受到首剂5-FU的处理而刺激进入快速循环。我们认为利用INPROL能够使PHSC回复到慢循环状态，因而保护PHSC不受第二次5-FU处理的影响。
用于本实验的小鼠是BDF1雄性小鼠。用生理盐水以10μg/ml的浓度制备5-FU的贮备液(Sigma)。在实验的第0天，每一被处理的小鼠经尾静脉接受剂量为2mg/10g体重的5-FU；24小时后经腹膜内注射INPROL(10μg/100g体重)，第3天注射第二剂5-FU。通过监测各30只小鼠的实验组(用INPROL处理)和对照组中小鼠的死亡数进行存活研究。存活曲线示于图8。实施例5 与INPROL预保温相对于与MIP-1α预保温
对骨髓细胞的影响
本实验的目的是比较与INPROL和MIP-1α在体外预保温对小鼠骨髓细胞的抑制性影响。
所用方法如下：
体内：BDF1小鼠，6-15周龄，在自其股骨收集骨髓前48小时经腹膜内注射200mg/kg 5FU。
体外：对所收集的单细胞悬液计数，5×106细胞在有或无Inprol或MIP-1α、5％马血清及加入L-Gln的IMDM培养基共2ml体积于37℃、5％CO2条件下保温4小时。然后洗细胞2次，重新计数。以下列终条件将其平皿接种于甲基纤维素中：
0.8％甲基纤维素
25％马血清
20ng/ml重组的鼠IL-3
L-谷氨酰胺(加入的)
5×105细胞/ml
IMDM培养基
平皿在37℃、5％CO2、100％湿度保温11天。计数超过50个细胞的集落。
组 集落数 对照的百分数 对照 31.0 100％ Inprol 21.25 68.5％ MIP-1α 35.25 114％实施例6 INPROL抑制HPP-CFC增生
一种评估鼠重建的干细胞及早期祖代细胞的体外测定法是高增生潜在性集落(HPP-PFC)测定法；其它相关的测定，如CFU-A、CFU-GM、CFU-E和CFU-GEMM，渐进地检测被限制的祖代细胞群(M.Moore，Blood 177：2122-2128，1991)。本实施例表明用INPROL对细胞进行预处理会抑制其增生，而在相同的这些实验条件下MIP-1α则不然。
在对BDF1小鼠的骨髓进行HPP-CFC数目测定前先用5-FU处理小鼠(200mg/kg腹膜内)。通过离心洗细胞，再以106-5×106细胞/ml的密度在或者不加入因子(对照)、INPROL(25ng/ml)或MIP-1α(200ng/ml)的培养基中保温4小时，之后，洗细胞，平皿接种于含30％FCS的琼脂(0.3％)中，并与5637和WEHI-3B细胞系的条件培养基合并(每一条件培养基的7.5％，如Sharp等人，1991推荐)。平皿接种浓度是在60mm平皿中达5×104细胞/ml。在第14天给集落评判，结果如下所示。
组 HPP-CFU 对照％ 对照 15.5±1.2 100％ INPROL 8.3±0.7 53.5％
MIP-1 15.8±0.9 101％
根据上述结果，当MIP-1α仅存在于预保温期过程中时，它不抑制大多数未成熟祖代细胞的增生。在上述条件下，INPROL不能有效地抑制增生，这表明INPROL和MIP-1α之间的生物活性根本不同。实施例7 INPROL对恢复辐射诱导的骨髓发育不良的治疗作用
骨髓发育不良是对癌症放疗的主要限制性毒性。已证明一些生长因子(如G-CSF、GM-CSF、促红细胞生成素)能加速辐射诱导的骨髓发育不良的恢复。利用干细胞增生抑制剂保护的构思是对付造血损害的另一种补充手段。按照前文所提出的治疗方法(实施例3、4)建立了小鼠的致死性辐射的模型。现有技术已知小鼠接受9Gy的Co 60 10-14后开始死亡；到第30天，死亡率达到大约50％。该致死剂量用于我们的模型中是将其分成各4.5Gy的两个相继应用剂量，两次之间间隔3天。初步资料表明该模型的存活曲线非常接近于已知用9Gy的单剂辐射的结果；而且CFU增生的试验表明在第一次辐照后的24小时CFU有35-50％被诱导增生。这类细胞可以受到在第二剂辐照之前施用的干细胞抑制剂的保护。
为了检查这种可能性，第0天小鼠接受4.5Gy(50只小鼠/组)，24小时后腹膜内注射INPROL(2μg/小鼠)，对照组注射生理盐水，在第3天给予第二剂辐射(4.5Gy)。
图9表示在应用单剂INPROL后存活数的增加。模型的条件相应于治疗任何癌症的临床条件，所说的癌症包括那些以实体瘤为特征的癌症。这类治疗是通过在先后两次辐射之间给癌症病人施用有效量的INPROL进行的，因而使得对于癌症的治疗可以使用更大剂量的辐射。也有可能将这种疗法延伸到化疗剂。实施例8 INPROL用于自身骨髓移植
对于多种白血病(CML、AML等)而言，骨髓移植是唯一已知的有疗效的治疗方法。在体外调理用于输注的自体BMT将提供不含白血病细胞的正常干细胞的潜在自体来源，它们能够重新建立受体的造血系统，以达到积极有效的治疗。
1.研究INPROL在AraC的净化过程中保持正常造血功能作用的长时骨髓培养物L1210白血病模型
根据Toksoz等人的方法(Blood 55：931-936，1980)建立长时骨髓培养物(LTBMC)，在两周中经过共同培养，白血病细胞系L1210被接受到上述LTBMC中。在所说的联合LTBMC/L1210培养物中存在着同时生长的正常祖细胞和白血病祖细胞，这种情形类似于白血病人的骨髓。在有或无来自WEHI-3(一种产IL-3的鼠细胞系)的条件培养基情况下，使正常的集落形成单位CFU和白血病性CFU作为琼脂集落生长有可能对两者进行辨别。正常细胞在缺乏IL-3时会出现编程性细胞死亡，而白血病细胞在IL-3缺乏时能形成集落。来自LTBMC-L1210组合物的悬浮细胞在IL-3存在时每50,000个平皿接种细胞产生大约150个集落(正常的造血性克隆)，而在缺乏IL-3条件下生长时产生大约70个集落(白血病性克隆)。
净化过程如下：第0天从装有LTBMC-L1210的烧瓶中取出所有的悬浮细胞和培养基(10ml/烧瓶)，代之以2ml含200μg阿糖胞苷(AraC)的培养基(Tsyrlova et al.in Leukemia：Advances in Biology and TherapyV.35，1988)；保温20小时后，洗烧瓶，换成2ml新鲜培养基(对照组)或含INPROL(25ng/ml)的培养基保温4小时。预保温后，细胞再与AraC(100μg/烧瓶)于37℃保温3小时，每组包括4只烧瓶。洗LTBMC-L1210培养物3次，并用新鲜的LTBC培养基替换；如前对再生作用的研究一样维持培养物3-4周。
所得数据如图10所示。在仅用AraC处理的对照培养物中未观察到细胞生长，而在用INPROL进行保护的烧瓶中，造血再生因粘附层祖细胞的增生而出现得大为迅速。而且，实验组的细胞当被经平皿接种于琼脂中时仅在有IL-3的条件下生长，每50,000细胞产生大约100CFU；在至少4周中未观察到白血病细胞生长，因此，在体外用有效量的AraC结合INPROL处理的骨髓能净化癌细胞，而干细胞受到保护。该疗法有可能延伸到其它形式的放疗或化疗中。
2.骨髓群体重建能力(MRA)和30天的放射保护作用因在体外受到INPROL处理而增强。
MRA是细胞重建经致死性辐射的小鼠骨髓的能力，连同赋予30天的放射保护作用的能力一起，是对挽救骨髓抑制动物潜力的直接体内检测指标(Visser et al.Blood Cells 14：369-384，1988)。
为了进行放射保护作用研究，用9.5Gy辐射并用来自睾丸甾酮刺激的供体的骨髓移植来恢复。一组受体用与培养基一起预保温4小时的骨髓细胞恢复(对照组A)，另一组所用骨髓细胞是与25ng/mlINPROL一起预保温的(B组)。洗涤每组的细胞，并以30,000细胞/小鼠移植入被辐射的动物。存活数据如图11所示。总结性说明了三个实验，其中对照被标化为100％。与INPROL的保温将30天的小鼠存活率从对照组的36.5％提高到61.8％。
与INPROL预保温所诱导的MRA提高可能是增强放射保护作用的机理之一。为了检验这一假说，根据Visser等人的方法(出处同前)检测MRA。简单地说，用睾丸甾酮预处理供体BDF1小鼠，将其骨髓与培养基或INPROL预保温4小时，再注射到被辐射的动物体内。第13天，取自受体骨股的骨髓细胞以3种不同浓度(0.01、0.05、0.1股骨当量)平皿接种于含20％马血清和10％WEHI-CM的琼脂中。第7天的集落数表示MRA，只要此时受体骨髓中的集落形成细胞为供体未成熟干细胞的祖代。
由图12可见，与INPROL预保温的细胞群的MRA大于对照组(B)。实施例9 INPROL对干细胞的抗过度增生作用能改变其分化异常
在从细胞毒性药物或放射的恢复过程中，不仅观察到CFU的过度增生，而且是作为正常老化的结果，这被认为是骨髓发育不良综合症(MDS)的主要特征。它伴有分化失衡，如红细胞普遍分化，同时粒细胞分化。
骨髓细胞与25ng/ml INPROL或培养基(对照)于37℃保温4小时，洗涤细胞，再平皿接种于含20％马血清、2U/ml促红细胞生成素和10％WEHI-CM的琼脂中。第7天计数BFU-e和GM-CFU集落数。表5所示数据总结于3个实验，每组每个点取4只动物；4只平皿被接种。
由表5显而易见，取自未受损动物(BDF1，8-12周龄)的正常骨髓(NBM)与INPROL一起保温不会改变不同类型集落的数目或比例；用TSP预处理的BDF1供体如前文所见一样(实施例1、3、4)，表现出CFU增生增强，红细胞祖细胞数(BFUe集落)的增加和GM-CFU的减少完全被与INPROL一起保温而消除。异常高的CFU增生水平也回到细胞周期S期的10％CFU。已知CFU过度增生是一些对病毒性白血病诱导高度易感的小鼠品系的特性，例如Balb/c小鼠(表5)，这也能在更老一些的动物中观察到(表5)。在用TSP处理的BDF1小鼠中所见的定型祖细胞的相同重分配在Balb/c小鼠及23-25月龄BDF1中也已观察到，这些小鼠普遍具有异常高的CFU增生水平。通过与INPROL一起保温有可能矫正CFU增生和分化。与临床情况更相关的是，该研究表明体内注射INPROL(2μg/小鼠)将对CFU增生和红细胞集落(BFUe)与GM集落的比例改变带来影响。
表5INPROL对CFU分化为定型祖细胞BFUe和CFU-GM的影响骨髓供体INPROL被3HTdR杀死的CFU(％)BFUeCFU-GMBDF1(年轻)-+12.0±0.315.0±1.328.33±1.9122.00±3.7446.22±3.4447.70±3.72BDF1(老)-+47.1±1.911.4±0.743.75±1.5415.25±1.4524.0±1.3344.0±7.63用TSP刺激的BDF-+53.2±1.67.2±0.432.67±2.4412.00±1.8315.71±2.2835.50±1.4Balb/C-+57.0±1.923.0±2.447.60±2.9624.86±2.5333.57±3.4570.60±4.96实施例10 INPROL的免疫刺激活性
已经观察到，含有高比例增生CFU的骨髓细胞与INPROL保温不仅改变CFU的循环，而且改变其分化，即转换有利于粒细胞和淋巴祖细胞的占优势的红细胞分化。INPROL的这一特性因细胞毒性的化疗、放疗及伴有过度增生的干细胞紊乱及衰老的免疫抑制所产生的免疫抑制副作用而显得非常重要。
本实施例表明了INPROL对未成熟祖细胞分化成前B祖细胞的直接作用，所说的未成熟祖细胞得自根据Wittlock & Witte方法(Ann.Rev.Immun.3：213-35，1985)建立的淋巴细胞长时培养物(LLTC)，该作用是通过在含IL-7的甲基纤维素中形成的集落检测的。
如上所述建立LLTC，并用新鲜的LLTC培养基(Terry Fox Labs.，Vancouver，Canada)培养，每周二次。每周收集未粘附的细胞一次，洗涤之，使之不含任何因子，再与25ng/ml INPROL或用作对照的培养基本身一起保温4小时。之后，洗细胞，以105细胞/ml的浓度平皿接种于含30％胎牛血清和10ng/ml IL-7的甲基纤维素中。3周的数据如图13所示。对照中大的前B集落数随时间的增加而增加，但与INPROL预保温总是刺激集落的生长高于对照水平的4-8倍。这说明了INPROL的免疫刺激特性，它在纠正免疫缺陷状态和增强对例如接种的所需免疫应答有用。实施例11 INPROL改善CML病人的干细胞-
长时培养物起始细胞的群体重建能力
慢性骨髓性白血病(CML)是造血干细胞致死性的恶性紊乱。用单一药物的化疗、结合化疗、脾切除术或脾放疗治疗慢性期的CML可以控制临床体征和症状，但不能显著地延长存活时间。当CML由慢性期进展到加速期，标准疗法就失效了。目前，骨髓移植是CML唯一已知的有疗效的治疗方法。用不相关的供体BMT进行治疗由于组织相容性问题而有困难。少于40％的其它合格CML病人将有适合配对的相关供体，所以自体移植是优选的。对用于输注的自体BMT进行体外调理及从生长于长时培养物(LTC)中的Ph+病人骨髓细胞中筛选出非白血病性(Ph-)骨髓祖细胞的能力表明了正常干细胞的潜在性自体来源，能够对CML产生积极有效的治疗效果。
在有关BMT的上下文中，造血干细细胞可定义为一种能够长期产生成熟血细胞的细胞。我们利用C.Eaves和A.Eaves开发的人LTC系统进行干细胞数的定量检测并作为临床应用的工具。这包括在预先建立的、被辐射的人骨髓粘附层上接种细胞，然后将这些培养物维持5周。终点是在这一时间的最后收集的培养物的总产克隆细胞(Clonogenic cell)成分(粘附的＋未粘附的)。在这些条件下，产克隆细胞的产量与初始加入的祖细胞(长时培养物初始细胞，LTC-IC)数成线性相关；单个人LTC-IC的平均产量是每个LTC-IC产4个产克隆祖细胞。先前已证明当CML病人的骨髓在类似条件下放置，白血病性(Ph+)产克隆细胞迅速减少，通过对CML病人的残留正常LTC-IC的定量检测有可能从由培养的自体移植物移植支持的集中疗法中选择那些可能有益的。(Phillips et al.，Bone Marrow Transplantation 8：477-487，1991)。
下面的方法用于检查INPROL对由CML病人外周血建立的骨髓移植细胞中的产克隆细胞(LTC-IC)数的影响。
培养物作为长时培养物被引入预辐射的基质上。用健康供体的外周血作对照。CML病人的外周血细胞与或不与INPROL(25ng/ml)预保温4小时，洗细胞，再置于LTC-IC系统中10天和在LTC-IC中平行进行5周。通过平皿接种粘附的和未粘附的细胞于含有适当生长因子的甲基纤维素中所得的产克隆祖细胞数来估计LTC-IC数(Terry FoxLaboratories，Vancouver，Canada)。生长10天的粘附细胞和非粘附细胞的混合物与或不与INPROL预保温，并置于预先建立的培养基中8周，在第4和第8周进行收获，以检测产克隆细胞数。图14所示数据表明，在由健康的供体骨髓启动的培养的前十天没有丧失LTC-IC，培养5周后大约放入的LTC-IC数的30％依然存在。10天期间CML病人的LTC-IC数大幅下降至大约8％，进一步的保温也不能使之回复，而细胞与INPROL预保温将LTC-IC水平增至起始数的30％，并在8周中维持。
由这些初步数据所预示的INPROL的临床相关应用包括在选择性地提高新鲜的或培养的骨髓移植物的正常干细胞含量的对策中的应用；在增强体内残留正常干细胞恢复的对策中的应用；以及在将新遗传物质转移到人骨髓干细胞中以进一步移植到病人体内的方案中的应用。实施例12 从骨髓制备物中分离具有免疫活性的血液
干细胞增生抑制剂的方法
由猪肋骨分离骨髓。分离猪酮体的肋骨，清除肌纤维及脂肪，切成小块，用Biophyzpribor制造的水压平板机提取骨髓。用K-70离心机以2,000rpm离心20分钟分离骨髓细胞。然后将提取物上清分别通过Amicon膜(USA)XM-100、PM-30和PM-50进行超滤。根据电泳分析，产物的主要成分是白蛋白(参见图1)。
生物化学纯化过程
在纯化的每一步骤用含0.1％SDS的10％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析各级分的骨髓提取物和蛋白质成分。
电泳于凝胶20Ycm进行5小时。然后用溶于乙醇∶水∶乙酸(5∶5∶1)的混合物中的0.25考马斯CBBC250于20℃将凝胶染色1小时，再用几次更换的7％乙酸冲洗。向样品中加入达7％的SDS和达0.5-1％的巯基乙醇，上样已凝胶中之前将样品于70℃保温5分钟。
利用抑制造血干细胞增生的方法评估产物的活性(CFU)。
第一步 用硫酸铵沉淀法纯化
用饱和度为40-80％的25％硫酸铵沉淀法纯化活性物，其选择是基于表1的结果。
表1饱和度(％)0-4040-6060-8080-100活性(％)～37.2－35.4)＝1.8％～37.2－1.8)＝35.4％～37.2－12.8)＝24.4％～37.2－26.1)＝11.1％
确定每一步纯化之后用于试验的制备物的量与纯化的水平相一致，相当于起始产物的2×10-2mg。利用下面的公式计算活性。
％改变＝％Sa－％Sb
其中a是对照的％S
b是与测试级分保温后的％S
将级分脱盐，以在每次测试活性前和每一后继纯化步骤前将硫酸铵浓度降低20倍。
第二步。脱盐后应用第一步的不纯抑制剂，用离子交换色谱(DEAE23纤维素)分级分离，然后用乙酸钠缓冲液(pH6.0)梯度洗脱。
抑制剂的活性级分在3-5mM之间洗脱。
柱体积为1ml，洗脱速度是4ml/hr，用色谱仪Millicrome于230nm和280nm进行检测。分离表现出最高活性的级分1(参见图2)，在5mM乙酸钠缓中液中洗脱(参见表2)。表2级分12345活性 46.3－0＝46.3％46.3－14.1 ＝32.2％46.3－42.1 ＝4.2％46.3－19.6 ＝26.7％46.3－45.1 ＝1.2％
电泳数据表明从该级分中除去主要的蛋白质杂质－白蛋白(参见图3)，这将导致额外的纯化4倍。
第三步。第二步中部分纯化的抑制剂直接被用于G-75 Sephadex柱。
柱体积为20ml(20×1)，洗脱速度是2ml/hr。洗脱缓冲液为50mMNaCl，10mM Tris-HCl，pH7.5。在色谱仪Millichome上于230nm和280nm进行检测。分离具有最高活性的级分5。表3级分12345活性42.2－19.1＝23.1％42.2－35.2＝7.0％42.2－21.5＝20.7％42.2－38.8＝3.4％42.2－0＝42.2％
第四步利用Pro-REC柱的反相色谱(Pharmacia FPLC System)在溶于含0.1％三氟乙酸的乙腈梯度中的10μg Ultrasfera基质上进行。
分子量为16-17KD的产物的均质性等于90％，正如SDS-丙烯酰胺凝胶的分析中所见(参见图6)。结果如图4所示。用级分5确定活性。产物的终产率是5％。结果，纯化后16KD蛋白质的总量是起始产物的650ng/ml。在纯化过程中，将产物在70℃热保温数分钟，检测发现未见生物活性丧失。
2.体内干细胞增生测定(CFU)
在给经致死性辐射小鼠静脉内注射造血细胞8-12天后，通过其脾中形成的肉眼可见集落可以体内检测未成熟的造血祖细胞-脾中的集落形成单位(CFU-S)(Till & McCulloch，1961)。
标准的CFU增生测定通常应用3H-胸苷“自杀”法(Becker etal.，1970)。该方法是基于被放射标记的DNA前体胸苷(3H-胸苷)在DNA合成期间(细胞周期的S期)掺入细胞内。测试时处于细胞周期S期的CFU被高放射活性杀死，不能在脾中轻易地形成集落。因此，注射未与3H-胸苷保温的细胞样品所形成的CFU数与注射与3H-胸苷保温的相同细胞所形成的CFU数之差表示增生CFU的百分数。
抑制试验不能用来自未刺激动物的骨髓干细胞群进行，只要抑制剂的确作用于循环的CFU，后者在正常小鼠的骨髓中低至7-10％。
为刺激CFU增生，应用了苯肼(PHZ)刺激或亚致死性辐射(Lord，Br.J.Haem.34：441-445，1976)。
根据TSP对CFU循环的刺激作用(Byron et al.，Nature228：1204，1970)，我们发明了TSP注射液，这简化了试验，并且不引起副作用。TSP在注射后20-24小时诱导CFU增生的刺激作用，该效果至少7天都能观察到。
在纯化抑制剂的过程中，用于筛选级分的方法如下：
小鼠：所有试验过程中都用BDF1或CBF1小鼠品系。
经腹膜内注射(0.2ml/小鼠)用TSP(10mg/100g)处理供体小鼠，以诱导S期30-50％的CFU。
24小时后，从股骨取骨髓制备细胞悬浮液。5－10×106细胞/ml的细胞与不同的对照和测试级分于37℃水浴中保温3-5小时，每组用2只试管(热和冷)。
3-5小时后，3H-胸苷(1mCi/ml，比活性18-25Ci/mmole)以200μl/ml细胞悬浮液加入每只热试管中，冷试管中什么都不加，于37℃继续保温30分钟。
保温30分钟后，加入10ml含40μg/ml非放射性胸苷的冷(4℃)培养基中止杀伤反应。充分洗脱细胞(3次)。
重悬细胞，并稀释至注射用所需的浓度(通常2－4×106细胞/小鼠，0.3-0.5ml)。
在注射前不迟于6小时辐射受体小鼠(每组8-10只)。
第9-12天收获受体脾，并固定于Tellesnitsky液中，用肉眼对集落计数。用下列公式计算S期细胞的百分数：%S=a-ba100%]]>
其中a-无3H-胸苷的CFU数
b-有3H-胸苷的CFU数实施例12B 分离更大量INPROL的其它方法
初始分离
去掉新鲜猪酮体肋骨上的肌纤维和脂肪，切成片，以1∶1(w/v)浸泡于磷酸盐缓冲液中。用液压机压碎所得的混合物，将骨髓与固体骨物质分开。
收集骨髓细胞悬液，经四层粗平布滤过固体颗粒。滤液于56℃保温40分钟，然后在冰浴中冷却至4℃。以10,000g于4℃离心30分钟除去被分离的沉淀，弃之。
澄清的上清液在30分钟内滴加至10倍体积搅拌的冰冷丙酮中，后者含1％(v/v)浓盐酸。所得混合物在4℃维持16小时以完全形成沉淀。然后经以20,000g于4℃离心30分钟使沉淀物沉降，沉降物用冷丙酮洗并干燥。
HPLC纯化
将沉降物溶于含5％乙腈(MeCN)和0.1％三氟乙酸(TFA)的HPLC洗脱缓冲液A中，最终蛋白质浓度达8-10mg/ml。该溶液(0.5-0.6ml)上样于用Polisil ODS-300(10μm)装填和用相同的缓中液A平衡过的250×4.6mm HPLC柱上。
用溶于缓冲液A中的缓冲液B(90％ MeCN，0.1％TFA)梯度按照下列条件以1ml/分的流速完成洗脱过程：时间(分) B的百分数
0 0
4 0
5 25
25 90在重平衡之前用100％B洗柱5分钟。然后再次平衡柱子，使其回复至初始状态，可以上样另一部分蛋白质溶液。
在分离过程中，于280nm监测柱洗脱液以检测蛋白峰。收集含蛋白质的级分，合并分立的各峰，于30℃旋转蒸发至干燥。所得残余物溶于蒸馏水中，用生物活性试验和SDS-PAGE(14％胶，还原条件)测定。含活性物的峰是在70-80％缓中液B中洗脱，它含16KD的主蛋白带和少量由SDS-PAGE测定移动较快的蛋白。
对活性物的分析如图15所示。500μg纯化的INPROL上样到C4反相柱(Vydac)上，用含0.1％三氟乙酸的5-95％乙腈线性梯度洗脱。于53％乙腈处作为单峰洗脱出物质(图15A)。然而，当250μgMIP-1α(R & D Systems)在同等条件下过柱时，它是在43.9％乙腈处洗脱(注意：14％乙腈之前较早的峰是由于检测仪中气泡造成的假象)。因此，INPROL在相同条件下本质上比MIP-1α更具疏水性。已知TGF-β比在同样条件下观察到的INPROL以更低的浓度洗脱(Miyazono et al.J.Biol.Chem.263：6407-15，1988)。
洗脱INPROL物质的凝胶如图15C所示。1道是粗物质，2道是分子量标志物，3道是纯化的蛋白质。有两条主带，一条大约14KD，另一条大约35KD。据信35KD带是14KD带的多聚体形式。