含有软体动物毒素的生物防治剂 本发明涉及编码对农业昆虫和类似的害虫有毒的蛋白质的DNA序列，并涉及含有包含一种异源基因的基因组的生物防治剂，所说的异源基因在启动子的调控下表达至少一种所说的肽。具体地说，本发明涉及生物防治剂，更具体地说，本发明涉及含有能够表达对昆虫有毒性的肽或小蛋白质(此后称作“蛋白质”)的异源基因的生物防治剂，其中所说的蛋白质是源于软体动物的蛋白质或是功能等同于来自软体动物的蛋白质。
生物防治剂一词意指任何病毒、原核或真核生物，所说生物在与昆虫接触时能够感染昆虫，并干扰昆虫的正常生化过程并最终导致昆虫死亡。本发明范围内的合适的生物防治剂包括基于昆虫地细菌、病毒和真菌病原体的那些制剂。细菌病原体包括例如芽胞杆菌种如苏云金芽胞杆菌、蜡状芽胞杆菌等。合适的昆虫病毒病原体包括杆状病毒和昆虫痘病毒，如苜蓿银纹夜蛾、桑灯蛾等。昆虫真菌病原体包括例如白僵菌种，如球孢僵菌。
病毒是特别优选的，特别是那些其中异源基因的表达在高效启动子调控下的病毒。在杆状病毒，例如苜蓿银纹夜蛾的情况下，所说启动子是用于多角体蛋白基因的，在昆虫痘病毒组病毒，例如桑灯蛾的情况下，所说的启动子是用于河豚精蛋白基因的。
生物防治剂也可以是经遗传工程修饰过的植物内寄生菌。在其基因组中已掺入了一种能够表达对昆虫有毒性的蛋白质的基因。所说的蛋白质是原于或是功能等同于来自软体动物的蛋白质。当将所述内寄生菌与植物接触时，所说的蛋白质可以由植物体内的内寄生菌表达并对以植物为食或在植物内生活的昆虫发挥毒害作用。
生物防治剂还可以是植物本身，特别是被种植用来生产食物和纤维产品的谷类植物，其中经掺入能够表达对昆虫有毒性的蛋白质的基因己修饰了植物基因组，所说的蛋白质是源于或功能等同于来自软体动物的蛋白质。
近年来，海洋腹足类动物(“锥状小螺”)芋螺属(Conus)成员的毒素被认为是富含新的低分子量神经活性肽类，该肽类具有许多不同范围的生物效应(Olivera et al.(1990)Science 249257-263，Olivera(1991)J.Biol.Chem.266 22067-22070)。芋螺属成员通过产生高特异性化的和常常是高选择性的肽类毒素逐渐适应于猎取脊椎动物(鱼类)和无脊椎动物(软体动物、蠕虫、甲壳动物)，所述肽毒素的少数基本形式或骨架为：
CC…C…C， C…C…CC…C…C， CC…C…C…CC其中C代表半胱氨酸残基。“…”表示3到10个氨基酸长度的氨基酸短链(Olivera et al.(1990)Seience 249 257-263)。这样，就可确认主要由其所含有的半胱氨酸残基的模式来辨别的不同家族的芋螺毒素(conotoxin)(例如，α-芋螺毒素，μ-芋螺毒素和w-芋螺毒素)。这些家族的一些成员(典型的是α-芋螺毒素)具有非常相似的结构，且都是通过烟碱的乙酰胆碱受体的拮抗作用发挥作用。其它的(典型的是l-芋螺毒素)在结构上很不相同，事实上，基于存在特征性的w-芋螺毒素-型半胱氨酸主要单元以及常常“促进弯曲”的氨基酸(甘氨酸和脯氨酸)的位置，通过相似性检索已确认为结构上与更大的肽族相关。包括在这一较大族中的是这样一些种类，例如“King Kong”族芋螺毒素(Hillyard et al.(1989)Biochemistry 28 358-361，Woodward et al.(1990)EMBO J.9 1015-1020)；蜘蛛毒素，例如μ-agatoxins；蝎毒素，例如Curtatoxin 2和钳蝎属Pep 2：抗微生物蛋白，例如源于紫茉莉种子的Mj-AMP 1(Cammue et al.(1992)J.Biol.Chem.267 2228-2233)和甚至一种由杆状病毒AcMNPV编码的未知功能的肽(CTL)(Eldridge et al.J.Virology(1992)6563-6571)。这种关系在下列序列表和表1和表2中列出：Cono-KK-0 WCKQSGEMCNLLDQN--CCDG-YCIVLV-------CT [序列ID-19]Cono-KK-1 CIEQFDPCEMIRHT--CCVGV-CFLMA-------CI [序列ID-20]Cono-KK-2 CAPFLHPCTFFFPN--CCN-SYCVQFI-------CL [序列ID-21]Cono-GVIA CKSPGSSCSPTSYN--CCR-S-CNPYTK-----RCY [序列ID-31]Cono-MVIIB CKGKGASCHRTSYD--CCTGS-CNRG-K------C [序列ID-32]μ-Agatoxin3 ADCVGDGQRCAD-WAGPYCCSGYYCSCR--SMPYCRCRSDS[序列ID-33]Curtatoxin 2 ADCVGDGQKCAD-WFGPYCCSGYYCSCR--SMPYCRCRSDS[序列ID-34]Buthus Pep 2 VGCEEDPMNCKGKQAKPTCCNGV-CN----------C-NV [序列ID-35]CTL ACAETGAVCVHNDE---CCSGA-CSPIF---NY--CLPQ [序列ID-36]Mj-AMP1 QCIGNGGRCNENVGPPYCCSGF-CL-RQPGQGYGYCKNR [序列ID-37](“--”表示邻近氨基酸残基间的直接的键)
同时w-芋螺毒素本身被认为是经由压力控制的Ca2+通道发生作用，亲缘更远相关的家族成员的作用机制经常不同或者目前未知。如表1和表2所示，这就是这一大族w-芋螺毒素相关肽成员氨基酸序列的多样性，如果它们都有相似的靶目标，所述多样性会非常明显。更确切地说，这些蛋白质生物活性的多样性可以看作是一种标志，它表明基本的w-芋螺毒素分子骨架对于构建有效的小蛋白质/肽配体是非常多用的基础。由于某些w-芋螺毒素族更远相关成员中的特定的活性和起源(蜘蛛和蝎毒液)，某些显示出杀虫活性是不奇怪的。然而，从直觉上看，由于它们生存的海洋环境，没有理由相信昆虫活性芋螺毒素会对锥状小螺特别有利。因此，芋螺毒素是否提供有用的昆虫活性或昆虫选择性神经肽的天然来源之问题仍然是一个未解决的甚至是未研究过的问题不是不令人惊奇的。这样，例如，仅在一份我们清楚的报告中，从Conus textile neovaricus毒液分离的一组亲缘较近的毒素，包括“King Kong”毒素(称为“TXIA)，已从在丽绳类(Sareophaga falculata幼虫中的注射研究估价了杀昆虫活性(Fainzilber et al.(1991)Eur.J.Biochem. 202 589 -595)。未检测到活性，而对软体动物的潜在作用在低剂量时是明显的。
尽管有Fainzilber等人的报告，我们还是开始了调研，旨在确定软体动物和甲壳纲(crustacean)活性“King Kong”芋螺毒素(Hillysrd et al.(1989) Bioehemistry)(后者被弥为KK-0[SEO ID 16])(Woodward et al.(1990)EMBO J.91015-1020)和两种相关肽KK-1[SEQ ID 17]和KK-2[SEQ ID 18](在1988年10月24-28日的Jaeques Honod毒性动物会议(Aussois，Frabce)上报道)在昆虫系统中是否具有任何活性。如以下实施例1详述的，相应于报道序列KK-0、KK-1和KK-2的合成肽(参见附图7)经注射到成年美洲蠊(目别：网翅目)和幼年烟芽夜蛾和粉纹夜蛾(目别：鳞翅目)样品中来制备和估价。在每一被检测样品中KK-0和KK-1两种制剂均表现出杀昆虫和/或麻痹诱导活性。
根据Fainzilber等人的观点，即已将TXIA(等同于KK-0)注射到Sarcophaga falculata(目别：双翅目)幼虫，而无效果，我们认为我们所观察到的杀虫活性是否是KK-0和/或KK-1的一种固有的性质仍然有一些疑问，尽管合成肽制备物已经过彻底纯化，但由于其高半胱氨酸含量从而导致倾向于凝聚和形成不正确的折叠结构，在其化学合成中经历了某些困难。因此，我们所看到的杀虫活性可能是所使用的合成方法的结果。
因而，通过在杆状病毒(AcMNPV)表达系统中表达编码其前体的基因，我们扩展了对于Conus textile生的蛋白质KK-0和KK-1的杀虫性质和潜能的研究。这里我们首次报道发现了编码KK-0前体的基因能够明显缩短杆状病毒使敏感昆虫宿主丧失能力的时间。杆状病毒作用速度的这一改进引起瘫痪接着死亡，并且当与相同发育阶段的用野生型病毒饲喂的对照幼虫相比时，用KK-0重组病毒饲喂的敏感鳞翅目幼虫的大小明显降低。当敏感幼虫因食用喷洒有合适的病毒制剂的宿主植物而受到感染时，这些作用产生明显的谷类作物保护效果。这种谷类作物保护效果明显优于使用类似剂量野生型病毒所获得的效果。
使用合成基因[SEQ ID 1]获得了杆状病毒性质上的这种改进。所述基因设计来编码mRNA分子，它会依次表达“King Kong”(KK-0)芋螺毒素的假定天然前体：一种78个氨基酸的蛋白质，它在合成中很可能进入分泌途径，且最切可以作为一种前毒素被合成，所述前毒素接着被加工产生成熟KK-0，至少在Conus textile中是这样的(Woodward et al.(1990)EMBO J.9 1015-1020)。我们进行这项工作时设计合成基因没有考虑Conus textile KK-0基因的天然核苷酸序列。而设计基因时要保证：尽管它编码天然KK-0前体，但既要可使其在昆虫细胞系统中被有效地表达又要容易操作(参见实施例2中的详细内容)。尽管我们并没有因此使用Conustextile的天然KK-0基因或cDNA，但没有理由推测这种序列或者其它能够编码KK-0前体的合成基因在提高杆状病毒宿主的作用速度上不具有等同的效果。我们所使用的合成基因(sKK-0)实际上仅有77％核苷酸序列与编码天然KK-0 mRNA的序列相同。
基于表达sKK-0基因的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)的重组杆状病毒的性质，我们所研究的使人惊奇的方面是发现了病毒的性质对用来表达基因的启动子有很高的依赖性。携带sKK-0基因的多角体蛋白加(包被的)病毒在生物活性方面没有提高，所述基因在从很晚的强p10启动子开始转录的位置上，相反在另外的很晚期多角体蛋白启动子驱动sKK-0表达的多角体蛋白加(多角体蛋白+或pol+和多角体蛋白减(多角体蛋白-或pol-/非包被的)病毒中作用速度明显提高。在先文献已提出预期p10(Stewart et al.(1991)Nature352 85-88，McCutchen et al.(1991)Biotechnology 9848-852)或多角体蛋白启动子(Tomalski&Miller(1991)Nature 352 32-85&(1992)Biotechnology 10 545-549)能赋予足够的表达水平的杀虫产品。最近出版的专利申请文件在没有提供任何实质性证据的情况下假定这些启动子在表达“寄生胡蜂麦蛾茧峰的杀虫毒素”(WO93/18145 )或“Plectreurys tristis的杀虫毒素”(EP 0 556 180A2)时能提高杀虫活性。而我们不知道为什么sKK-0基因在重组AcMNPV中从p10启动子表达时不能产生杀虫活性，其中最可能的解释是对杂交多角体蛋白/sKK-0和p10/sKK-0 mRNAs的不同的稳定作用。没有理由得出结论用编码KK-0但具有不同核苷酸序列的其它基因可看到或不会看到类似的作用。同样没有演译性的理由认为这种作用对KK-0基因系统是独一无二的。我们得出结论：就哪一种启动子毒素基因组合将有希望改进病毒的效力来说，杆状病毒领域还没有达到预见性的阶段。
与我们通过赋予其表达编码KK-0前体基因的能力而成功地提高了杆状病毒(AcMNPV)的作用速度相对照，到目前为止使用经设计用来表达KK-1前体的病毒未观察到类似的改进(参见实施例14)。再者，就令人鼓舞的结果(在注射了KK-1化学合成的样品后而获得的)和事实(KK-0和KK-1前体的假定信号序列编码区的序列同一性(Woodward et al.)使我们能准确使用相同基因序列编码这一KK-1前体蛋白质(所述基因序列已采用sKK-0基因成功地被使用)来说，这一结果有点令人惊奇。基于我们用不同能力的多角体蛋白和p10启动子启动sKK-0表达的经验，为使取得可靠表达的机会最佳，我们使用sKK-1基因选择装配了多角体蛋白启动子/sKK-1表达构建体来进行我们的工作。同时我们认为我们用sKK-1所进行的工作不能肯定地得出结论，就给定的合适基因构建体来说，KK-1不能够提高重组杆状病毒杀虫剂的效力，然而，我们相信，我们所获得的结果强调了人们不能假定编码任何芋螺毒素或芋螺毒素相关肽的基因具有提高杆状病毒活性的能力。这一结论与使用Ctl(类芋螺毒素)基因的研究相一致，所述基因编码被AcMNPV表达的天然“类芋螺毒素”肽，但迄今未表现出生物学效用，这一点可由基因分离研究所证实(Eldridge et al.J.Virology(1992)6563-6571)。如表1和表2所示，尽管CTL和KK-1两者明显是w-芋螺毒素家族的成员，但两者与KK-0(＜40％)或该家族的任何其它成员仅有绝对水平低的一致性。事实上，种子来源的抗微生物蛋白质Mj-AMP1与该家族的其它成员具有很大的相似性。这样，虽然这一工作告诉我们，编码芋螺毒素和类芋螺毒素肽的基因是一个潜在的富有成果的区域，在其中可寻找能够提高杆状病毒活性的种，但它不能显而易见地指示出这样分类的哪个基因是有效的。
考虑KK-0发挥作用使昆虫害虫失去致害能力的作用模式时，须考虑在昆虫和软体动物中可能识别等同靶蛋白质。就软体动物、甲壳动物和昆虫之间的进化距离来说，如果昆虫中KK-0靶结构与在Conus textil e的天然海洋被捕食物中发现的完全等同会是非常令人惊奇的。因此，KK-0将进化为昆虫靶的完整配体是不可能的。通过逐渐演变对与软体动物或甲壳动物相反的昆虫靶蛋白具有更大的特异性，极有可能使KK-0蛋白作为一种杀虫剂而得到进一步提高。可通过本领域技术人员熟知的蛋白质工程方法获得这种演变。最有力的这类方法昆然是近年来发展的肽文库方法中的一种。这类方法告诉了相对简捷的同时随机形成高达6个氨基酸然后从产生的肽群体中选择特异性提高的变异体(高达6.4×107变异体)的方法。6个氨基酸组成6/27或22％的KK-0肽，因此我们断定编码与KK-0有高达
100-22＝78％同源性的蛋白质之基因是既敏感又实用的，从中可寻找对昆虫甚至鳞翅目昆虫选择性提高的KK-0变导体。因此，认为这类变异体包括在本发明的范围内。
这样，本发明首先提供了Conus textile KK-0和KK-1蛋白质的合成制剂的用途，将所述蛋白质正确施用于敏感的有害昆虫时能发挥杀虫作用。
本发明其次提供了天然的、合成的或半合成的编码Conustextile KK-0芋螺毒素前体的基因，通过在比亲本野生型杆状病毒宿主早的时期内，经诱导使敏感昆虫失去致害能力以提高重组杆状病毒的作用速度。杆状病毒可以是基蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)或经可得到或研究的适宜的遗传工程或操作技术加工的任何其它病毒种类，其中，如果需要，可优化置入KK-0基因进行表达的范围。
另一方面，本发明提供了优先于p10启动子的杆状病毒多角体蛋白启动子的用途，以启动编码Cornus textile KK-0芋螺毒素前体的天然的、合成的或半合成基因的表达。
本发明还提供了编码KK-0芋螺毒素前体的合成基因的设计方案，所述基因很容易用多种已知的技术进行构建，而且当从高效启动子(包括AcMNPV多角体蛋白启动子但不包括AcMNPV p10启动子)表达时，使重组杆状病毒作用速度明显提高。
相应地，本发明提供了编码基因之合成DNA序列或其功能等同物，或遗传密码简并性允许的变异体，所述基因能够表达具有附图1所示之序列的蛋白质。此外，本发明提供了一种具有附图1和附图2所示之序列的合成DNA，或其功能等同物，或遗传密码简并性所允许的变异体。
另一方面，本发明提供了一种防治前面所提出的昆虫种群的方法，其中毒素是由权利要求1或权利要求2所述的DNA序列表达的肽或其对昆虫发挥毒性作用的片段或变导体。
另外，本发明提供了表达单位结构/功能(启动子/KK-0芋螺毒素基因组合)的半经验筛选方法的用途，以确保使用芋螺毒素基因的最佳方法，从而提高重组生物防治剂的效力，所述生物防治剂可基于AcNMNPV任何其它杆状病毒、昆虫痘病毒、任何其它昆虫病原体病毒，球孢僵菌、绿僵菌、任何其它合适的昆虫病原体真菌或任何合适的植物宿主。
本发明还特别提供了编码一种肽或蛋白质，或所述肽或蛋白质之前体的基因的用途，所述蛋白质或肽与Conus textile KK-0都有大于77％的同源性以提高杀虫生物防治剂的效力。所述基因可以选自任何合适的天然源，包括但不限于锥体小螺、蜘蛛、蝎子和种子，或可以由任何合适的蛋白质工程技术产生。
本发明也提供了一种在一定的位点，如生长的植物上通过对昆虫或在昆虫所在位点施用对那些昆虫有毒的肽，从而防治昆虫种群的方法、所述肽功能等同于源于芋螺属软体动物，如Conus textile的KK-0或KK-1肽，并与上述KK-0或KK-1肽有77％以上的同源性。
本发明还提供了一种运送载体，该载体掺入了编码能够表达具有附图1所示序列之蛋白质的基因之DNA序列或其功能等同物，或遗传密码简并性允许的变异体，或者另一种情况是掺入了具有附图1或附图2所示序列的DNA或其功能等同物或遗传密码简并性允许的变异体。优选的运送载体是一种质粒，例如一种适用的与杆状病毒基因组的修饰有关的质粒，如已知的pVL1392。其它质粒载体包括例如已知的pAcUW21。
一种基于pVL1392掺入了附图1和附图2的DNA序列的质粒已被导入到大肠杆菌中，并且在1993年3月12日以NCIMB 40540保藏号保藏在国家工业和海洋细菌收集中心(Aberdeen UK)。
用下列实施例说明本发明的各个方面。
实施例1生物估测“King Kong”(KK-0)，KK-1和KK-2肽的合成制剂
KK-0、KK-1和KK-2肽合成制剂的生物活性的初步估测通过使用成年蟑螂(非洲大蠊：Blattidae：网翅目)和五龄期烟草芽幼虫(烟芽夜蛾：Noctuidae：鳞翅目)的一系列注射研究完成。
所述蛋白质不溶于蒸馏水和通常用于注射用的标准含水缓冲液。将KK-0和KK-1以10mg/ml浓度悬浮在0.1M碳酸氢铵中。轻轻搅动1小时后，悬浮液经0.2μm滤器过滤。肉眼观察表明，约50％的KK-0产物被溶解，而基本上很少的KK-1产物被溶解。这给直接准确定量和比较不同蛋白质的剂量比率造成了困难。但估测所提供的最大剂量是可能的。KK-2疏水性很强，以每ml 10mg粗产品的浓度溶解在DMSO中。
用10μl装有15mm33号针头的汉密尔顿注射器注射烟草芽虫幼虫(TBW)。平均体重约300mg的早期5龄幼虫以每次处理时注射1-4μl。典型地是每次处理至少有5个重复用50μl装有15mm27号针头的汉密尔顿注射器注射成年雄性蟑螂。每支动物接受1-10μl待试溶液的剂量。平均体重约840mg。对照昆虫用等体积的适宜溶剂注射。
注射后，在控制条件(25c，65％RH)下于容器中供给食物单个饲养处理过的昆虫达72小时，进行周期性观察，以检查出任何非正常症状。烟草芽虫
将KK-0和KK-1注射到烟芽夜蛾幼虫中引起“软弱瘫痪”特征(表III)，典型地、注射后幼虫几乎马上表现出昏迷症状。受影响的幼虫不能站立和/或协调地行走。而且，当腹部朝上时，它们不能转过来，并且对刺激(用木制尖棒轻刺)的反应仅限于嘴部和尾部的微弱运动。在昏迷的高峰，受影响的幼虫是柔弱的。这些作用是相对短暂的，然而，完全恢复通常发生在注射后5-10分钟，处理后24小时(24HAT)时，所有幼虫存活并完好。更高剂量的注射导致症状的严重程度和持续时间两者的增加。使用KK-0症状显得更显著。
在以单个比率等同于约每支幼虫10μg蛋白质(即33μg蛋白质mg幼虫)的最大剂量给烟芽夜蛾注射KK-2蛋白质后观察不到异常现象。蟑螂
所有三种蛋白质对蟑螂产生明显的和使其衰弱的作用(表IV)。在每一种情况下，作用程度随注射的蛋白质悬液体积的增加而增加。
给蟑螂注射KK-0蛋白质悬液起初引起严重的发抖，接着失去协调性，麻醉然后倒下。该作用首先在后腿观察到，接着迅速扩散到中部，最后到导致昆虫倒下的前腿。其它症状包括背部弯曲。感染过的昆虫不能恢复并且在处理后22小时时死亡。用KK-1蛋白注射的昆虫尽管在1μl蛋白质悬液的最低剂量时的受影响程度稍低，但表现出类似的症状。
在用2和5μl KK-2蛋白注射的昆虫中也明显观察到异常作用。症状包括背部弯曲、翅膀倒伏、协调移动能力丧失，这些症状在注射后几分钟内发生。该作用表现出暂时性，受影响的昆虫在注射后的20分钟时完全恢复。然而，这样处理的所有动物在处理后72小时时死亡。在用最低比率(1μl体积)处理的昆虫中没有记录到异常症状，所有昆虫在处理后72小时时存活并完好。
这些观察结果被后续的实验所证实，它说明芋螺毒素蛋白具有针对蟑螂和TBW幼虫的杀虫活性。
实施例2合成King Kong(sKK-0)芋螺毒素基因设计
由于没有经验性的理由相信天然KK-0基因密码子的使用特别有利于在昆虫细胞中表达，因此我们决定设计一种新的合成(sKK-0)基因。这一设计在如TRANSL、RESTRI和MUTSITE之类的PCGeneTM(Intelligenetics，700 East Camino Real，Mountain View，California)程序的帮助下进行。
sKK-0基因的特征为：-它准确编码Woodward等人通过其cDNA克隆研究后描述((1990)
EMBO J.9 1015-1020)的KK-0原肽的氨基酸序列[SEQ ID 2]-选择用于编码KK-0原肽的密码子，因为它们有利于或者，至少
经常出现在昆虫(果蝇)和酵母(啤酒酵母)中，因而人们预期
也可以在后面的生物体中进行表达研究(Ashburner et al.
(1984)Develop.Genetics 4 295-312：Ikemura(1985)
Mol.Biol.Evol.213-34：Sharp(1986)Nucleic Acids
Research 14 5125-5143)-直接在翻译起始密码子(ATG)之前的核苷酸序列与由Kozak定义
的动物mRNAs的优选序列紧密配对((Kozak(1981)Nucleic
Acids Research 9 5233-5252：Kozak(1984)Nucleic
Acids Research 12 857-873：Kozak(1986)Cell 44
283-292：Kozak(1987)J.Mol.Biol.196 947-950)。-一点也不用考虑Conus textile所用的编码KK-0原肽的密码
子(结果，sKK-0和天然KK-0基因的总同源性仅为77.2％)。-在设计中掺入了侧翼限制性酶识别位点(上游的BglII，和下游的XmaIII和BamHI)以有利于直接克隆到开始选择的杆状病毒转移载体pVL1392(InVitrogen Corporation，3985 Sorrento ValleyBoulevard，San，Diego，California)。预期采用这些酶的克隆产生直接从由该转移载体携带的AcMNPV多角体蛋白启动子的开始转录基因的潜力(参见附图4)。-在基因的不同位点上，将几种附加的独特的六核苷酸识别序列位点掺入到sKK-0序列中，但不影响编码的氨基酸序列。包括这些位点是为了有利于重组特征化和可能的基因操作(参见实施例14)。没有一个掺入位点会导致包含特别不合适的密码子。
所形成的sKK-0序列[SEQ ID 1]示于附图1，着重说明KK-0原肽的编码序列，附图2中着重说明限制性酶识别位点的位置。
实施例3sKK-0基因的合成
选择用来装配sKK-0基因的策略涉及合成编码附图1和附图2所示DNA片段的重叠互补寡核苷酸，接着DNA聚合酶介导合成单链区然后是聚合酶链反应(PCR)扩增以产生大量的完整基因片段(参见附图3)。
在Applied Biosystems 380B DNA合成仪上用标准方法合成共同编码完整sKK-0 DNA片段的4种寡核苷酸(ConoA、ConoB、ConoC、ConoD)[SEQ ID 3、4、5、6]。还合成了两种另外的较短的寡核苷酸：ConoPCR1&ConoPCR2[SEQ ID 7、8]用作PCR引物，所述的寡核苷酸与ConoA和ConoD 5′的30和28个核苷酸相同。每一种寡核苷酸在55℃下保温约8小时接着在真空下干燥去保护。将它们溶解在200ml TE缓冲液(10mM Tris/HCl(pH8.0)，1mM EDTA)中，浓度以UV光谱仪测定(1 OD260单位/ml，等于约20μg/ml)并用TE稀释以得到约10μM母液。将它们在-20℃下贮存直至使用。然后sKK-0合成反应包括：1)将10μM ConoA和ConoB各5μl在灭菌的500μl锥形聚丙烯微管中与5μl 10mM dGTP、10mM dATP、10mM dCTP、10mM TTP和5μl 500mM KCl、100mM Tris-HCl(pH8.5)、15mM MgCl2，0.1％明胶混合、在用2滴轻石蜡油(Sigma)铺盖之前，加水至49μl然后加入1μl(5个单位)Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus)。然后该管加盖，置入Techne PHC-1Programmable Dri-BlockR中，进行下列温度循环：-
1.1＇@ 94℃
1＇ @ 55℃
4＇ @ 73℃
5次，接着进行7′@73℃的最终温育期。2)将10μM ConoC和ConoD各5μl混合完全，用(1)的方法处理。3)取0.5μl反应1)产物与0.5μl反应2)产物混合和5μl反应1)产物与反应2)产物混合。向每一混合物中各加入10μl 10μMConoPCR1、10μl 10μM ConoPCR2、10μl 500mM KCl、100mM Tris-HCl(pH8.5)、15mM MgCl2、0.1％明胶、10μl10mM dGTP、10mM dATP、10mM dCTP、10mM TTP，然后加入1μl(5个单位)Taq DNA聚合酶(Perkin/Elmer Cetus)之前用加水至99μl，最后用两滴轻石蜡油铺盖。平行建立对照反应，对照反应中无PCR引物、反应1)或反应2)产物。然后将反应在Techne Programmable Dri-BlockR中，进行下列温度循环：-
1.1＇@ 94℃
1＇ @ 68℃
4＇ @ 73℃
25次，接着进行7′@73℃的最终温育期。
然后，在10μl反应3)产物等分样品的分析琼脂糖凝胶上电泳证实，仅在包含了所有必需的DNA片段和寡核苷酸的那些反应中产生了约270bp的片段。在用乙醇沉淀回收前，每种DNA片段的残余物用经等体积水饱和的苯酚(2次)和等体积水饱和的n-丁醇(2次)的抽提进行整理。
实施例4pVL1392/sKK-0重组转移载体的装配
回收后，每一种上述PCR产物按照制造商推荐的方法用BglII和EclXI(XmaIII的一种同裂酶)限制性酶消化。5μl pVL1392等分样，一种商业上可购得的杆状病毒(AcMNPV)转移载体(InVitrogen)平行地进行类似处理。然后限制消化产物在含有0.5μg/ml溴化乙锭的制备0.8％琼脂糖/Tris-乙酸盐电泳凝胶上电泳。在UV照射下从所述凝胶上切下PCR产物和线性化的载体DNA片段。然后用经硅化玻璃毛状物的离心和乙醇沉淀回收它们。在合适的缓冲条件(SambrookJ.，Fritsch E.F.& NaniatisT.(1989)“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”。Cold Spring Harbor Press)下将纯化的插入物和载体DNA片段的等分样与T4连接酶混合。然后，用标准方法(Sambrook et al.同上)用该连接混合物转化感受态DH5α细胞。通过在含有100μg/ml氨苄青霉素的L-琼脂板上生长过夜来选择子代转化体。
然后，用标准方法(Sambrook et al.同上)在HyBond-N(Amersham International)滤器上通过菌落杂交筛选出存在与sKK-0基因互补之序列的转化体。所用的杂交探针是寡核苷酸ConoB，它已经用g32P-ATP(Amersham International)和T4多核苷酸激酶(Northumbria Biologicals Ltd.)使5′磷酸化。从六个强杂交菌落制备质粒DNA。这些DNA的限制性分析说明，三种为含有具有预期的sKK-0的大小和特征相近的插入片段的pVl，1392衍生物。
然后，用SequenaseTM(USB Cleveland Ohio)盒和两种合成寡核苷酸引物(pVL1392FOR和pVLl392REV)[SEQ ID 13、14]检查存在于选择出的pVL1392重组体(#2.2，#5.2和#6.1)中的插入物序列，所述引物设计来与位于BalII和XmaIII识别位点侧的pVL.1392区杂交，并可测定那些位点之间的任何导入插入物之序列(参见附图4)。在三种重组体之一(#2.2)中的插入物的序列与以预期方式克隆的sKK-0的准确配对(参见对图5)。其它质粒包含具有最小序列变异体(突变)的插入物。
因此在随后所有的研究中选用重组体#2.2(含有位于AcMNPV多角体蛋白启动子转录控制下的基因sKK-0的转移载体pVL1392的一种衍生物)。携带有重组体质粒pVL1392/sKK-0#2.2的大肠杆菌DH5α培养物以NCIMB 40540的保藏号保藏在国家工业和海洋细菌保藏所(Aberdeen，UK)。
实施例5生产携带sKK-0的重组(多角体蛋白减)AcMNPV
采用如在King&Possee(1992)“The BaculovirugExpression System：A Laboratory Guide”(Chapman&Hall)中描述的标准杆状病毒技术通过用约200ng SauI(Boehringer，Mannheim)线性化的AcMNPV.lacZ(Possee&Howard(1987)Nueleic Acids Research 15 10233-10248)和1μg pV11392/sKK-0#2.2 DNA共转染Sf21细胞来产生重组AcMNPV病毒，所述病毒携带在多角体蛋白启动子转录控制下的sKK-0，但没有功能性多角体蛋白基因。重组病毒的选择开始是基于重组lacZ-病毒在Sf21细胞单层培养产生的噬菌斑中失去代谢X-gal(GIBCO/BRL，GrandIsland，New York)的能力。收集六种这样的lacZ-病毒(“CONO-A”、“CONO-B”、“CONO-C”、“CONO-D”、“CONO-D”和“CONO-E”)，并将其重铺在Sf2l细胞上以将其纯化至均一并证实其无合成半乳糖苷酶的能力。通过在25cm2组织培养瓶(Bibby，Stone，Staffs.)中的4ml.TC 100/7.5％牛胎血清培养基(两者来自GIBCO/BRL)接种1.5×106Sf21细胞，在28℃培养过夜，加入50％通过挑出单个纯化的噬菌斑而回收的病毒，接着在28℃下进一步培养6天、而制备每种纯化病毒的小规模(约4ml)培养物。然后取这些病毒中的每一种之等分样原液进行生物试验(参见实施例6)，平行等分样用于制备进行物理分析的病毒DNA的小样(King &Possee(1992)同上)。
用有希望的sKK-0/AcMNPV重组体进行的诊断性物理分析有：-a)用sKK-0和平行地β半乳糖苷酶基因特异性引物进行的PCR研究。b)对病毒DNA的Southern印迹分析，所述DNA用ClaI和BglII处理，
在1％琼脂糖凝胶上电泳分离、转移到HyBond-N滤膜上，与分
离的随机引物α32P-dCTP标记的sKK-0探针杂交。
这些研究证实，病毒“CONO-C”含有sKK-0基因，具有所有
所期望的物理特征，并缺乏β半乳糖苷酶基因。其它预期的重组
病毒没有sKK-0基因。
实施例6生物检测预期的AcMNPV/pVL1392/sKK-0重组病毒
用使用晚期烟芽夜蛾幼虫的系列注射研究估测推定的AcMNPV/pVL1392/sKK-0病毒的生物活性。用10μl装有15mm33号针头的汉密尔顿注射器将纯化的非闭合病毒的等分样注射到第四或第五龄的烟芽夜蛾幼虫中。通常每次处理用1μl标准体积的病毒悬浮液注射至少5只幼虫。对照昆虫注射等体积的AcMNPV/pVL1392/lacZ病毒，AcMNPV野生型病毒或无菌水。注射后，幼虫用人工食料单个饲养并在此后的7天内每隔24小时检查一次。在每一种估测的情况下记录存活和死亡的幼虫数目。检查存活幼虫的任何异常症状和/或行为反应。
开始，检测按实施例5中的描述所产生的六种推定的AcMNPV/pVL1392/sKK-0克隆等分样。仅有一种，AcMNPV/pVL1392/sKK-0 CONO-C表现出异常影响。生物观察证实实施例5中描述的物理分析表明，仅CONO-C病毒携带sKK-0基因，并具有所有预期的物理特征。使用滴定的病毒母液进行进一步的注射试验以描述AcMNPV/pVL1392/sKK-0 CONO C的生物学特征。
在表V中列出了比较AcMNPV/pVL1392/sKK-0 CONO-C和AcMNPV/pVL1392/lacZ病毒抗早期第四龄夜芽夜蛾幼虫之生物效力的数据。处理后72小时(72HAT)时，用AcMNPV/pVL1392/sKK-0 CONO C处理过的4/11幼虫表现出完全或部分表现出无力的瘫痪。分类为“完全瘫痪”的幼虫是半死状态的：不能站立，翻身或行走，受到刺激时仅有嘴部和尾部有微弱的运动。尽管前部区域包括头和嘴部能对刺激产生正常的反应，“部分瘫痪”幼虫表现出身体中部和后部区域的局部瘫痪。这些幼虫尽管移动很慢且协调性差，但当其腹部朝上时可以翻身并能做有限的移动。在处理后96小时，用AcMNPV/pVL1392/sKK-0 CONO C病毒处理过的所有幼虫要么死亡，要么表现出异常症状。相反，在处理后96小时所有用AcMNPV/pVL1392/lacZ对照病毒注射的幼虫都存活并行为正常：这些幼虫的1/10在处理后12小时死亡，6/10的幼虫在处理后144小时死亡。携带lacZ基因的AcMNPV/pW1392衍生物致死速度比野生型病毒的慢。一般，野生型AcMNPV在处理后120小时和其后开始产生明显的死亡率。这样可以得出结论，AcMNPV/pVL1392/sKK-0 CONO C构建体比AcMNPV野生型和AcMNPV/pVL1392/lacZ对照病毒有更快的作用速度，因此有提高的杀虫作用。
实施例7pAcUW21/sKK-0重组转移载体的装配
根据制备多角体蛋白+(包含的)重组AcMNPV/sKK-0衍生物的目的，该衍生物是口服感染性的，因此能真实估测剂量反应作用和估测谷物保护作用，我们开始时选择pAcUW21转移载体(AMSBiotechnology(UK)Ltd.)。这种转移载体是转移载体pAcUW2b的简单衍生物(Possee R.D.，personal communication)，由于在有效的后p10启动子控制下表达昆虫选择毒素基因，以前用pAcUW2b成功地制备了能够赋予加速的生物作用的重组病毒(Stewart et al.(1991)Nature 352 85-88McCutchen et al.(1991)Biotechnology 9 848-852)。
为了释放合适的sKK-0插入物导入到pAcUW21 20μg pVL1392/sKK-0#2.2质粒DNA的等分样用EcoRI和BglII限制性酶进行消化。10μg pAcUW21转移载体DNA的等分样进行类似的处理。然后在含有0.5μg/ml溴化乙锭的制备性1％琼脂糖/Tris-乙酸盐电泳凝胶上进行限制性消化。释放出的sKK-0插入片段(约282个碱基对)和线性化的载体DNA在UV照射下从凝胶上至下，然后通过硅玻璃毛状物经离心和乙醇沉淀回收它们。
在合适的缓冲条件(Sambrook et al.(1989)in“MolecularCloning：A Laboratory Manual”(Cold Spring Harbor Press))下将纯化的sKK-D插下片段和pAcUW21载体DNA片段的等分样与T4连接酶混合。然后按标准方法(Sambrook et al.ibid)用连接混合物转化感受态DH5α细胞。用在含有100μg/ml氨苄青霉素的L-琼脂板上生长过夜的方法选择子代转化体。从六种推断重组克隆制备质粒DNA。这些DNAs的限制性分析表明、所有六种都是含有具有预期sKK-0大小和特征之插入片段的pAcUW21衍生物。
然后，用SequenaseTM(USB，Cleveland，Ohio)盒和经设计与sKK-0插入片段杂交的两种寡核苷酸引物检查存在于以上六种重组体中两种(#A1和#A2)中的插入片段的序列。两种克隆的插入片段的序列中与用设计方法克隆的sKK-0的预期序列准确配对。
因此选用来重组#Al，即含有在AcMNPV p10启动子转录控制下的基因sKK-0的转移载体pAcUW21的一种衍生物进行其后的研究。这一重组转移载体还具有在天然多角体蛋白启动子控制下的完整AcMNPV多角体蛋白基因。
实施例8生产携带p10启动子/sKK-0基因表达单位的重组(多角体蛋白+)AcMNPV
用标准杆状病毒技术(king & Possee(1992)“TheRaculovirus Expression System：A Laboratory Guide”(Chapman & Hall))生产携带位于p10启动子转录控制下之sKK-0基因的多角体蛋白+(包含的)AcMNPV衍生物。这一过程通过用200ng。SauI(Boehringer Mannheim)线性化的AcMNPV.LacZ(Possee& Howard(1987)Nucleic Acids Research 15 10233-10248)和1μg pAcUW21/sKK-0重组#A1 DNA共转染Sf21细胞来完成。经在Sf21细胞单层上的噬菌斑纯化(King & Possee(1992)同上)来选择候选重组AcMNPV/sKK-0病毒，这一选择是通过首先筛选不能代谢X-gal(GIBCO BRL，Grand Jsland，New York)和能产生多面体(病毒包含体)的病毒，用显微镜制作。挑选出六种这样的LacZ-病毒(AcMNPV/pAcUW21/sKK-0#1，AcMNPV/pAcUW21/sKK-D#2、AcMNPV/pAcUW21/sKK-0#3、AcMNPV/pAcUW21/sKK-0#4、AcMNPV/pAcUW21/sKK-0#5、和AcMNPV/pAcUW21/sKK-0#6)。用上述六种克隆在Sf21细胞单层上进行第二次噬菌斑试验以将其纯化为同质的，并证实其无合成β-半乳糖苷酶的能力和有产生多角体的能力。
按实施例5中描述的方法制备每一纯化病毒的小规模培养物。每一种这些病毒母液的等分样用来进行生物实验(参见实施例9)。平行等分样用来制备进行物理分析的病毒DNA的小样。
在预期的AcMNPV/pAcUW21/sKK-0病毒DNAs上进行Southern印迹分析。这些DNAs用(a)HindIII和(b)EcoRI和BamHI处理，在1％琼脂糖凝胶上的电泳分离、转移到Hybond-N滤膜上，与分离的、随机引物α32P-dCTP标记的sKK-0探针杂交。
这些研究证实，病毒AcMNPV/pAcUW21/sKK-0#1、AcMNPV/pAcUW21/sKK-0#4和AcMNPV/pAcUW21/sKK-0#5每一种均含有sKK-0基因，具有所有期望的物理特征，缺乏β-半乳糖苷酶基因，并产生多角体蛋白+病毒粒子。
选择病毒AcMNPV/pAcUW21/sKK-0#1进行所有后续研究。
实施例9预期的AcMNPV/pAcUW21/sKK-0重组病毒的生物检测
用一系列抗烟芽夜蛾的注射和口服给药研究估测了推定AcMNPV/pAcUW21/sKK-0病毒的生物学性质。用实施例6中概述过的方法完成使用纯化的非包含病毒材料的注射试验。用修改过的Hughes和Wood研究出的用于新生幼虫的逐滴加入法((1981)J.Inverteber.Pathol.37，54)进行使用纯化的多面体的口服给药试验。对六种按实施例8的方法产生的推断的AcMNPV/pAcUW21/sKK-0病毒进行的初步注射研究表明仅三种克隆(AcMNPV/pAcUW21/sKK-0#1、#4和#5)携带sKK-0基因。某些用这些病毒处理过的幼虫表现出异常症状，该症状开始表现出与在用AcMNPV/pVL1392/sKK-0 CONO C病毒处理过的昆虫中观察到的那些相似。然而，对AcMNPV/pAcUW21/sKK-0#的后续研究证实，这些“异常”作用一般特定性差，且不能使昆虫特别衰弱，还证实，从作用速度或杀虫作用来讲AcMNPV/pAcUW21/sKK-0#1与野生型AcMNPV相比没有明显的优势。比较AcMNPV/pAcUW21/sKK-0#1和野生型AcMNPV生物效力的口服给药研究证实这些观察结果。
实施例10制备用于生产重组AcMNPV的AcUW1-PH DNA
考虑到与多角体蛋白AcMNPV衍生物(其中sKK-0基因从p10启动子表达(实施例7、8和9))相比多角体蛋白-/AcMNPV衍生物(其中sKK-0基因从多角体蛋白启动子(实施例4、5和6)的不同行为，我们决定构建一种多角体+衍生物，其中从多角体蛋白启动子开始表达sKK-0基因。以了解用多角体蛋白启动子/sKK-0表达单位而不用p10启动子/sKK-0表达单位时是否可获得改进的杀虫效力。
选择作为多角体蛋白启动子/sKK-0表达单位受体的病毒是AcUW1-PH(参见Weyer et al.(1990)J.Gen.Virol.71 1525-1534和附图6)。这一病毒携带了一个p10启动子/多角体蛋白基因表达单位(在野生型AcMNPV中p10基因的位置上)和多角体蛋白启动子/lacZ指示基因表达单位(在通常由多角体蛋白基因的位置上)。因此，在Sf21细胞单层上它会形成噬菌斑，所说的细胞单层携带了AcMNPV包含体并且在X-Gal指示剂存在的情况下呈蓝色(GIBCO/BRL，Grand Island，New York)。因此，期望用pVL1392/sKK-0#2.2重组转移载体的多角体蛋白启动子/sKK-0表达单位取代多角体蛋白启动子/lacZ表达单位是制备携带多角体蛋白启动子/sKK-0基因表达单位的多角体蛋白+AcMNPV衍生物的一种方便的方法。
Dr R.D.Possee(NERC Institute of Virology andEnvironmental Microbiology，Mansfield Road，Oxford)友好提供了一种未知滴定度的AcUW1-PH病毒材料。按以下方法制备这一病毒的小规模扩增培养物：在25cm2组织培养瓶(Bibby，Stone，Staffs)中的4ml TC 100/10％胎牛血清培养基(两者均来源于GIBCO/BRL)中接种3组1.5×106Sf21细胞，在28℃培养过夜，接着加入50μl、5μl该材料病毒和5μl该材料病毒1∶10的稀释液至每一瓶中，接着在28℃进一步培养6天。这些小规模扩增物用标准噬菌斑试验技术(King & Possee(1992)“The BaculovirusExpression System：A Laboratory Guide”(Chapman & Hall))进行滴定。所有获得的噬菌斑含有包含体，在有X-Gal存在的情况下呈蓝色。从最初50μl放入的培养物产生的病毒母液的滴定度为2.3×107pfu/ml，并从纯化的病毒母液产生更大的，200ml旋转器AcUW1-PH母液培养物，用标准方法(King & Possee(1992)同上，和Possee & Howard(1987)Nucleic Acids Pesearch 1510233-10248)随后制备病毒DNA。按照制造商推荐的条件用SauJ(Bochringer)消化3μg病毒DNA制备线性AcUW1-PH DNA母液，因为SauI仅在β半乳糖苷酶基因内切割，与用AcMNPV.lacZ相比，这将是有利于重组AcMNPV子代产生和检测的过程(King & Possee(l992)同上)。
实施例11生产携带多角体蛋白启动子/sKK-0基因表达单位的重组(多角体蛋白+)AcMNPV
用标准杆状病毒技术(King & Possee(1992)同上)，经使用SauI线性化的AcUW1-PH病毒DNA产生重组AcMNPV病毒，所述病毒携带在多角体蛋白启动子转录控制下的sKK-D：具有活性多角体蛋白基因，其中的病毒DNA作为来源于pVL1392/sKK-0#2.2的多角体蛋白启动子/sKK-0表达单位的受体。用200ng按实施例10中制备的SauI线性化的AcUW1-PH DNA和1μg pVL1392/sKK-0#2.2DNA的共转染Sf21细胞来完成。使用噬菌斑检测技术(其中，病毒在Sf21细胞单层中产生噬菌斑)，经首先筛选缺乏代谢X-Gal(GIBCO /BRL，Grand Island，New York )能力但保持产生包含体(多面体)能力的病毒来选择重组病毒。挑选出六种这种的lacZ-病毒(AcUWl-PH/KKO#1、AcUW1-PH/KKO#2、AcUW1-PH/KKO#3、AcUW1-PH/KKO#4、AcUW1-PH/KKO#5、AcUW1-PH/KKO#6)。用上述六种克隆在Sf21细胞单层上进行第二次噬菌斑检测以将其纯化为同质的，并证实其无合成β-半乳糖苷酶的能力而有产生多面体的能力。用与实施例5中描述的方法相同的方法制备每一纯化病毒的小规模培养物。每一种这些病毒母液的等分样用来进行生物实验(参见实施例12)，平行等分样用来制备进行物理分析的病毒DNA小样。
对预期的AcUW1-PH/pVL1392/sKK-0病毒DNAs上进行Southern印迹分析。这些DNAs用BglII和BscI(ClaI的一种同裂酶)处理，在1.4％的琼脂糖凝胶上电泳分离，转移到Hybond-N滤膜上，用随机引物α32P-dCTP标记的sKK-0探针杂交。这些研究证实，病毒AcUW1-PH/sKK-0#2，AcUW1-PH/sKK-0#4、AcUW1-PH/sKK-0#5和AcUW1-PH/sKK-0#6每一种都含有sKK-0基因，具有所有预期的物理特征，缺乏β-半乳糖苷酶基因，产生多角体蛋白+病毒粒子。
选用病毒AcUW1-PH/sKK-0#2来进行后续的研究。
实施例12预期AcUW1-PH/pVL1392/sKK-0重组体病毒的生物检测
用一系列抗烟芽夜蛾的注射和口服给药研究估测了推定AcUW1-PH/pVL1392/sKK-0重组病毒的生物学效力。用实施例6中描述的方法，使用纯化的非包含病毒母液进行注射试验。使用实施例9中描述过的修改过的逐滴加入法进行使用纯化的多面体的口服给药研究。
比较按照实施例11的方法产生的六种推断的AcUW1-PH/pVL1392/sKK-0病毒的初步注射研究表明与野生型病毒相比仅病毒AcUW1-PH/sKK-0#2、AcUW1-PH/sKK-0#4、AcUW1-PH/sKK-0#5和AcUW1-PH/sKK-0#6，可能具有提高的杀虫作用。筛选AcUW1-PH/pVL1392/sKK-0#2按比例扩大并进一步描述其特征。
注射检测资料表明，用AcUW1-PH/pVL1392/sKK-0#2病毒处理过的幼虫从接下来的处理后72小时表现出异常症状(表IV)，到处理后96小时，大多数幼虫死亡，且幸存者是瘫痪的。所有幼虫在处理后144小时死亡。相反，用野生型AcMNPV处理过的昆虫中直到处理后120小时(此时50％幼虫死亡)没有观察到异常作用；用野生型AcM4NPV处理在处理后144小时时记录到100％死亡率。
使用纯化的多面体进行了一系列口服给药研究以比较AcUW1-PH/pVL1392/sKK-0和野生型AcMNPV的生物效力。在所有情况下，与野生型相比AcUW1-PH/pVL1392/sKK-0#2表现出明显更快的杀灭速度，因此具有改进的杀虫作用。用AcUW1-PH/pVL1392/sKK-0病毒处理过的幼虫在接下来的处理后72小时起表现出瘫痪症状和死亡(表VII)。剂量反应的概率分析数据证实、AcUW1-PH/pVL1392/sKK-0#2在处理后72和96小时杀灭速度明显快于野生型AcNNPV，但在处理后120小时时，野生型病毒的速度跟上。
实施例13构建并克隆编码KK-1芋螺毒素的合成基因
如Woodward等人报道((1990)EMBO J.9 1015-1020)的锥体小螺Conus textile产生一系列指定属于“King Kong”毒素家族的低分子量神经活性肽，如实施例1中描述的，KK-0和KK-1两者的化学合成制剂注射到一组昆虫害虫样本中表现有明显的作用。实施例2、3、4、5、6、10、11和12中描述的研究给出了进一步的证据表明能够表达合成KK-0基因的AcMNPV衍生物的杀虫活性有实质性的改进，我们也研究了KK-1对重组AcMNPV病毒行为的影响能力。
Woodward等人描述(同上)了KK-1毒素mRNA的序列，该序列作为在Conus textile毒液腺制剂上进行的cDNA克隆和特征研究的结果与KK-0mRNA的序列接近。这些研究揭示出，尽管成熟KK-0和预测的成熟KK-1具有约26％一致性(参见表2)，但它们很可能从具有本质上高求平的同源性并且明显代表蛋白族成员的前-原-毒素加工而得到的。特别是与相应于成熟毒素的C-端区仅26％同源性水平(参见附图7)相比，KK-1 mRNA编码77个氨基酸的肽，KK-0(78个氨基酸)编码N端51个氨基酸的区域有高水平的序列同源性(88-92％)。在假定的信号序列区(约1-22残基，按照Von Heijne研究出的规则((1986)Nucleic Acids Research14 4683-4690))内，氨基酸100％相同。
在制订合成KK-1基因(sKK-1)的设计时、由于假设的前-原-KK-0和前-原-KK-1信号序列绝对相同，所以我们仅选择构建编码KK-1原毒素部分的合成DNA片段。
更具体地说，我们设计了编码位于PstI和XmaIII限制性位点侧翼区域的DNA片段，为便于这种基因的操作，所述位点已置入原始sKK-0基因(参见附图2)。
这些特征的设计是为了使：-
新合成KK-1(sKK-1)基因的数量降至最小，所述基因是我
们需要通过控制相同的，明显有效的现存KK-0构建体的信号序
列而装配的。附图8概括了研究出的用于sKK-1基因片段的基
本设计。
这种DNA片段的其它设计特征包括：-
*基于Wada等人((1992)Nucleic Acids Research 20
Supplement 2111-2118)出版的数据选择昆虫优选的/好的
密码子。
*掺入附加的侧翼EcoRI和BamHI限制性位点，以利于该片段的初
步克隆，特征描述和随后的操作。
在附图9中我们列出了新的合成sKK-1片段的序列[SEQ ID 23]，以及与相应的原KK-0序列[SEQ ID 25]相比，由主要的开放读框(原-KK-1)[SEQ ID 24]编码的氨基酸。
为了装配前面所讨论的示于附图8中的新的sKK-1原毒素基因，我们对以前成功地构建了sKK-0基因方法作了改进。
这样，如附图10所示、合成了两种合成寡核苷酸-SYNKK1A(111-mer)[SEQ ID 26]和SYNKK1B(106-mer)[SEQ ID 27]，所述寡核苷酸编码互补DNA链、并一起覆盖sKK-1的完整196nt，有21bp的重叠。此外，制备了另外两种寡核苷酸(KK1PCR1和KK1PCR2)[SEQ ID 28、29]、在SYNKK1A和SYNKK1B退火后它们能作为PCR引物，以扩增完整sKK-1片段，并用Taq DNA聚合酶填充修复。
按实施例3中描述的这些寡核苷酸合成，去保护等后，按类似于以前对sKK-0基因片段描述的方法使用这些寡核苷酸。
然而，由于在这种情况下sKK-1片段仅由两种(而不是四种)重叠寡核苷酸装配，因此，在用0.5μl或5μl修复反应产物的接种物进行到25循环扩增阶段之前仅进行了单个“5-循环PCR修复”反应。
如以前用sKK-0基因一样，按预期的准确进行这些反应和合适控制。当包括了所有必需的寡核苷酸时，产生基本量为约200bp的新DNA片段的基本量(几微克)。缺少单个寡核苷酸不产生这一片段。
在克隆新的sKK-1 DNA片段之前，将其用标准方法(Sambrooket al.(1989)“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”(Cold Spring Harbor Press))。进行苯酚抽提和乙醇沉淀处理。
这样制备的sKK-1基因片段会仅编码天然KK-1基因的成熟的和推定的原序列而不是信号肽。为证实其结构并获得进一步研究的材料，先用EcoRI和BamHI限制性酶消化(参见附图8和11)。然后，将其克隆到pMMS1B的EcoRI和BamHI位点，pMMS1B是携带可替换的多接头序列[SEQ ID 30]的pUC19的简单衍生物，所述序列使得调节和操作sKK-1片段特别方便(参见附图12)。将这一连接产物转化到感受态大肠杆菌DHsa细胞中，筛选出12个推定的重组体进一步研究。通过使用克隆酶以释放插入片段的限制性酶分析上述克隆。然后筛选出六个含有明显合适大小插入片段的克隆，基本上按实施例4中描述的使用所谓的多用途的和反向的M13序列引物进行序列分析，所述的引物识别位于这一pUC19衍生物多接头侧翼的区域。六种重组体之一(pMMS/KK-1#3.2)具有一个插入片段，它与预望的方法克隆的预期的sKK-1的插入片段精确配对。按如下步骤通过与sKK-0原肽编码序列融合，用该克隆最终装配完整sKK-1基因。
分离克隆pMMS/KK-1#3.2的PstI/BamHI片段并克隆到pVL1392/sKK-0#2.2载体，该载体已按照厂家推荐的方法(参见附图13)用PstI/BamHI消化过，以提供编码完整前-原-KK-1初级转录本的基因片段-包括在pVL1392转移载体中的sKK-0信号序列和sKK-1的原和成熟序列。然后，将该连接产物转化到感受态大肠杆菌DH5α细胞中，筛选出12个推定的重组体用于进一步分析。上述克隆通过使用克隆酶和EcoRI的限制性酶进行分析，其中的EcoRI应只切割pVL1392/sKK-0克隆而不是pVL1392/sKK-1重组体。基于这些分析，挑选出两个克隆用于序列分析。这些重组体中的一种(pVL1392/sKK-1#1)具有预期的序列，选来用于重组体AcMNPV组装。
实施例14生产携带多角体蛋白启动子/sKK-1基因表达单位的重组体(多角体蛋白-)AcMNPV
这里使用的方法与实施例4中描述的那些相同。
因此，使用实施例4中描述的方法，制备六种推定的AcMNPVpVL1392/sKK-1(分离物1到6)重组病毒。进行物理分析以确定哪一种病毒携带完整sKK-1基因。如前所描述的，用所有6种病毒完成生物试验。
结果是：
六种可能的pVL1392/sKK-1(1、5和6)分离株含有完整的sKK-1基因。
·当注射到烟芽夜蛾幼虫中时，这些病毒的杀虫活性均没有任何提高。
表1：w-芋螺毒素/“King-Kong”芋螺毒素家族中
生物活性肽之间的序列相以性Cono-KK-0 WCKQSGEMCNLLDQN--CCDG-YCIVLV-------CTCono-KK-1 CIEQFDPCEMIRHT--CCVGV-CFLMA-------CICono-KK-2 CAPFLHPCTFFFPN--CCN-SYCVQFI-------CLCono-GVIA CKSPGSSCSPTSYN--CCR-S-CNPYTK-----RCYCono-MVIIB CKGKGASCHRTSYD--CCTGS-CNRG-K------Cμ-Agatoxin 3 ADCVGDGQRCAD-WACPYCCSGYYCSCR--SMPYCRCRSDSCuttatoxin 2 ADCVGDGQKCAD-WFGPYCCSGYYCSCR--SMPYCRCRSDSButhus Pep 2 VGCEEDPMNCKGKQAKPTCCNGV-CN----------C-NVCTL ACAETGAVCVHNDE---CCSGA-CSPIF---NY--CLPQMj-AMP1 QCIGNGGRCNENVGPPYCCSGF-CL-RQPGQGYGYCKNR KK-0 KK-1 KK-2 GVIA MVIIB μ-Aga3 Curt 2 BuPep2 CTL MJ- AMPI KK-0 - 7/27 8/27 9/27 9/27 9/27 9/27 7/27 9/27 9/27 KK-1 7/26 - 7/26 6/26 7/26 7/26 7/26 9/26 8/26 8/26 KK-2 8/26 7/26 - 8/26 7/26 7/26 7/26 7/26 7/26 6/26 GVIA 9/27 6/27 8/27 - 15/27 8/27 8/27 7/27 8/27 7/27 MVIIB 9/25 7/25 7/25 15/25 - 9/25 9/25 8/25 9/25 10/25 μAgA3 9/38 7/38 7/38 8/38 9/38 - 36/38 10/38 9/38 14/36 Curt 2 9/38 7/38 7/38 8/38 9/38 36/38 - 9/38 11/38 14/38 BuPep2 7/28 9/28 7/28 7/28 8/28 10/28 9/28 - 8/28 9/28 CTL 9/30 8/30 7/30 8/30 9/30 9/30 11/30 8/30 - 11/30 Ml- AMP1 9/37 8/37 6/30 7/37 10/37 14/37 14/37 9/37 11/37 -
表2：w-芋螺毒素/“King-Kong”芋螺毒素家族中
生物活性肽之间的相似性百分比Cono-KK-0 WCKQSGEMCNLLDQN--CCDG-YCIVLV-------CTCono-KK-1 CIEQFDPCEMIRHT--CCVGV-CFLMA-------CICono-KK-2 CAPFLHPCTFFFPN--CCN-SYCVQFI-------CLCono-GVIA CKSPGSSCSPTSYN--CCR-S-CNPYTK-----RCYCono-MVIIB CKGKGASCHRTSYD--CCTGS-CNRG-K------Cμ-AGatoxin 3 ADCVGDGQRCAD-WAGPYCCSGYYCSCR--SMPYCRCRSDSCurtatoxin 2 ADCVGDGQKCAD-WFGPYCCSGYYCSCR--SMPYCRCRSDSButhus Pep 2 VGCEEDPMNCKGKQAKPTCCNGV-CN----------C-NVCTL ACAETGAVCVHNDE---CCSGA-CSPIF---NY--CLPQMj-AMP1 QGIGNGGRCNENVGPPYCCSGF-CL-RQPGQGYGYCKNR KK-0 KK-1 KK-2 GVIA HVIIB μ-Aga3 Curt2 BuPep2 CTL MJ- AMPI KK-0 - 26％ 30％ 33％ 33％ 33％ 33％ 26％ 33％ 33％ KK-1 27％ - 27％ 23％ 27％ 27％ 27％ 35％ 31％ 31％ KK-2 31％ 27％ - 31％ 27％ 27％ 27％ 27％ 27％ 23％ CVIA 33％ 22％ 30％ - 56％ 30％ 30％ 26％ 30％ 26％ HVIIB 36％ 28％ 28％ 60％ - 36％ 36％ 32％ 36％ 40％ μAgA3 24％ 18％ 18％ 21％ 24％ - 95％ 26％ 24％ 37％ Curt2 24％ 18％ 18％ 21％ 24％ 95％ - 24％ 29％ 37％ BuPep2 25％ 32％ 25％ 25％ 29％ 36％ 32％ - 29％ 32％ CTL 30％ 27％ 23％ 27％ 30％ 30％ 37％ 27％ - 37％ Mj- AMP1 24％ 22％ 16％ 19％ 27％ 36％ 38％ 24％ 30％ -
表III：KK-0、KK-1和KK-2蛋白质合成制剂注射到烟芽夜蛾幼虫1
中的生物活性的初步估价处理每只昆虫的剂量 作 用KK-0 1μl注射后30秒内丧失协调性。注射后2-4分钟内所有昆虫表现出软弱麻痹、不能站立、不能翻身、不能对刺激作出反应、柔软易曲。4到6分钟后作用开始减弱，在注射后10分钟所有昆虫表现正常。在处理后24小时时，所有幼虫存活并完好。 2μl症状同上但更严重和持久。在注射后45分钟，所有幼虫逐渐恢复表现正常。在处理后24小时，所有幼虫存活并完好。KK-1 1μl首先观察注射后30秒内的症状。在2-4分钟内，大多数幼虫表现出软弱麻痹：症状同用KK-0。作用时间缩短，所有幼虫在注射后6-10分钟表现正常。在处理后24小时，所有幼虫存活并正常。KK-2 1μl即使在处理后24小时观察不到不良作用。对照2 -实验中观察不到不良作用
1 每个处理六只注射过的幼虫：平均体重：30mg。
2 对照：2μl 0.1M碳酸氢铵。
表IV KK-0、KK-1和KK-2蛋白质合成制剂注射到美洲蠊1中
的生物活性初步估价处理每只昆虫的剂量 作 用KK-0 1μl注射后1分钟内观察到后腿暂时麻痹，到16分钟时作用消失。能够对刺激作出正常的反应，但注射后20分钟到3小时局部移动缓慢且协调性差。到21HAT时麻痹，到22HAT时死亡。 5μl在注射后30秒钟内后腿麻痹接着颤抖，在注射后20分钟，中部和后腿麻痹倒下，但前腿活动正常，在1HAT内完全麻痹，不能恢复-21HAT时麻痹，22HAT时死亡。 10μl颤抖和开始在后腿丧失协调性，但迅速扩展到中部和前腿，接着全身麻痹。不能恢复-在22HAT时麻痹/死亡。KK-1 1μl注射后15秒钟内颤抖，接着后腿丧失运动能力，在注射后5分钟时前腿仍然积极运动。在注射后20分钟时，麻痹，其它症状包括背部弯曲。在15-3HAT之间某些恢复。在21HAT时，昆虫倒下并不能复位。到52HAT时不能恢复。 5μl注射后后腿立刻丧失协调性和麻痹，迅速扩展到中部和前腿，在注射后5分钟内完全麻痹。不能恢复并在21HAT时死亡。处理每只昆虫的剂量 作 用 10μl注射后30秒钟内迅速丧失协调性，接着完全麻痹，此后观察到偶尔颤抖，但昆虫始终倒下，在21HAT时不能恢复且全部死亡。KK-2 1μl实验过程中观察不到异常作用 2μl异常症状包括在注射后1分钟内背部弯曲，有协调性差的局部运动。从注射后的20分钟观察到某些恢复。但昆虫在69HAT时死亡。 5μl注射后立刻暂时丧失协调性；其它症状包括背部弯曲。在1.5HAT，昆虫表现出恢复，但在45HAT时死亡。对照2 -实验过程中观察不到异常作用
1平均体重为840mg的成年雄性蟑螂。
2对照：10μl 0.1M碳酸氢铵溶液。
表V AcMNPV/pVL1392/sKK-0 CONO C注射到烟芽夜蛾幼虫6
中的生物效力估价处理1 死 亡 数 量(+感染的) 24小时 48小时 72小时 96小时 120小时 144小时AcMNPV/pVL 1392/lacZ1 0/10 0/10 0/10 0/10 1/10 6/10AcMNPV/pVL 1392/sKK-O Cono C1 0/11 0/11 0/11 (+3FP3， 1PP4) 3/11 (+1FP，3PP， 4AF5) 5/11 (+5FP，1PP) 11/11 对照2 0/7 0/7 0/7 0/7 0/7 1/7
1.剂量比率＝每只幼虫1.5×104pfu。
2.对照＝无菌水
3.FP-完全软弱麻痹：昆虫麻痹、不能站立、行走或翻身，对刺激的反应仅只能作咀部和尾部的有限的微弱的运动。柔软易曲。
4.PP-部分麻痹：身体的中间/后部部分麻痹：幼虫仍然能够作某些局部活动，能翻身但运动协调性差。
5，AF-感染的：幼虫对刺激的反应缓慢，但不能/不愿行正或取食。
6.第四龄幼虫：平均体重＝100mg。
表VI：AcMNPV野生型病毒和AcUW1-PH/pVL 1392/sKK-0#2
注射到烟芽夜蛾幼虫6中的生物效力估价处理1 昆虫死亡数量(+感染的) 1 2 3 4 5 6 7 AcMNPV wt 0/6 0/6 0/6 0/6 3/6 6/6 6/6 AcUW1-PH/pVL 1392/KK0-2 0/6 0/6 0/6 (+1PP4，1AF5) 5/6 (+1FP3) 6/6 6/6 6/6 AcUW1-PH/pVL 1392/lac Z 0/7 0/7 0/7 0/7 0/7 3/7 7/7 对照2 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5
1.剂量＝每只幼虫约1×104pfu。
2.对照：无菌水
3.FP-软弱麻痹：麻痹，不能站立、翻身、行走或对刺激作通常的反应：对刺激的反应仅仅是咀部/尾部非常微弱的运动表明存活着。
4.PP-部分麻痹：不能翻身或行走：身体中部和后部完全固定，但身体前部仍能运动，前和假腿在受到刺激时能收回
5.AF-感染的：昆虫能站立、翻身，对刺激作通常的反应，但不能协调地作局部运动。
6.第五龄幼虫，平均体重＝300mg。
表VII：AcUW1-PH/pVL 1392/sKK-0#2和AcMNPV野生型病毒经口
服给药抗烟芽夜蛾幼虫的生物效力的估价 处理 剂量 (PIBs/mi) ％杀灭(+％+感染的2) 72hr 96hr 120hr 144hr 168hr AcMNPV WT 1.0×107 3 33 67 70 70 3.3×106 0 7 17 20 20 1.1×106 0 13 20 20 20 3.7×105 0 0 7 10 10 1.2×105 0 0 3 3 3 4.1×104 0 0 4 4 4 AcUW1-PH pVL1392 sKK-0#2 1.0×107 7 37(+30) 67 73 73 3.3×106 3 17(+10) 31 31 34 1.1×106 4(4) 18(+7) 32 32 32 3.7×105 3 10(+3) 14 14 14 1.2×105 7(+3) 10 13(+3) 17(3) 20 4.1×104 3 3 3 3 3 对照 - 0 0 0 0 0处理后时间(小时) AcMNPV野生型 LC503 95％C.I. AcUW1-PH/pVL1392/sKK-0#2 LC50 95％C.I. 96 - -6.1×106 3.3×106-1.7×107 120 7.6×106 4.4×106-1.9×1075.2×106 2.7×106-1.6×107 144 6.6×106 3.9×106-1.5×1074.3×106 2.3×105-1.2×107 168 6.5×106 3.9×106-1.5×1064.0×106 2.2×106-1.0×107
1.用逐滴加入试验法(Hughes & Wood，1981)的修改方法给药的新生幼虫：30幼虫/剂
2.()％麻痹幼虫
3.使用标准对照值剂量反应方法(Ashton，1972)估价的LC30值(PIBs/ml病毒悬液)
序列表(1)一般资料：
(i)申请人：ZENECA LIMITED
(ii)发明名称：生物防治剂
(iii)序列数：37
(iv)相应地址：
(A)联系人：ICI GROUP PATENTS SERV1CES DEPARTMENT
(B)街道：PO BOX 6，SHIRE PARK，BESSAMER ROAD
(C)城市：WELWYN GARDEN CITY
(D)州：HERTFORDSH1RE
(E)国家：UNITED KINGDOM
(F)邮编：AL7 1HD
(v)计算机可读形式：
(A)介质类型：Floppy disk
(B)计算机：IBM PC兼容的
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.25
(vi)当前申请资料：
(A)申请号：
(B)申请日：
(C)分类号：
(vii)在先申请资料：
(A)申请号：GB 9306295.8
(B)申请日：1993年3月22日
(viii)律师/代理机构资料：
(A)姓名：BISHOP，NIGEL D
(B)登记号：GEN AUTHN 31434
(C)参考/提要号：PPD37491
(ix)通讯信息：
(A)电话：(+44)0707 323400
(B)传真：(+44)0707 337454
(C)电传：94028500 ICIC G(2)SEQ ID NO：1的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：269个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
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(ii)分子类型：cDNA
(iv)反义：无
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(A)长度：78个氨基酸
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20 25 30Phe Ser Asn Ala His His Glu Met Lys Asn Pro Glu Ala Ser Lys Leu
35 40 45Asn Lys Arg Trp Cys Lys Gln Ser Gly Glu Met Cys Asn Leu Leu Asp
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(A)长度：89个碱基对
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(i)序列特征：
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(i)序列特征：
(A)长度：78个氨基酸
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50 55(2)SEQ ID NO：26的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：111碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：26：TGGAATTCTG CAGACGACAG CTCCAACGGC CTGGAGAACC TGTTCTCCAA GGCCCACCAC 60GAGATGAAGA ACCCCGAGGC CTCCAAGCTT AACAAGCGTT GCATCGAGCA G 111(2)SEQ ID NO：27的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：106碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：27：AAGGATCCGG CCGTCACTAG ATGCAGGCCA TCAGGAAGCA GACGCCGACG CAGCAGGTGC 60GAGGGATCAT GTCGCAGGGG TCGAAGTGCT CGATGCAACG CTTGTT 106(2)SEQ ID NO：28的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：27个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：28：TGGAATTCTG CAGACGACAG CTCCAAC 27(2)SEQ ID NO：29的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：26个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：29：AAGGATCCGG CCGTCACTAG ATGCAG 26(2：)SEQ ID NO：30的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：45个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：30：AATTGCGGCC GGATCCAAGC TTGAGCTCGA ATTCCTGCAG ATCTG 45(2)SEQ ID NO：31的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：27个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：31：
Cys Lys Ser Pro Gly Ser Ser Cys Ser Pro Thr Ser Tyr Asn Cys Cys
1 5 10 15
Arg Ser Cys Asn Pro Tyr Thr Lys Arg Cys Tyr
20 25(2)SEQ ID NO：32的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：25个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：32：Cys Lys Gly Lys Gly Ala Ser Cys His Arg Thr Ser Tyr Asp Cys Cys1 5 10 15Thr Gly Ser Cys Asn Arg Gly Lys Cys
20 25(2)SEQ ID NO：33的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：38个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：33：Ala Asp Cys Val Gly Asp Gly Gln Arg Cys Ala Asp Trp Ala Gly Pro1 5 10 15Tyr Cys Cys Ser Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys Arg Ser Met Pro Tyr Cys
20 25 30Arg Cys Arg Ser Asp Ser
35(2)SEQ ID NO：34的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：38个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：34：
Ala Asp Cys Val Gly Asp Gly Gln Lys Cys Ala Asp Trp Phe Gly Pro
1 5 10 15
Tyr Cys Cys Ser Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys Arg Ser Met Pro Tyr Cys
20 25 30
Arg Cys Arg Ser Asp Ser
35(2)SEQ ID NO：35的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：28个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：35：Val Gly Cys Glu Glu Asp Pro Met Asn Cys Lys Gly Lys Gln Ala Lys 1 5 10 15Pro Thr Cys Cys Asn Gly Val Cys Asn Cys Asn Val
20 25(2)SEQ ID NO：36的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：30个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：36：Ala Cys Ala Glu Thr Gly Ala Val Cys Val His Asn Asp Glu Cys Cys1 5 10 15Ser Gly Ala Cys Ser Pro Ile Phe Asn Tyr Cys Leu Pro Gln
20 25 30(2)SEQ ID NO：37的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：37个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：37：Gln Cys Ile Gly Asn Gly Gly Arg Cys Asn Glu Asn Val Gly Pro Pro1 5 10 15Tyr Cys Cys Ser Gly Phe Cys Leu Arg Gln Pro Gly Gln Gly Tyr Gly
20 25 30Tyr Cys Lys Asn Arg
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