携有抗—CD4单克隆抗体的免疫微粒及其预防和/ 或治疗因HIV病毒感染所引起的病原状态 或者作为生物制剂的用途 本发明涉及含有被抗—CD4抗体包被的聚合亚甲基丙二酸盐微粒的免疫颗粒，还涉及它们预防和/或治疗因HIV病毒感染所引起的病原状态或者作为生物制剂的用途。
大量研究报道了CD4抗原在人类免疫缺损病毒(HIV病毒)感染淋巴细胞时的重要性，并提出了它作为HIV病毒的细胞受体的作用(D.Klatzmann et al.，Natwre，1984.312.767—768)。
F.Rey等人报道了抗—CD4单克隆抗体抑制合胞体形成(通过健康T淋巴细胞与受感染的T淋巴细胞连接所形成的大细胞)的能力(F.Rey et al.，Virology，1991，181，165—171.)
C.Kubiak等人(Int.J.Pharmaceutics，1988，41，181—187)和I.Illum等人(J.Pharmacol.EXP.Therapeutics，1984，230，733—736)描述了微粒/单克隆抗体结合物，其中微粒含有己基晴基丙烯酸酯聚合物，单克隆抗体一方面是抗—α—胎儿球蛋白抗体(用于α—胎儿球蛋白的检测)，或者是抗一肉瘤抗体(用于抗肿瘤)。然而这些基于腈基丙烯酸聚合物的结合物对T4淋巴细胞显示出毒性。
N.Phillips等人(Cancer Detect.Prev.1990，14.383—390)描述了包被有抗—CD4 LEU3—A抗体的脂传体。然而，这些脂质体显示出可引起小鼠中抗—脂质体抗体出现的缺点(N.Philipks.second Eu-ropean Symposium on Controlled Drng Delivery.1992.Noorduijk aanZee.Holland，Abstract bood pp172—175)。
已发现携有抗—CD4单克隆抗体地免疫微粒可用于预防和/或治疗因HIV病毒感染引起的病原状态，尤其是AIDS。
这些免疫微粒具有使所说抗体获得更好的稳定性、更大的活性和更好的免疫反应性的优点。它们也可以完全地被生物隆解，而且毒性很低，它们解释产物的本身也没有毒，而且它们有利于灭菌和冷冻干燥。
因此本发明涉及含有式(I)亚甲基丙二酸盐聚合物微粒的免疫微粒
其中R1和R2可以相同或者不同，是直链或支链C1—C5—烷基基团，n是1至5的整数，所说微粒被抗—CD4抗体包被。
欧洲专利0283364中描述了式(I)化合物的制备。
式(I)化合物以聚合网状物的形式聚合化可得到直径为100和400nm之间的微粒，优选大约为300nm。式(I)亚甲基丙二酸盐聚合物的平均分子量(mw)大约为600，以聚苯乙烯的当量表示。
优选地，式(I)亚甲基丙二酸盐化合物是1—乙氧羰基—1—乙氧羰基亚甲氧基羰基乙烯(式(I)化合物中R1＝R2＝乙基和n＝1)。
根据本发明的免疫微粒利于在它们的聚合网状物中含有生物活性物质，优选含有抗病毒剂。可提及但不暗示限制的抗病毒剂的例子是didanosin、ribavirin、zidovudin、aciclovir、vidarabirne、和zal-citabine。
根据有利的特征，包被微粒形成免疫微粒的抗—CD4单克隆抗体选自衍生于13B8—2杂交瘤的OKT4和OKT4—A抗体以及LOT4a抗体，优选为IOT4a抗体。单克隆抗体可以如商用提供的那样，特别地以含有牛血清白蛋白的溶液形式使用。
可以使用经荧光物质如异硫氰酸荧光素标记的抗—CD4单克隆抗体，或优选使用未经标记的抗—CD4抗体。
可通过先前已知的技术将抗—CD4单克隆抗体与微粒结合以形成免疫微粒，优选通过被动吸附，尤其是在膦酸盐缓冲液中。
所说抗体也可通过特异性吸附，尤其是通过金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aurus)蛋白质A或生物素/抗生物素蛋白键与微粒结合。
L.Illun等人(Meth Enzymol.1985.112.67—84)的文献中特别描述了抗体结合的不同方法。
根据另一个特征，本发明涉及使用根据本发明的免疫微粒以预防和/或治疗因HIV病毒感染所引起的病原状态，尤其是用以制备预防和/或治疗因HIV病毒感染所引起病原状态的药物。
实际上，上述免疫微粒具有抑制F.Rey等人的实验模型合胞体形成的特性(Virology，1991，181.165—171)
根据另一个特征，本发明进一步涉及测定来自人或哺乳动物体液样品中CD4抗原存在与否的方法，它包括将此体液样品与上述含有式(I)亚甲基丙二酸盐聚合物微粒的免疫微粒接触：
其中R1和R2可以相同或不同，是直链或支链C1—C5—烷基基团，n是1至5的整数，所说微粒被抗—CD4抗体包被，它的量应充足以形成可被测出的抗原一抗体复合物。
根据另一个特征，本发明进一步涉及使用上述被抗—CD4抗体包被的免疫微粒作为生物试剂，尤其是作为对照以评价化合物在抑制含胞体形成的模型中的活性，或者在免疫分离，免疫沉淀、免疫标记或免疫纯化技术中的活性。
本发明将通过下述实施例被阐明，实施例不会以任何方式暗示对本发明的限制。
实施例1：制备被抗—CD4 IOT4a抗体包被的1—乙氧羰基—1—乙氧羰基亚甲氧基羰基乙烯免疫微粒。
微粒的制备：
按F.Lescure等人的描述在25℃、无菌条件下通过单体的乳浊液聚合化制备微粒(Proceed.Intern.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.，1991.18.325—326.Controlled Releare Society Inc.)
简单地说，在10-2托的真空下，在3小时内从100ul1—乙氧羰基—1—亚甲氧基羰基乙烯单体(UPSA实验室/CARBIPEM，法国)中除去SO2，然后将此单体搅拌滴至聚合化介质(10ml)中，温度被调节至25℃，此介质包含含有1％葡聚糖(Mr＝70,000，FLUKACHEMIE Swizerland)、PH为5.5的0.066M KH2PO4/NaH2PO4缓冲液。
将整个混合物搅拌18小时，然后用8um滤低(Whatman GreatBritain)过滤回收微粒，再分成等份试样，冷冻干燥并在室温下贮存。
使用时将微粒重新悬浮于水中以制成可注射的制品。
在分析亚微粒颗粒装置(Coulter Electronis′USA)的辅助下测量冷冻干燥前后微粒的平均大小，颗粒的平均直径大约为320nm。
用空间排阻层析法(SEC)(Polymer Laboratories Great Britain)测定所形成的微粒原合物的分子量。为了分析，将微粒悬浮液在200,00g下超速离以为5分钟，将残留物溶于THF中，加入0.5％甲苯后注射，通过折射测定法达到测量的目的。
2)抗体与微粒的结合：
将微粒置于PH7.4的磷酸盐缓冲液中稀释至2.7mg/ml。
在450ul微粒悬浮液中加入100ul经过或未经异硫氰酸荧素标记的TOT4a单克隆抗体(13B8—2克隆，含有0.2％牛血清白蛋白的100ug/ml溶液，IMMUNOTECH.France)。混合物在20℃下搅拌温育2小时。
实施例2：实施例1免疫微粒的稳定性研究
在不含酚红、含有1％各氨酰胺、1％清霉素、1％链霉素、1％新霉素和10％小牛血清的RPMI1640培养基(GIBCO USA)中加入聚合物浓度为50ug/ml的免疫微粒。
立即和在37℃下开始温育后2小时，通过在40,000g下超速离心5分钟可从游离抗体中分离出包被了抗体的微粒。
按欧洲专利0007895和美国专利4,329,332的描述还可制备异己基腈基丙烯酸酯微粒作为对照。在这种情况下，通过在80,000g下超速离心5分钟可从游离抗体中分离出包被了抗体的微粒。
在L530分光荧光计(Perkin Elmer Ltd.Great Britain)的辅助下，通过测量上清液的荧光(入刺激＝485nm、入放射＝535nm)可测定所结合的IOT4a抗体的量。
参照标准曲线计算出游离抗体的浓度，通过差异推断出所结合的抗体的百分数。
结果示于下列表1和2：
——表1所示为实施例1免疫微粒所得结果；和
——表2表示，作为比较实例，包被了与实施例1免疫微粒中相同抗体的PIHCA微粒所得的结果。
表1 抗体浓度 (μg/ml) 结合百分数 起始 温育2小时后 0.1 0.05 0.025 24±1.52 49±0 63±4.9 23±1 48±1.15 61±9.16
表2(比较实例) 抗体浓度 (μg/ml) 结合百分数 起始 温育2小进后 0.4 0.2 0.1 31±0.64 56±1.9 85±0 0.76±0.55 6.7±1.2 30±3.6
结果表明根据本发明的免疫微粒所结合的抗体百分数在2小时后变化不显著，而在PIHCA微粒的情况下有显著降低。
实施例3：制备包被了抗—CD4 OKT4—A抗体的1—乙氧羰基亚甲氧基羰基乙烯免疫微粒及其稳定性的研究。
将根据实施例1步骤1)制备的微粒置于PH为7.4的磷酸盐缓冲液中稀释至2.7mg/ml，在450ul微粒悬浮液中加入100ul经异硫氰酸荧光素标记的OKT4—A单克隆抗体(含有0.1％牛血清白蛋白的50ug/ml溶，ORTHO DIAGNOSTIC SYSTEMS，USA)。在20℃下将混合物搅拌温育2小时。
在实施例2的实验条件下检测这些免疫微粒的稳定性。
所得结果示于下列表3：
表3 抗体浓度 (μg/ml) 结合百分数 起始 温育2小时后 0.1 0.05 0.025 25±5 44±3 43±6 14±2 30±0 30±0
实施例4：制备包被了抗—CD4 OKT4抗体的1—乙氧羰基亚甲氧基羰基乙烯免疫微粒及其稳定性的研究。
根据实施例3所述方法，使用100ul标记了异硫氰酸荧光素的OKT4单克隆抗体(ORTHO DIAGNOSTIC SYSTEM.YSA)制备免疫微粒。
在实施例2的实验条件下检测这些免疫微粒的稳定性。
所得结果示于下列表4：
表4 抗体浓度 (μg/ml) 结合百分数 起始 温育2小时后 0.1 0.05 0.025 21±0 21±5 0 16±2 21±5 0
结果表明温育2小时后所结合抗体的百分数没有明显变化。
实施例5：实施例1免疫微粒对体外模型合胞体形成抑制活性的研究。
1)培养淋巴细胞并用HIV—1病毒感染：
根据F.Rey等人(Virology，1991.181.165—171)所述的方法进行细胞培养和用HIV—1病毒感染，使用CEM和MT4细胞系。使用含有2.106细胞/ml的细胞悬浮液，在等量的病毒贮存稀释液辅助下在37℃下温育1小时进行HIV—1 BRU病毒的感染(F.Barre—Sinoussi et al.，Science，1983，220，868—871)。感染后，用PBS离心4次洗涤细胞以除去未结合的病毒颗粒。
将浓度为5×105细胞/ml的细胞接种于含有酚红，并经10％小牛血清，1％抗生素和1％谷氨酰胺加富的RPMI 1640培养基(GIB-CO，USA)中。每隔3或4天，将细胞经3倍(MT4细胞)或4倍(CEM细胞)稀释并重新接种于新的培养基中，用逆转录酶检测阐明淋巴细胞的感染。
2)合胞体形成的抑制：
如以上提及的F.Rey等人文献中所示，通常在温育1或2天之后，并在1倍体积的慢性感染CEM细胞与2倍体积的2·105细胞/ml的MT4细胞混合后可观察到合胞体。
通过将MT4细胞与不同制品温育2小时然后加入经感染的CEM细胞可评价抗—CD4单克隆抗体和携有抗—CD4抗体的免疫微粒抑制合胞体形成的能力。
在37℃下温育2天后在显微镜下评价合胞体的形成，并以十号表示。
结果示于下列表5、6和7：
——表5所示为根据本发明，携有IOT4a抗体的免疫微粒所得结果；
——表6表示，作为比较实例，包被了IOT4a抗体的PIHCA微粒所得结果；和
——表7表示，作为比较实例，使用未结合的IOT4a抗体所得结果。
表5
根据本发明的免疫微粒对合胞体形成的抑制 聚合物 (μg/ml) 总的抗体 (μg/ml) 结合抗体 (μg/ml)合胞体的形式 25 25 25 25 25 0 0.05 0.025 0.012 0.006 0 0 0.012 0.012 0.0069 0.004 0 0 - -/+ + + + +
表6
携有IOT4a抗体的PIHCA微粒对合肥体形成的抑制
(比较实施例)聚合物(μg/ml) 总的抗体 (μg/ml) 结合抗体 (μg/ml)合胞体的形式 5 5 5 5 0.045 0.02 0.01 0.005 0.012 0.011 0.008 0.005 + + + ++：存在合胞体-：不存在合胞体
表7
未结合IOT4a抗体对合胞体形成的抑制(比较实施例) 浓度(μg/ml) 合胞体的形式 10 5 1 0.5 0.1 - - + + +
结果表明使用根据本发明的免疫微粒，可抑制抗体浓度比游离抗体浓度低100倍时合胞体的形成。对合胞体形成的完全抑制实际上得自0.05ug/ml抗体，后者是以根据本发明的免疫微粒的形式，而游离抗体的浓度必需为5ug/ml才能得到相同结果。另外，。当使用含有聚合物的微粒而不是根据本发明的免疫微粒时没有发现这些有利的结果。
实施例6：实施例3的免疫微粒对体外模型合胞体形成抑制活性的研究。
根据实施例5的方法检测包被有抗—CD4 OKT4—A单克隆抗体的实施例3免疫微粒。
结果示于下列表8：
表8 聚合物 (μg/ml) 总的抗体 (μg/ml) 结合抗体 (μg/ml)合胞体的形式 80 80 80 0.5 0.2 0.11 0.044 0.044 0.048 - -/+ +
实施例7：实施例1免疫微粒对使用病毒株PAS 246的体外模型合胞体形成抑制活性的研究。
根据实施例5的实验方法检测包了抗—CD4 IOT4a单克隆抗体的实施例1免疫微粒，病毒HIV—1 BRU被病毒株PAS 246替代(F.Rey et a1.1991.181.165—171)。
结果示于下列表9：
表9 聚合物 (μg/ml) 总的抗体 (μg/ml) 结合抗体 (μg/ml)合胞体的形成 25 25 25 0.025 0.05 0.1 0.012 0.012 0.012 -/+ - -
结果表明在抗体浓度为0.025ug/ml时，开始对合胞体的形成有所抑制，此抑制在抗体浓度为0.05ug/ml时完全的。