香蕉束顶病毒的基因间区 本发明涉及香蕉束顶病毒(BBTV)的DNA序列，特别是元件1到6的基因间区。
香蕉束顶病(BBTD)是香蕉最重要的病毒病(Dale，1987，《病毒研究进展》(Advances in Virus Research)33301-325)。这种病流行于亚洲和南太平洋并在澳大利亚和非洲具有有限的分布。还未有来自美洲的报道。最初推测该病是由一种黄矮病毒导致的，因为它是由蚜虫持续传播的而不是机械传播的，诱导黄化病症状并感染具有受损的韧皮部的植物。然而，最近已经从感染的植物中纯化了18-20nm同组异序的病毒样颗粒(VLPs)并已被证明与该病相关(Harding等，1991，《普通病毒学杂志》(Journal of General Virology)72225-230；Thomas和Dietzgen，1991，《普通病毒学杂志》72217-224；Wu和Su，1990，《植物病理学杂志》(Journal ofPhytopathology)128 153-160)。Harding等(Harding等，1991，《普通病毒学杂志》72 225-230；Harding等，1993，《普通病毒学杂志》74 323-328)已经从这些VLPs分离了大约1kb的环状、单链DNA并克隆和测定了一个ssDNA元件的序列。这个已知为BBTV DNA元件1的元件在病毒颗粒的意义上具有一个大的开放读框(ORF)并编码一个推定的复制酶。这个元件通过蚜虫与疾病一同传播。
在Burns等，1994，《病毒学文献》(Arch Virol.)137 371-380中，他们报道了BBTV另一个元件的克隆和测序。他们发现一个93个核苷酸的序列在BBTV两个ssDNA基因组元件之间强烈保守。由这段序列设计两个向外延伸地简并引物并与从纯化的BBTV病毒颗粒提取的DNA用在一聚合酶链反应(PCR)中。将PCR扩增出的由至少7条大约均为1kb的不同的片段组成的并且可能代表全长BBTV dsDNA的产物分离。将PCR扩增产物克隆并通过限制性酶切分析筛选克隆。鉴定出了4个不同的限制性分析组。这篇参考文献推断BBTV的基因组含有至少5个元件而且BBTV属于一个以前未描述的可能还含有地下三叶草矮小病毒的植物病毒组。
在Karan等，1994，《普通病毒学杂志》75 3541-3546中，提到来自10个不同国家分离株并被克隆和测序的BBTV元件1，随后将这些序列排列并此较。这个分析指出两个组：南太平洋组(来自澳大利亚、布隆迪、埃及、斐济、印度、汤加、西萨摩亚群岛的分离株)和亚洲组(来自菲律宾、台湾和越南的分离株)。在每组内的平均序列差异为1.9到3.0％而在来自两组的分离株之间则为大约10％，但序列的一些部分比其它部分的差异更多。然而，由主要开放读框编码的蛋白质差别大约为5％。由茎-环序列的起点到潜在的TATA盒之间的区域在所有的分离株中除了在西萨摩亚群岛分离株中的一个两个核苷酸的改变和在NSW分离株中的一个单核苷酸的改变外是相同的。这些结果同其它证据一起表明在香蕉由亚太地区到非洲和美洲的最初的迁移后BBTV已经波及香蕉。
在Xie等，1995，《植物病理学》85 339-347中，从被感染的Williams香蕉品种纯化了BBTV的夏威夷分离株。克隆并测序了3个单链DNA(ssDNA)元件：它们分别被命名为元件1、3和4。元件1在长度上为1110个核苷酸并与如上述在Harding等(1993)中所描述的澳大利亚分离株的BBTV DNA元件1具有98％的核酸序列一致性。这个元件含有能够编码一个可能以一种复制酶来发挥功能的33.5kDa蛋白和一个具有未知功能的大约15.2kDa蛋白的两个开放读框(ORF)。元件3在长度上为1057个核苷酸并且不含任何大于10kDa的ORF。元件4在长度上为1017个核苷酸并且潜在地编码一个18.9kDa的蛋白。这3个ssDNA元件都具有一个相同的茎-环序列并具有一个保守的非编码区。这3个元件的每一个的序列与两个台湾分离株的BBTV DNA元件不同。为了利用放射性和非放射性探针检测在植物中的BBTV将BBTV特异性克隆用于斑点印迹杂交检测。对于在香蕉样品和单个蚜虫中BBTV的检测发展了一种聚合酶链反应(PCR)检测法。斑点印迹杂交检测法与酶联免疫吸附测定(ELISA)同样敏感而对于在香蕉中BBTV的检测PCR比斑点印迹和ELISA检测法敏感1000倍。
虽然在上述的Harding等，1993以及Xie和Hu，1995中已经检测到基因组元件1、3和4的所谓的基因间区。这些基因间区的唯一特征是如在上述的Harding等所公布的在元件1中的一个茎-环结构。
在一个较早的申请中(即国际申请PCT/AU95/00311)提到其本身要求的BBTV元件3、4和6。在这篇较早的申请中还公布了在ORF区外的区域(即所谓的“基因间区”)。在上述Xie和Hu，1995中 公布的基因组元件1、3和4与在较早的申请PCT/AU95/00311中所提及的元件1、2和5相应。
令人惊奇的是，目前已经发现BBTV基因组元件1-6的基因间区或其部分具有能够促进、增强、调节或改善非BBTV基因转录的序列。
因而本发明包括用于促进、增强、调节或改善一非BBTV基因转录的前面提到的基因间区、或其部分、衍生自其中的序列和其突变体本身。
本发明在其范围内还包括一种作为BBTV元件基因间区部分片段的DNA分子或者说该DNA分子衍生自所说的基因间区，其中该DNA分子能够促进、增强、调节或改善非BBTV基因转录。
在本说明中将部分片段定义为比BBTV元件的基因间区的全序列小但等于或大于一个来自BBTV元件的大约172个碱基对的序列的序列。所说的DNA分子的序列可能与BBTV元件基因间区的部分片段的互补序列相同。
在本说明中基因间区被用于定义一BBTV元件的非编码区或在一BBTV元件中ORF外的区域。
DNA分子的序列可以同BBTV元件1-6的基因间区的部分片段基本相同或互补。在本说明中“基本”被用来指具有高达20％变异度的序列。通过标准的杂交方法或序列比较能够确定序列变异度的量。20％的百分比为在不同地区的分离株之间元件1的ORF外区域所表现的变异度(Karan等，1994，《普通病毒学杂志》，75，3541-3546；和美国专利申请08/202186号)。此中这两篇文献都并入本文作为参考来支持BBTV所有元件的20％变异度的权利要求。对于不同地区分离株的元件1确定的变异度为来自不同地区分离株的每个元件之间的变异度的代表。因而，高达20％的变异度也用于下面讨论的元件2到6的序列。
术语“衍生的”定义为已通过包括突变的任何方法由一BBTV元件基因间区的一个片段改变、替换或修饰的任何序列。
尤其是，该DNA分子的序列可以是BBTV基因间区元件6衍生的pBT6.1插入片段(大约623个碱基对的片段)、pBT6.2插入片段(大约351个碱基对的片段)、pBT6.3插入片段(大约239个碱基对的片段)和pBT6.4插入片段(大约172个碱基对的片段)；元件1衍生的pBT1.1插入片段(大约214个碱基对的片段)、pBT1.INT插入片段(大约980个碱基对的片段)；元件2衍生的pBT2.1插入片段(大约855个碱基对的片段)；元件3衍生的pBT3.1插入片段(大约526个碱基对的片段)；元件4衍生的pBT4.1插入片段(大约659个碱基对的片段)；以及元件5衍生的pBT5.1插入片段(大约454个碱基对的片段)。该DNA分子可以是包括在pBT6.1插入片段中存在而在pBT6.2插入片段中不存在的CR-M的275个碱基对的区域。该275个碱基对的区域可能是一个调节区。该DNA分子可以包含在CRSL区和BBTV元件1到6中任何一个的开放读框的ATG之间的或包括它们的区域。pBT1.1、pBT2.1、pBT3.1、pBT4.1、pBT5.1和pBT6.1插入片段示于图11中。图12展示pBT1.INT插入片段的序列。图13展示(a)pBT6.1(b)pBT6.2(c)pBT6.3和(d)pBT6.4插入片段的DNA序列。
非BBTV基因可以是如GUS、NPTII、杀虫剂抗性基因、除草剂抗性基因或一生长促进基因的任何适宜的基因。
该DNA分子可以在任何合适的原核或真核宿主中转录基因。优选该DNA分子可以在一如来自Musa spp(香蕉)、小麦细胞类植物细胞的单子叶植物细胞中转录基因。该DNA分子可以在一如香蕉和小麦的单子叶植物中转录基因。优选该DNA分子可以在一如来自烟草和密生西葫芦细胞的双子叶植物细胞中转录基因。该DNA分子可以在一如烟草和密生西葫芦的双子叶植物中转录基因。该DNA分子优选在一双子叶植物的未分化组织的细胞中转录基因。
在另一方面，本发明为一种在一个目的基因的上游具有一如上所述的DNA分子以能够促进、增强、调节或改善该基因转录的嵌合载体或盒。
嵌合载体可以衍生自pBI101.3。该载体可以为下面提到的任何合适的构建物。盒可以为下面提到的任何合适的构建物。目的基因可以为上面提到的任何合适的基因。对于在宿主中的表达可以将嵌合载体或盒引入任何合适的包括单子叶植物细胞和双子叶植物细胞的宿主中。
在第三方面本发明为一种具有如上所述的DNA分子的植物细胞。
在第四方面本发明为带有如上所述的植物细胞的植物。
在第五方面本发明提供了一种利用如上所述的DNA分子在一植物细胞中表达一非BBTV基因的方法。
现在将参照优选的实施方案描述本发明。然而，这些优选的实施方案仅为举例说明。实施例1描述BBTV的另外三个元件的发现和鉴定并为了便于允许本领域的技术人员分离这些BBTV元件将其引入本说明书中。这些信息基本上已经发表在Burns等，1995，《普通病毒学杂志》，76，1471-1482中。实施例1：BBTV元件方法
cDNA的合成和克隆，从S-E昆士兰的Nambour地区收集具有香蕉束顶病典型症状的香蕉。按照由Wu和Su，1990，《植物病理学杂志》128153-160以及Thomas和Dietzgen，1991，《普通病毒学杂志》72 217-224所描述的方法纯化BBTV颗粒。从病毒颗粒中按照由Francki和Randles，1973，《病毒学》(Virology)54 359-368所描述的方法提取核酸。按照由Gubler和Hoffman，1983，《基因》(Gene)25 263-269所描述的方法利用随机六聚体(Bresatec)引发第一链的合成来合成双链DNA。用绿豆核酸酶(Promega)处理dsDNA并连接至SmaI消化的质粒载体pUC18(Upcroft和Healey，1987，《基因》51 69-75)中。然后用该质粒转化大肠杆菌菌株JM109(Hanahan，1983，《分子生物学杂志》(Journal of Molecular Biology)166 557-580)并通过在X-gal底物上筛选来鉴定潜在的重组克隆(Vieira和Messing，1982，《基因》19 259-268)。
利用碱裂解法(Sambrook等，1989，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)纽约：冷泉港实验室)分离质粒。通过用EcoRI/HindIII消化切下插入片段，在琼脂糖凝胶中电泳并利用0.4M NaOH毛细管点样于Hybond N+(Amersham)上(Sambrook等，1989，《分子克隆：实验室手册》纽约：冷泉港实验室)。利用一Gene-Clean试剂盒(Bresatec)从琼脂糖凝胶中纯化用作DNA探针的插入片段。利用一Ready-To-go标记试剂盒(Pharmacia)按照制造商建议的方法标记DNA探针。按照由Burns等，1994，《病毒学文献》(Archives of Virology)137 371-380描述的方法进行预杂交和杂交。
测序和序列分析，通过碱裂解后聚乙二醇沉淀制备各个BBTV克隆的微量制备品(Hattori和Sakaki，1996，《分析生物化学》(Analytical Biochemistry)152 232-238)。利用35SdATP和一个Sequenase试剂盒(US Biochemicals)按照制造商推荐的方法进行测序。将反应产物在含有7M尿素的8％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶中电泳。将凝胶固定、吹干并暴露于X-线胶片。用于测序的引物为通用测序引物或利用Applied Biosystems(ABI)PCR Mate合成的并按照制造商所建议的方法处理的与所克隆的病毒DNA的适宜区域互补的17-30nt引物。
利用一Gene-Clean试剂盒(Bresatec)从琼脂糖凝胶中纯化用于测序的PCR产物，利用一Sequenase试剂盒(USB)基本上按照由制造商所描述的方法将DNA测序。通过在加入DMSO和3皮摩尔的测序引物后煮沸进行模板DNA(500ng)的变性。
利用通过澳大利亚悉尼大学ANGIS计算机室提供的GCG分析软件包版本8分析核苷酸序列。利用Clustal V.软件包排列核苷酸和氨基酸序列(Higgins等，1991，CABIOS 8 189-191)。利用2个数据库检索分析程序FASTA(Pearson和Lipman，1988，《美国国家科学院进展》 (Proceddings of the National Academy of Sciences，USA)85 2444-2448)和BLAST(Altschul等，1990，《分子生物学杂志》215 403-410)检索4个DNA数据库(GenBank、GenBank Weekly Updates、EMBL和EMBL weekly updates)和5个蛋白质数据库(SwissProt、SwissProt Weekly Updates、PIR、GenPeptide Proteins和GenPeptides Weekly Updates)寻找与BBTV核苷酸和推导的氨基酸序列的序列同源性。
PCR：分析和克隆，利用克隆(i)pBTRP-11、20、80和88以及(ii)pBTRP-P1和P2的各自的核苷酸序列以及BBTV元件1(Harding等，1993，《普通病毒学杂志》74 323-328)和2的核苷酸序列，合成3套紧密邻接的向外延伸引物((i)引物A：5’GCATCCAACGGCCCATA3’；引物B：5’CTCCATCGGACGATGGA3’；(ii)引物C：5’TATTAGTAACAGCAACA3’；引物D：5’CTAACTTCCATGTCTCT3’；(iii)引物E：5’CGGGa/tATa/cTGATTGt/gGT3’；和引物F：5’TACa/tTTTGTCATAGc/tGT 3’)并按照由Burns等，1994，《病毒学文献》137 371-380所描述的方法用于以BBTV DNA为模板的PCR中。利用TA克隆试剂盒(Invitrogen)按照制造商建议的方法将扩增产物克隆到质粒载体pCRII或pCR2000中或者克隆到T加尾的pUC19和Bluescript(Marchuk等，1990，《核酸研究》(NucleicAcids Research)19 1154)中。利用X-gal底物在含有适宜抗生素的Luria Bertani(LB)琼脂上筛选重组克隆并利用碱裂解法分离质粒(Sambrook等，1989，《分子克隆：实验室手册》纽约：冷泉港实验室)。筛选具有明显全长插入片段(大约1kb)的克隆用于测序。
病毒颗粒ssDNA的极性，提取BBTV ssDNA，在琼脂糖中电泳并毛细管点样至双份尼龙膜上(Harding等，1993，《普通病毒学杂志》74 323-328)。对于元件2，利用一DNA3’末端标记试剂盒(Boehringer Mannheim)制备32P标记的链特异性寡核苷酸杂交探针(引物BT2F5.30(G)：5’GGTCCCCTTTAAGATTCCTTTCTTCGTCGC 3’；引物BT2R5.30(H)：5’CGGAAAATGAATAAGTATGAGGTGAAAGAG 3’)。在Rapid-hyb(Amersham)中于60℃将膜分别预杂交12小时和杂交20小时。用1％SDS、2×SSC(0.3M NaCL、0.03M柠檬酸钠，pH7.0)在室温下将滤膜洗涤一次随后用2×SSC在65℃洗涤。在-80℃利用增感屏将吹干的膜暴露于X-线胶片。
对于元件3、4、5和6，利用链特异性探针。利用一个riboprob体外转录试剂盒(Promega)按照制造商建议的方法合成4个元件中每个的全长BBTV克隆的全长RNA转录物。结果5个基因组元件的克隆和测序
从两个文库(i)一个随机引物文库和(ii)一个PCR文库中克隆并测序了BBTV的5个新的基因组元件。(i)随机引物文库
由从纯化的病毒颗粒提取的BBTV ssDNA产生一个随机引物文库。用绿豆核酸酶处理所获的dsDNA，钝端连到SmaI切开的pUC18中并克隆到大肠杆菌JM109中。利用来自BBTV病毒颗粒的、健康香蕉的和来自BBTV DNA元件1的一个部分克隆pBT338插入片段的32P标记的DNA筛选文库(Harding等，1991，《普通病毒学杂志》72225-230；Harding等，1993，《普通病毒学杂志》74 323-328)。BBTV DNA元件2：4个克隆，pBTRP-11、20、80和88，与BBTV病毒颗粒DNA以及彼此之间杂交而不与健康香蕉DNA或pBT338杂交。将来自这些克隆的插入片段测序：都有220bp插入片段的pBTRP-20和88具有相同的序列；pBTRP-80有一个188bp的插入片段且有148bp的序列与pBTRP-20和88相同而在一个末端的另外40bp序列是独有的；pBTRP-11的115bp插入片段的序列与pBTRP-20和88的等价区域相同。由四个克隆的重叠序列设计两个紧密邻接的向外延伸引物(引物A和引物B)以便这些引物能够引发一个环状ssDNA分子的全长dsDNA拷贝的扩增(Harding等，1993，《普通病毒学》74 323-328)。利用这些引物和Pfu DNA聚合酶通过PCR扩增BBTV病毒颗粒的ssDNA，并将产物克隆入pCR2000。利用通用正向和反向引物以及序列特异性引物对所获克隆中的四个在两个方向上进行测序。这些克隆中的三个含有1060bp的插入片段而一个克隆含有一1059bp的插入片段。除了包括1个缺失的9个单核苷酸改变外这四个克隆具有相同的序列。另外，在四个PCR克隆中发现最初四个cDNA克隆的序列。将被称为BBTV DNA元件2的这个元件的共有序列进行编辑(图1a)并与BBTV DNA元件1的序列比较(Harding等，1993，《普通病毒学杂志》)；除了两个显著的同源性区域外这两个序列基本上是不同的。
BBTV DNA元件6：来自同一随机引物文库的另外两个克隆pBTRP-P1和P2也与标记的BBTV病毒颗粒DNA杂交但不和来自健康香蕉或pBT338的DNA杂交。然而，用EcoRV消化这些克隆的都为大约1kb的插入片段而元件1和2都没有EcoRV位点。利用通用的正向和反向引物将这两个克隆测序。这两个克隆的序列相同但却与元件1和2的那些序列明显不同。另外，由该序列设计并合成两个紧密邻接的向外延伸的引物，引物C和D。与这两个引物一起在一个PCR反应中将BBTV病毒颗粒ssDNA用作模板并将所获产物克隆到T加尾Bluescript载体中。筛选出一个明显的全长克隆pBT-P2A1，并由通过核酸外切酶III消化而产生的亚克隆和通用的正向和反向以及序列特异性引物将其在两个方向上测序。然后将最终的1089bp元件6的序列进行编辑(图1e)。(ii) PCR文库
当比较元件1和2的序列时，鉴别出两个同源性的区域。第一个区域，后面定义为茎-环共同区(CR-SL)，包括以前在元件1中鉴定的潜在的茎/环序列(Harding等，1993，《普通病毒学杂志》74 323-328)；第二个区域，其被包含在后面被定义为主要共同区(CR-M)的区域中，是一个茎-环序列5’大约66个核苷酸的序列。据推测所有BBTV基因组元件都应含有一个CR-M，因而由该区域设计两个紧密邻接的向外延伸的简并引物，引物E和F，合成引物并利用BBTV病毒颗粒ssDNA作为模板通过PCR延伸(Burns等，1994，《病毒学文献》137 371-380)。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出7种产物，每种大约1kb。将产物克隆到pCRII中。基于它们与BBTV病毒颗粒DNA杂交而不与来自健康香蕉的DNA杂交以及每组具有与其它两组及元件1、2及6不同的限制性酶切模式，将所获克隆分为3组，组B、C和D(Burns等，1994，《病毒学文献》137 371-380)。组A具有与元件2无法区分的限制性酶切模式并且后来通过测序证实组A的克隆代表元件2的克隆。
假定每组克隆代表一个新的并且唯一的BBTV DNA元件。对于每组克隆，利用通用正向和反向引物对三个克隆(元件3)或四个克隆(元件4和5)进行部分测序。在每种情况下，一个组的所有克隆具有相同的序列，其中除了一个或两个单核苷酸改变外这些序列重叠。另外，来自每组的序列与其它组的和元件1、2和6的序列不同。从每个组或元件中选择一个克隆并在两个方向上全长测序。重要地是，利用覆盖一个衍生自元件1和2的保守CR-M的34个核苷酸的简并引物产生这些克隆组的每一个。来自元件1和2的CR-M不是完全保守的因而预计假想的CR-M序列在其它元件之间可能变化。因而，设计对每个元件唯一的会聚引物并用于对来自BBTV病毒颗粒的ssDNA的每个元件扩增一段包括CR-M的序列。直接利用两个元件特异性会聚引物将所获PCR产物测序。
BBTV DNA元件3：利用通用的正向和反向引物以及三个序列特异性引物从最初的克隆和通过核酸外切酶III消化或限制性酶切片段而产生的亚克隆中将元件3(组C克隆pBTP-64)在两个方向上进行测序。由这个序列设计另外两个会聚引物来扩增一个包括CR-M的380bp产物。这个产物的序列与pBTP-64的序列除了5个单核苷酸改变外是相同的，其中4个是在被最初的简并引物覆盖的序列中而1个在这个序列外位于947位核苷酸。然后编辑1075bp元件3的最终序列(图1b)。
BBTV DNA元件4：利用通用的正向和反向引物以及三个序列特异性引物从最初的克隆和通过核酸外切酶III消化或限制性酶切片段而产生的亚克隆中将元件4(组D克隆pBTP-62)在两个方向上进行测序。由这个序列设计另外两个会聚引物来扩增一个包括CR-M的350bp产物。除了在被最初的简并引物覆盖的序列中的2个单核苷酸改变外这个产物的序列与pBTP-62的序列相同。然后编辑1043bp元件4的最终序列(图1c)。
BBTV DNA元件5：利用通用的正向和反向引物以及三个序列特异性引物从最初的克隆和通过核酸外切酶III消化或限制性酶切片段而产生的亚克隆中将元件5(组B克隆pBTP-129)在两个方向上进行测序。由这个序列设计另外两个会聚引物来扩增一个包括CR-M的290bp产物。除了在被最初的简并引物覆盖的序列中的1个单核苷酸改变外这个产物的序列与pBTP-129的序列相同。然后编辑1018bp元件5的最终序列(图1d)。基因组元件的方向和与香蕉束顶病的联系
我们以前已经证明BBTV基因组被包壳包成单链DNA(Harding等，1991，《普通病毒学杂志》72 225-230；Harding等，1993，《普通病毒学杂志》74 323-328)。为了确定在病毒颗粒中每个元件的方向，合成了特异性针对每个元件的链特异性DNA或RNA探针并与BBTV病毒颗粒DNA杂交。元件2特异性探针为两个3’末端标记的30体寡核苷酸而特异性针对元件3、4、5和6的探针为SP6、T3或T7启动的32P标记的RNA转录物。对于每个元件，与在图1中提供的元件序列互补的探针同BBTV病毒颗粒DNA强烈杂交而与图1的序列相同的探针不杂交(图2)。这表明每个元件被包壳包成ssDNA并且仅仅处于在图1中提供的一种方向上。
另外，将与BBTV病毒颗粒ssDNA杂交的链和元件特异性探针用作探针来证明每个元件是与香蕉束顶病相关的。将从3个(对于元件2)或4个(对于元件3到6)不同BBTV分离株提取的植物DNA以及来自4个健康香蕉的DNA进行Southern印迹并与每种探针杂交。每个元件特异性探针与来自BBTV感染的香蕉的所有提取物中的一种预期大小的低分子量DNA杂交，但不同来自健康香蕉的提取物杂交(结果未示)。这表明每个元件是清楚地与疾病以及病毒相关的。BBTV基因组元件的分析
将这里介绍的5个BBTV基因组元件的序列和元件1的序列排列并比较。6个序列的每个除了两个显著的在所有6个元件之间具有不同程度同源性的区域外都不同。
茎环共同区：我们以前已经在BBTV元件1中鉴定了一个潜在的具有与双粒病毒不变的环序列(Lazarowitz，1992，《植物科学的重要综述》(Critical Reviews in Plant Sciences)11 327-349)几乎相同的环序列的茎-环结构(Harding等，1993，《普通病毒学杂志》74 323-328)。在元件2到6中也发现了一个等价的茎/环结构(图3)。每个元件具有一11个核苷酸的环序列，其中的9个连续的核苷酸在所有元件之间是保守的。每个元件还具有一10bp茎序列，其中14个核苷酸是完全保守的。然而，当比较所有的6个元件时，同源性的区域延伸达到茎-环结构5’的25个核苷酸以及茎-环结构3’的13个核苷酸。在元件1、3、4和5之间5’的25个核苷酸是完全保守的。在元件2和6中都明显地有两个缺失。在元件2中，8个核苷酸与元件1、3、4和5完全保守，而在元件6中，16个核苷酸与这些其它元件保守。茎-环3’的13个核苷酸除了在元件2中的一个明显单核苷酸缺失外在所有6个元件中是完全保守的。包括茎-环序列的多达69个核苷酸的序列被称为茎-环保守区或CR-SL。
主要共同区：第二个共同区定位于CR-SL 5’的不同距离处并被称为主要共同区或CR-M。该区在大小上从元件1中的65个核苷酸到元件5中的92个核苷酸之间变化(图4)。元件1明显地具有CR-M的前26个核苷酸的缺失和另一个单核苷酸的缺失。元件2、3和4具有两个单核苷酸的缺失而元件6具有一个单核苷酸的缺失。在所有元件之间45个核苷酸是保守的而且在元件1中缺失的前26个核苷酸中的23个在元件2到6之间是保守的。另外在元件2到6中，有一个几乎完全的从4到20位和21到36位核苷酸的16个核苷酸的直接重复序列(ATACAAc/gACa/gCTATGA)。另外将一15个核苷酸的GC丰富序列(平均86％的GC)定位于从78到92位核苷酸，并且其在所有的元件之间93％保守。
在CR-M的最后一个核苷酸和CR-SL的第一个核苷酸之间的序列在长度上从元件1中的22个核苷酸到元件2中的233个核苷酸之间变化(图1和5)。有趣的是，在元件3和4中的175个核苷酸的该序列在这两个元件之间97％保守。
潜在的TATA盒：在BBTV元件1中鉴定出了一个潜在的TATA盒并定位于茎环最后核苷酸3’的20个核苷酸和推测的复制酶基因的启始密码子5’的43个核苷酸中(Harding等，1993，《普通病毒学杂志》74 323-328)。在元件2到6中也鉴定出了类似的潜在的TATA盒。在这些元件的每个中，潜在的TATA盒是一9个核苷酸的序列，CTATa/ta/tAt/aA，并定位于茎-环序列的下游(图1)。然而，茎-环序列的最后一个3’核苷酸和潜在的TATA盒之间的序列在元件2到6中比在元件1中长得多，并且从元件5中的157个核苷酸到元件4中的227个核苷酸之间变化(图1和5)。潜在聚腺苷酸化信号的分析
鉴定出了6个潜在的与元件3到6的主要ORF的3’末端相连的聚腺苷酸化信号。一个10到17个核苷酸的GT丰富区位于这些聚腺苷酸化信号的每一个的0到23个核苷酸之间，并且每个GT丰富区含有三核苷酸序列TTG(图4)。只有一个在元件2中鉴定出的潜在聚腺苷酸化信号具有一个相应的含有三核苷酸序列TTG的GT丰富区，并且这位于在病毒颗粒意义上潜在TATA盒的九核苷酸3’的233核苷酸处。总结
所有的6个元件在推测的基因间区或非翻译区共享2个共同区，CR-SL和CR-M，并且6个元件中的5个在病毒颗粒的意义上具有一个与潜在的TATA盒和聚腺苷酸化信号相连的大的ORF(图5)。CR-SL包括保守的茎-环结构。11个核苷酸的环序列在所有的BBTV元件中除了2个核苷酸外都保守并且与在9个双粒病毒中(Lazarowitz，1992，《双粒病毒组：基因组结构和基因功能》(Geminiviruses：genome structure and gene function)2)、CFDV中(Rohde等，1990，《病毒学》176 648-651)和另一BBTV元件中(Yeh等，1994，《病毒学》198 645-652)存在的序列相似。对于双粒病毒已经描述了一个用于在滚环复制中影响环序列的模型(Saunders等，1993，双粒病毒-非洲木薯花叶病毒的DNA形式与复制的滚环机制一致，第IX届国际病毒学大会，格拉斯哥，1993年8月，摘要第60-18页)。在BBTV中的环序列可能具有相似的功能。在所有BBTV元件中茎-环序列也是高度保守的并含有在小麦矮小双粒病毒中作为病毒链DNA合成启始位点的五核苷酸序列TACCC(Heyraud等，1993，《欧洲分子生物学组织杂志》(EMBOJournal)12 4445-4452)。
在所有元件中鉴定了主要共同区(CR-M)并且定位于主要ORF的3’(除了未鉴定出主要ORF的元件2)和CR-SL的5’(图5)。在除了元件1外的所有元件中于CR-M内都鉴定出了六核苷酸重复序列。然而，除了这些序列可能与启动子序列或部分启动子序列相连外还没有功能能够直接归因于这些序列。CR-M还含有一个定位于3’末端的15 nt GC丰富序列，并具有潜能形成一个小的茎-环结构。这个GC丰富序列还含有与动物细胞和病毒中基因启动子中发现的Sp1结合位点相似的两个直接GC重复序列(Fenoll等，1990，《植物分子生物学》(Plant Molecular Biology)15 865-877)。一个单子叶感染玉米条纹双粒病毒中的相似启动子被表明是最大向右转录所需的，而且似乎还以一种非协同的方式结合玉米核因子(Fenoll等，1990，《植物分子生物学》15 865-877)。
Karan等，1994，《普通病毒学杂志》75 3541-3546报道元件1CR-M序列在南太平洋组的BBTV分离株中(96.5％的同源性)和亚洲组的分离株中(98.％的同源性)是高度保守的，但在两个组的分离株之间是高度可变的(68.0％的同源性)。此处报道了在一种澳大利亚分离株的6个不同元件的CR-M序列之间有76％的同源性。因此，重要的是确定在来自不同组分离株的各个元件的CR-M序列之间的同源性水平来观察在分离株的组内这些序列是否高度保守而在组间和不同元件之间是否可变，进而确定这是否具有生物学意义。
在元件CR-M和CR-SL之间的核苷酸长度和序列在6个不同元件的4个中是不相似的。然而在元件3和4中，该175个核苷酸的区域是97％同源的，而从CR-M的5’末端到CR-SL的3’末端的334个核苷酸是98％同源的。在双粒病毒组中已发现了一个相似的300个核苷酸的大的共同区，并且在每个二分的双粒病毒组的A和B元件之间是相同的(Lazarowitz，1992，《双粒病毒组：基因组结构和基因功能》。在双粒病毒组中，该区包括茎一环区。在SCSV的包括基环区的7个元件的5个中也发现了一个与双粒病毒类似但与6个BBTV元件的4个不同的同源性的区域(Surin等，1993，地下三叶草矮小病毒基因组，由编码单一ORF的微染色体组成，第IX届国际病毒学大会，格拉斯哥，1993年8月，摘要62-1页。)。
元件3、4、5和6在病毒颗粒意义上于CR-SL的3’都有一个大的ORF。这些ORF的每个都有与它们相连的潜在的保守TATA盒和聚腺苷酸化信号(图8)。潜在的TATA盒与Buchei等，1990，《分子生物学杂志》(Journal of Molecular Biology)212，563-578所描叙的基本相似的九核苷酸序列CTATa/ta/tAa/tA高度保守。在每个元件中，在潜在的TATA盒和翻译启始密码子之间的距离从元件3中的13个核苷酸到元件1中的102个核苷酸之间变化。在编码大的ORF的5个元件中鉴定出了一个ATGG翻译启始密码子。然而，在元件3中鉴定了2个可能的翻译启始密码子，第一个在213位核苷酸处(ATGT)，而第2个在227位核苷酸处(ATGG)，第2个启始密码子与第1个在同一框内。这可能提示第2个启始密码子是正确的密码子；这可通过5’RACE或ORF翻译产物的N-末端测序来证实。在元件1、3、4、5和6中每个聚腺苷酸化信号3’的0到24个核苷酸被鉴定为GT丰富区域。这些GT丰富区域的每个都含有核苷酸序列TTG。在元件3和6中的聚腺苷酸化信号都含有这些序列。共有聚腺苷酸化信号(Aa/tTAAa/t)和一个含有TTG三核苷酸序列的3’近侧GT丰富区的组合只与元件1、3、4、5、和6中单一的主要毒粒意义ORF相关，而在这些序列的其它处未发现，这表明这些元件每一个都编码一个单一的基因。相似的序列已与许多聚腺苷酸化信号相关连并且可能是有效终止所需的(Gil和Proudfoot，1984，《自然》(Nature)312 473-474；Conway和Wickens，1985，《美国国家科学院进展》82，3949-3952)。实施例2：BBTV基因间区对表达的修饰材料与方法质粒：
土壤杆菌介导的转化
将来自BBTV基因组的所有潜在启动子连入土壤杆菌二分载体pBI101.3(Clontech)中。该质粒具有一个由胭脂氨酸合成酶启动子/NPTII基因(卡那霉素抗性基因)/胭脂氨酸合成酶(NOS)终止子和一个带NOS终止子的“无启动子”β-葡糖苷酸酶基因(GUS)组成的一个抗生素抗性盒。将BBTV衍生的序列分别连入无启动子基因(GUS)5’的单一BamHI位点中。将质粒pBI121(Clontech)用作对照质粒。该质粒除了具有GUS基因5’的启动GUS表达的CaMV35S启动子外与pBL101.3是相同的。
微粒轰击
对于通过微粒轰击对BBTV启动子活性的瞬时分析，将BBTV启动子/GUS/nos盒亚克隆到pGEM3zf+(Promega)中。作为大部分实验的一个阳性对照将CaMV 35S启动子/GUS/nos盒同样由pBI121亚克隆互入pGEM3zf+中(pGEM35S-GUS)。利用Qiagen Plasmid Maxi试剂盒(Qiagan)按照制造商的说明以高度纯化的形式大量制备这些质粒用于biolistics。
转化
通过微粒轰击、电穿孔或土壤杆菌介导的转化(Horseh等，1989，在《植物分子生物学手册》(Plant Molecular Biology Manual)Gelvin等编Dordecht Kluwer学术出版社，A5/1-5/9页；Hauptmam等，1987，《植物细胞报告》(Plant Cell Reports)6 265-270；Last等，1991，《理论和应用遗传学》(Theoretical and AppliedGenetics)81 581-588)将质粒pBI121、pBI101.3或GUS基因5’带有BBTV衍生序列的pBI101.3引入一系列植物物种和组织类型中。
对GUS表达的检测基本上与在Jefferson，1987，《植物分子报道》(Plant Molecular Reporter)5(4)：387-405中所描述的相同。BBTV启动子构建物的制备引物：BT6.1 (25mer) 5′ gcctgcagagttgtgctgtaatgtt 3′BT6.2 (24mer) gcggatccgcttctgccttccgctBT6.3 (25mer) gccctgcagcatggacgtcagcaaggBT3.1 (24mer) gcctgcagactattgtatggaatgBT3.2 (23mer) gcggatccctatctagacactggBT4.1 (23mer) gctctagaatgggtattgatgtaBT4.2 (25mer) gcggatccttagctgcgtcctatttBT5.2 (23mer) gcggatccgacgagtgatttcggBT129V3.17(17mer) gttatcatggcatcgacBT1R1.17 (17mer) gaacaagtaatgactttBT1.F4.30 (30mer) ggaagaagcctctcatctgcttcagagagcBT1. INT.R28 ggatcctacatgacaatttaaatgaaccBT1. INT.F25 aagcttataaaacgaaggcgatgaaPCR条件顺序步骤1. 94℃×5分钟2. 94℃×1分钟
42℃×1分钟)×40
72℃×1分钟3.72℃×10分钟1.BBTV基因间区的克隆
BBTV元件6
全长元件6(1089bp)
1.利用引物BT6.1(+746)和BT6.2(+280)从BBTV6克隆P2A1PCR扩增基因间区。
2.将623bp基因间区以Pst和BamHI片段亚克隆入pUC19(pUC6.1)。
3.将基因间区从pUC6.1以一个HindIII和BamHI片段克隆入pBI101.2(pBT6.1)。
4.将BBTV6启动子/GUS/nos片段从pBT6.1以一个HindIII和EcoRI片段亚克隆入pGEM3zf+(pGEM6.1-GUS)
BBTV6基因间区5’缺失的产生
pBT6.2的构建
1.通过用AccI，一个在元件6环中的+1018处存在的限制性位点和在pUC19的多克隆位点5’端存在的PstI消化pUC6.1产生一个BBTV6基因间区的272bp5’缺失。
2.用Klenow片段补平末端并再次连接产生pUC6.2。
3.将351bp片段从pUC6.2以一个HindIII和BamHI片段克隆入pBI101.3(pBT6.2)。
4.将BBTV6启动子(351bp)/GUS/nos盒从pBT6.2以一个HindIII和EcoRI片段亚克隆入pGEM3zf+(pGEM6.2-GUS)。
pBT6.3的构建
1.利用引物BT6.3(+41)和BT6.2(+280)通过PCR扩增从BBTV6克隆P2A1产生一个BBTV6基因间区的384bp 5’缺失。
2.将239bp基因间区以一个PstI和BamHI片段克隆到pUC19中(pUC6.3)。
3.将基因间区从pUC6.3以一个HindIII和BamHI片段克隆到pBI101.3中(pBT6.3)。
4.将BBTV6启动子(239bp)/GUS/nos盒从pBT6.3以一个HindIII和EcoRI片段克隆到pGEM3zf+中(pGEM6.3-GUS)。
pBT6.4的构建
1.通过用BamHI和HaeIII(在BBTV6环中的+108位点处存在的一个限制性位点)消化pUC6.3产生一个BBTV6基因间区451bp 5’缺失。
2.用Klenow片段补平末端并将172bp片段钝端克隆到pBI101.3的SmaI位点中(pBT6.4)。
3.将BBTV6启动子(172bp)/GUS/nos盒从pBT6.4以一个HindIII和EcoRI片段亚克隆到pGEM3zF+中(pGEM6.4-GUS)。
BBTV元件1
全长元件1(1111bp)
1.利用引物BT1R1.17(+986)和BT1F4.30(+129)从全长BBTV1克隆PCR扩增一个215bp含有BBTVI基因间区的片段。
2.用TaqI(一个在BBTV1环中的+118位点处存在的限制性位点)消化所获的PCR产物。
3.利用Klenow片段将所获214bp片段补成平端并克隆到pBI101.3的SmaI位点中(pBT1.1)。
4.将BBTVI启动子(214bp)/GUS/nos盒以一个HindIII和EcoRI片段由pBT1.1亚克隆到pGEM3zf+中(pGEM1.1-GUS)。
注：通过3’RACE实验在BBTV-1鉴定出了一个小的ORF。这个ORF位于+430到+555位置处。基于这个ORF的位置分离了另一个BBTV-1基因间区启动子。
1.利用引物BT1.INT.28(+429)和BT1.INT.F25(+560)从全长BBTV-1克隆PCR扩增出了BBTV-1中基于最近鉴定的较小ORF的大基因间区。
2.将所获额980bp基因间区以一个BamHI和HindIII片段克隆到pBI101.3中GUS报道基因的上游(pBT1.INT)。
BBTV元件2
全长元件2(1059bp)
以一个XbaI片段于+361位点处克隆到pUC19中的BBTV2全长双链复制形式(pUC-BT2)获自Raktham Wanitchakorn。
1.通过用XbaI和AccI(在元件2环的+565位点处存在的一个限制性位点)消化pUC-BT2产生一个855bp的基因间片段。利用Klenow片段补平AccI末端而保持XlaI位点为粘性。
2.将这个全长基因间区直接克隆到类似准备的pGEM3zf+载体中(pGEM2.1)。
3.将基因间区以一个HindIII和BamHI片段由pGEM2.1克隆到pBI101.3中(pBT2.1)。
4.将BBTV2启动子(866bp)/GUS/nos盒从pBT2.1以一个HindIII和EcoRI片段克隆到pGEM3zf+中(pGEM2.1-GUS)。
BBTV元件3
全长元件3(1075bp)
1.利用引物BT3.1(+761)和BT3.2(+212)从BBTV感染的香蕉的细胞核提取物(Qld)PCR扩增出元件3全长基因间区。
2.以一个PstI和BamHI片段将这个526bp基因间区亚克隆到pGEM3zf+中(pGEM3.1)。
3.将基因间区以一个HindIII和BamHI片段由pGEM3.1克隆到pBI101.3中(pBT3.1)。
4.将BBTV3启动子(526bp)/GUS/nos盒以一个HindIII和EcoRI片段由pBT3.1亚克隆到pGEM3zf+中(pGEM3.1-GUS)。
BBTV元件4
全长元件4(1043bp)
1.利用引物BT4.1(+662)和BT4.2(+278)从BBTV感染的香蕉的细胞核提取物(Qld)PCR扩增出元件4全长基因间区。
2.以一个Xbal和BamHI片段将这个659bp基因间区亚克隆到pGEM3zf+中(pGEM4.1)。
3.将基因间区以一个Xbal和BamHI片段由pGEM4.1克隆到pBI101.3中(pBT4.1)。
4.将BBTV4启动子(659bp)/GUS/nos盒以一个XbaI和EcoRI片段由pBT4.1亚克隆到pGEM3zf+中(pGEM4.1-GUS)。
BBTV元件5
全长元件5(1018bp)
1.利用引物BT129V3.17(+639)和BT5.2(+230)从BBTV感染的香蕉的细胞核提取物(Qld)PCR扩增出元件5全长基因间区。
2.用BamHI和AccI(在元件5环中+794位点处存在的一个限制性位点)消化所获得的PCR产物。用Klenow片段补平AccI位点而保持BamHI末端为粘性。
3.将所获的454bp基因间区直接亚克隆到类似地准备的pGEM3zf+中(pGEM5.1)。
4.将基因间区以一个HindIII和BamHI片段由pGEM5.1克隆到pBI101.3中(pBT5.1)。
5.将BBTV5启动子(454bp)/GUS/nos盒以一个HindIII和EcoRI片段由pBT5.1亚克隆到pGEM3zf+中(pGEM5.1-GUS)。2.通过Nicotiana tabacum(NT)细胞系的微粒轰击瞬时分析BBTV启动子活性
NT细胞悬液的制备
1.将25ml NT细胞悬液传代培养到75ml新鲜NT液体培养基中并于28℃在适当光照下振荡。
2.传代培养后2天，将50ml活跃生长的NT培养物转移到一个50mlFalcon试管中并放置5-10分钟。
3.将所获的收集的NT细胞重悬于一等体积的NT液体培养基中。
4.将200μl的NT细胞混合物在NT固体培养基上点样，并在空气中干燥3-4小时。
5.在28℃于适宜的光照下孵育NT斑点2天。
6.按照下面所描述的将NT斑点进行微粒轰击。每个启动子构建物轰击5个NT斑点。
7.Biolistics后将NT斑点在28℃于适宜的光照下孵育3天。
8.利用X-葡糖苷酸底物通过每个启动子构建物GUS染色一个NT斑点定性分析启动子的活性。将剩余的4个NT斑点利用MUG底物进行定量GUS荧光法分析。这些技术基本上按照Jefferson 1987《植物分子报告》5(4)：387-405所描述的进行。
用于微粒轰击的DNA-金悬液的制备
1.短暂振荡金悬液并在冰水中超声处理30秒。
2.在冰上通过向25μl金悬液(100mg/ml)中加入2μg的DNA、25μl CaCl.2H2O(2.5M)和5μl的无亚精胺的碱(0.1M)来制备DNA-金悬液。
3.断续地振荡DNA-金悬液5分钟然后放置冰上10分钟。
4.移走22μl体积的上清并弃去。振荡剩余的悬液并将5μl的一份用于微粒轰击。
5.每个启动子构建物使用一个金制备物。这种DNA-金悬液提供了足够的悬液来轰击5个NT斑点。
粒子流枪的轰击条件25mmHg真空氦压力大约550Kpa平台高度10cm用于保护靶子的筛所用的构建物：试验：pGEM6.1-GUS、pGEM6.2-GUS、pGEM6.3-GUS、pGEMA6.4-GUS
pGEM1.1-GUS、pGEM2.1-GUS、pGEM3.1-GUS、pGEM4.1-GUS、pGEM5.1-GUS
对照：pGEM35S-GUS结果：实验结果示于图中。
BBTV6启动子活性的比较
1.BBTV元件6的全长基因间区具有与来自pBI121的800bpCaMV35S启动子相当的启动子活性。
2.272bp的5’缺失(pGEM6.2-GUS)引起启动子活性的显著增加，这在另外的112bp 5’缺失(pGEM6.3-GUS)下仍维持。
3.具有另外的75bp 5’缺失(pGEM6.4-GUS)时，启动子活性显著降低。
结果的意义
所观察到的在质粒pGEM6.1-GUS和pGEM6.2-GUS之间启动子活性的增加提示CR-M周围的272bp区可能含有一个对这种启动子活性下降负责的推测的下调序列。
所观察到的在质粒pGEMA6.2-GUS、pGEM6.3-GOS和pGEM6.4-GUS之间的启动子活性水平表明与BBTV基因间区相关的强启动子活性的大部分与一个位于CR-S/L 3’的一个112bp区域相关。重要的是，这个区域含有一个推测的启动子基元TGA-1b(+44位点处)，其含有与其它启动子基元和转录因子结合域相似的核心序列TGACGT。
BBTV1-6启动子的比较
1.在NT细胞悬液的瞬时转化中BBTV-1启动子无活性。
2.BBTV-2启动子具有6个BBTV元件中最高的启动子活性，其水平比来自pBI121的800bp CaMV 35S启动子高2-3倍。
3.BBTV-3，BBTV-4，BBTV-5启动子相对弱，其活性水平比CaMV35S启动子低大约50％。
4.BBTV-6全长基因间区具有与CaMV 35S启动子相似的启动子活性水平。
结果的意义
与BBTV-1基因间区相关的启动子活性的缺失可能提示这个启动子具有高度的组织特异性表达模式或需要在烟草细胞核中缺乏的转录因子。在该启动子中一个与S期特异性细胞表达相关的推测的启动子基元(小麦组蛋白H3基因的1型元件)的鉴定可能暗示其活性局限于活跃分裂的分生组织类型。
与BBTV-2基因间区相关的高水平启动子活性可能使该序列成为一个潜在的有用启动子来驱动高水平的表达。尽管BBTV感染单子叶植物，但根据本研究似乎BBTV 2-6启动子在双子叶系统中是有不同程度活性的。3.在其它植物物种中BBTV启动子活性的瞬时分析
黄瓜的微粒轰击
1.将黄瓜胚前期愈伤组织在biolistic转化前2周传代培养于SQM2EV培养基上。
2.在biolistic转化前4天将愈伤组织转移至一小的SQM2EV平板上。
3.按照上面的方法进行微粒轰击。
4.利用X-葡糖苷酸底物定性GUS染色，在转化的愈伤组织中观察GUS活性(biolistics后2天)。所用构建物：pBT6.1、pBT6.3、pBT1.1、pBI121.
结果
1.GUS染色后pBT6.1和pBT6.3都产生了与pBI121相似数目的蓝斑(转化情况)。
2.在黄瓜愈伤组织中pBT1.1未表现启动子活性的迹象(即未观察到蓝斑)。
密生西葫芦原生质体的电穿孔
密生西葫芦原生质体的分离
1.将1.5ml体积的胚胎密生西葫芦愈伤组织悬液与20ml EnzymeMix(E3)混合并在25℃黑暗中于一慢摇床(30-50RPM)上孵育5-6小时。
2.通过450μm、105μm和51μm大小的筛并在40-50g下离心5分钟分离原生质体。
3.在PWS溶液中洗涤原生质体一次，最后重悬于一已知容积的TBS中。
4.利用一校正的滑动计数仪估计细胞数，并将体积调节至含有1×106原生质体/ml。
5.加入10μg质粒DNA至1ml原生质体中，并在冰上孵育10分钟。
密生西葫芦原生质体的电穿孔
1.原生质体：利用一个Gene Pulsar(BioRad)仪以300V的3个脉冲、10毫秒脉冲宽度和10毫秒脉冲延迟以10μg质粒DNA在一BioRad电穿孔杯(0.4cm电极裂隙)中将DNA混合物电穿孔。
2.将原生质体在冰上孵育另外10分钟并在一个微型离心机中以1000RPM离心沉降。
3.在培养基415A中将原生质体洗涤一次，最终重悬于1ml的415A中。
4.将原生质体转移至一个12孔微量滴定板并在黑暗中在一慢摇床上孵育48小时。
5.孵育后通过离心收获原生质体并检测GUS活性。
荧光检测法GUS的检测
1.将5μg提取的原生质体蛋白标准地用于荧光检测法(利用BioRad蛋白质检测试剂评价)。
2.用蛋白质提取缓冲液将体积调整至100μl并与100μl MUG底物(2mM)在37℃孵育30分钟。
3.通过加入1ml Na2CO3终止反应。
4.利用一荧光分光光度计(激发365nm；发射455nm；积分时间-10)以一4-MU标准曲线(0-500nm)估计酶活性。
利用由Jefferson，1987，《植物分子报道》5(4)：387-405所描述的一种荧光检测法分析GUS活性。所用构建物：pBT6.3、pBT1.1、pBI121。
结果 构建物GUS活性(pmol MU/分/mg蛋白 质) pBI101.3 0 pBI121 10,000 pBT1.1 ＜1000 pBT6.3 22,000
无启动子GUS二分载体(pBI101.3)未观察到GUS活性。
由BBTV6基因间区(pBT6.3)的239bp片段驱动的GUS活性水平比800bp CaMV 35S启动子(pBI121)大2倍。
由BBTV1启动子(pBT1.1)观察到少量至没有GUS活性。
小麦细胞悬液的微粒轰击
1.在微粒轰击前4天将小麦细胞悬液传代培养至50ml WTL1培养基中。
2.通过低速离心沉淀小麦细胞并重悬在10ml WTL1培养基中。
3.就在轰击前将细胞移至无菌滤纸上。
4.如前所述进行微粒轰击。
5.biolistics后2天利用X-葡糖苷酸底物将转化的小麦悬液进行GUS染色。
所用构建物：pBT1.1、pBT2.1、pBT3.1、pBT4.1、pBT5.1、pBT6.1、pBI121、DM8052(驱动GUS表达的水稻肌动蛋白增强的启动子)。
结果
1.每次转化，水稻肌动蛋白增强的启动子产生＞5000个蓝斑。
2.每次转化，pBI121平均产生大约70个蓝斑。
3.在所有测试的BBTV启动子构建物中，只有pBT2.1是活性的，每次转化平均产生100个蓝斑。
香蕉雄花胚胎愈伤组织的微粒轰击
1.按照由Escalant等，1994，《体外细胞和发育生物学》(In VitroCellular and Developmental Biology)30P：181-186描述的方法利用雄花产生Cavendish香蕉“Williams”变种的胚胎培养物。于一临时浸透系统中将这种培养物维持在液体MP培养基中(Escalant等，1994，《体外细胞和发育生物学》30P：的81-186)。
2.在微粒轰击前5天将胚胎愈伤组织移至固体MP培养基上。
3.如前所述将组织进行微粒轰击。
4.在biolistics后2天利用X-葡糖苷酸底物通过GUS染色使瞬时的GUS活性显色。
所用的构建物：pGEM2.1-GUS、pGEM3.1-GUS、pGEM4.1-GUS、pGEM5.1-GUS、pGEM-Ubi(驱动GUS表达的玉米遍在蛋白启动子)。
结果
1.在这种组织类型中，玉米遍在蛋白启动子驱动GUS高水平表达，具有强的蓝染斑或转化事件(因为强度和数量很难确定斑点的确切数目)。
2.所测试的BBTV启动子构建物中，所有启动子都表现出低水平的活性(每次转化＜10个蓝斑)。
基于蓝斑数目的强度的大概顺序是：pGEM2.1-GUS(最高)、pGEM4.1-GUS、pGEM3.1-GUS和pGEM5.1-GUS(最低)。
结果的意义
来自在另外的植物物种中BBTV启动子的活性的瞬时分析表明，BBTV6启动子(尤其是239bp片段，pBT6.3)在未分化的葫芦(双子叶)组织类型中似乎是活跃的。
来自小麦细胞悬液的微粒轰击结果提示，只有BBTV2启动子具有显著程度的活性。这个结果表明在未本科单子叶植物中至少一个BBTV启动子在某种程度上是活跃的。
利用香蕉胚胎发育培养的瞬时检测表明，目前所测试的BBTV启动子在它们的宿主植物物种中具有某种水平的活性。另外，所测试的BBTV启动子中最强的是BBTV元件2的启动子，这可能反映在今后其作为一个潜在的有用的启动子的重要性。4.通过土壤杆菌感染NT细胞悬液的稳定转染
1.在转化前2到3天将5ml含有100μg/ml卡那霉素的LB培养物用来自40％甘油贮液的被转化的目的土壤杆菌属接种。
2.在传代培养后5-7天使用NT细胞(每次转化利用4ml该培养物，以额外的4ml作为不接受细菌的对照)。注：对每个构建物进行双份转化。
3.每ml NT细胞加入1μl乙酰丁香酮(20mM乙醇溶液)。
4.利用一5ml移液器将NT细胞吹吸大约20次来帮助诱导损伤以及提高转化事件。
5.将100μl的土壤杆菌培养物(密集生长)加入一个含有4ml处理过的NT细胞的微量滴定板中并彻底混合。
6.将平板于28℃在适度光照下孵育3天。
7.孵育后，每孔中加入10ml含有500μg/ml羧苄青霉素的NT液体培养基(NTC)。
8.在用NTC补足体积的50ml Falcon试管中将细胞以1K离心4min。
9.重复洗涤2次。
10.最后将细胞重悬于5ml NTC中，并将2ml接种于NTKC固体培养基(卡那霉素100μg/ml、羧苄青霉素500μg/ml)上。将平板在适度光照下于28℃孵育。
11.感染后3-4周，将转化子分别传代培养并以每两周一次的传代培养下维持筛选。
12.利用X-葡糖苷酸底物通过GUS染色观察启动子活性。
所用的构建物：pBT6.1(3个NT细胞系)、pBT6.2(3个NT细胞系)、pBT6.3(2个NT细胞系)、pBT2.1(25个NT细胞系)
结果
1.在用所有BBTV启动子构建物稳定转化的NT愈伤组织中都观察到了强的GUS活性。
2.在BT2.1转化的不同NT细胞系之间表达的变化极可能是由于位点效应(DNA整合入宿主基因组的位点)和整合的拷贝数。
结果的意义
这些实验表明在稳定转化的烟草未分化细胞系中BBTV6和BBTV2启动子是高度活跃的。这些发现支持来自微粒轰击实验的结果，在其中这些启动子表现出了强的瞬时活性。另外，这些结果证实来自这些启动子的活性不受宿主基因组中稳定整合的显著影响。5.烟草通过土壤杆菌感染叶盘的稳定转化
1.通过电穿孔将启动子的二分结构引入土壤杆菌菌株LBA4404。
2.在卡那霉素筛选(100μg/ml)下培养转化的土壤杆菌并通过改良的碱裂解法证实其含有启动子结构。
3.在转化前2到3天由一个单一集落或40％甘油贮液启始5ml待用的被转化的土壤杆菌LB培养物，并在28℃振荡。
4.用LB将培养物稀释到20倍并移至一个无菌的10ml小管中。
5.切下3-6周龄Xanthii烟草的叶子并切成1cm×1cm的片。
6.将这些片移至稀释的土壤杆菌培养物中并浸泡10-15min。
7.将烟草片于无菌滤纸上吸干，放在MS104培养基的近轴(上)侧并在28℃孵育直至可看到轻微的细菌生长(2-3天)。
8.将叶子片转移至MS104筛选培养基(100μg/ml卡那霉素和200μg/ml timentin)中并在适宜光照下于28℃孵育。
9.大约2周后，在感染的部位可见冠瘿愈伤组织，另外2-5后芽变明显。
10.当能看到确定的茎时，将芽切除并置于MS生根培养基中(100μg/ml卡那酶素和200μg/mltimentin)。
11.在筛选下将活跃生长的小植株(带根系统)维持在培养物中并利用X-葡糖苷酸底物将推测的转化子进行定性GUS染色。
12.大体上每个启动子构建物获得了6-12个推测的转化子。
所用的构建物
测试： pBT6.1、 pBT6.2、 pBT6.3、 pBT6.4
pBT2.1、 pBT2.2、 pBT2.3、 pBT2.4
pBT1.1、 pBT3.1、 pBT4.1、 pBT5.1
对照： pBI121
结果
1.在用pBI121转化的叶、茎和根中有强的组成性GUS表达。
2.来自大约10％的BBTV启动子构建物转化的烟草小植株的叶和根部分中有弱的韧皮部局限的GUS表达。剩余的90％转化子在叶和根内未表现出GUS活性。
结果的意义
来自BBTV启动子构建物稳定转化烟草的大部分(90％)组织的定性GUS染色结果提示，这些启动子在整个植物或分化组织中具有小到无启动子活性。一些BBTV基因间区(元件2和6)在瞬时系统中(烟草细胞系的微粒轰击)表现高水平表达的事实表明这些启动子的活性可能局限于未分化细胞类型或这些启动子在从未分化愈伤组织到分化细胞类型的过度中被沉默化。这个原理进一步被由稳定转化的烟草(未显示GUS活性)叶子再生的愈伤组织在染色时展现改变的GUS表达水平这样一个实验所支持。
由于在未分化的细胞阶段大部分植物转化系统依靠被转化组织的强筛选，这样一个独特的表达模型的好处可能在于驱动筛选的抗性。因而一个含有驱动NPTII表达的BBTV启动子(元件2或6)的转化盒在植物转化的早期阶段(愈伤组织阶段)提供强的卡那霉素抗性。但是一旦细胞分化(即形成芽、叶等)启动子便被关闭。因为在转基因植物中抗生素和除草剂筛选基因的表达在某些国家是一个主要的问题，所以这样一个启动子的应用将是有好处的。
6.驱动NPTII表达的BBTV启动子的分析
BBTV6-NPTII构建物的产生
1.将来自pUC6.3的BBTV元件6基因区间的239bp片段以一个BamHI和PstI片段连同CaMV 35S终止子克隆在800bp NPTII基因的上游。
2.将所获的BBTV6启动子(239bp)/NPTII/CaMV 35S终止子盒以一个SacI和XbaI片段克隆在二分载体pTAB5中的土壤杆菌T-DNA的左和右边界之间。
3.将来自pGUS2的CaMV 35S启动子(550bp)/GUS/CaMV 35S终止子(200bp)盒以一个EcoRI片段克隆在下游(见图14)。
4.随后将所获的下面详细描述的载体pBT6.3-NPT用于土壤杆菌介导的烟草转化(如前所述)。
转化子的分析
1.在土壤杆菌介导的以pBT6.3-NPT构建物转化的Xanthii烟草中获得8个推测的转化子。在含有浓度为100μg/ml卡那霉素的培养基中对这8个植物进行筛选。
2.利用一个定量的NPTII ELISA试剂盒(5Prime-3Prime)按照制造商的说明对这些植物的NPTII表达进行估计。在组织类型之间(叶和根)以及启动子之间(CaMV 35S启动子和胭脂氨酸合成酶启动子)进行比较。
结果
实验结果示于图中。
1.在含有驱动NPTII表达的CaMV 35S的植物的叶和根中都获得了高水平的NPTII表达。
2.大体上，8株在BBTV启动子控制下表达NPT的植物中NPTII的水平显著比CaMV 35S启动子低。在叶中NPTII表达的水平不超过6ng NPTII/mg蛋白质。根内的水平略微高些，但不超过12ngNPTII/mg蛋白质。这些表达水平与nos启动子类似。
结果的意义
这些实验已经表明BBTV6基因间区的239bp片段在稳定转化的烟草中能够驱动筛选抗性。如所预料的，在稳定转化的植物中(叶和根)NPTII表达的水平很低，但与胭脂氨酸合成酶启动子的表达水平类似。7.在BBTV基因间区中存在的调节元件(i)TATA盒-存在于所有BBTV元件中并定位于转录启始密码子的上游。-保守的九核苷酸序列CTCTa/ta/tAa/tA-负责转录的正确启始(ii)TGA1-a基元-共有序列TGACGTAA-参与转录调节的as-1结合基元(iii)TGA1-b基元-带有共有序列TGACGT的六聚体结合基元(iv)小麦组蛋白H3基因的启动子类型1元件(六聚体基元)—共有序列ACGTAA—在所有BBTV元件中紧接在CR-S/L的3’—六聚体基元结合相关的TAF-1和HBP-1蛋白—与特异性地在细胞周期的S期中的表达相关(Nakayama等，1992，《欧洲生化学会快报》(FEBS Letters)300：167-170)表明启动子活性局限于未分化的活跃分裂的细胞。(v)Adh1-US1—共有序列CCACG—未知的结合因子—存在于所有的BBTV基因间区(以病毒颗粒的或互补的意义)(vi)Adh1-US3—共有序列CGTGG—未知的结合因子—存在于所有的BBTV基因间区(以病毒颗粒的或互补的意义)8.植物组织培养溶液和培养基MSO培养基MS盐肌-肌醇100μg/ml盐酸硫胺素10μg/ml烟酸1μg/ml烟酸吡哆醇1μg/ml蔗糖3％TC琼脂0.7％pH5.7NT固体培养基NT液体培养基TC琼脂0.7％MS104培养基MSO苄基腺嘌呤1μg/ml萘乙酸0.1μg/mlpH5.7NTC培养基NT液体培养基羧苄青霉素500μg/mlMS选择培养基 MS104NTKC培养基NT固体培养基卡那霉素100μg/mlTimentin 200μg/ml卡那霉素100μg/ml羧苄青霉素500μg/mlMS生根培养基含0.6％TC琼脂的MSO卡那霉素100μg/mlTimentin 200μg/mlSQM2EV培养基MS盐肌-肌醇1mg/ml蔗糖3％TC琼脂0.7％2，4-D10μMBAP1.5μMNT液体培养基MS盐蔗糖3％MES 0.5ug/mlB1-肌醇1μg/mlKH2PO4 180μg/ml2，4-D 0.222μg/mlpH5.7WTL 1培养基MS盐CAB A有机无物L-天冬酰胺5μg/mLL-甘氨酸10μg/mlGibco可可水2％NZ胺50μg/ml葡萄糖10mg/ml蔗糖20mg/ml甘露糖醇20mg/ml2，4-D2μg/ml细胞分裂素0.2μg/mlpH5.8PWS溶液-(1升)氯化钙 735mgMES 639.6mg甘露糖醇 109.3gpH5.6酶混合物(E3)2.0％纤维素酶(R-10)0.5％离析酶(R-10)0.5％半纤维素酶1.0％溶果胶酶0.5％BSA用PWS补足体积(pH5.6)TBS溶液-(200ml)Trizma碱 0.73g氯化钠 1.75g氯化钙 0.18g甘露糖醇 9.2gpH9.09CR-M的意义
提供了BBTV元件1-6 CR-M的DNA序列排列。该区被认为是作为一个推测的引物结合位点并推测在BBTV复制中发挥作用。虽然BBTV的CR-M含有两个与在动物和病毒(例如玉米条纹病毒)中基因启动子中所发现的Sp1结合位点相似的直接的GC重复序列，但似乎该区无启动子增强作用。这个假设由BBTV6基因间区的5’缺失分析支持，它证实包括CR-M的272bp区域的消除引起启动子活性的显著增加。另外，对BBTV2基因间区的基础研究已经表明消除CR-M，启动子活性未降低。10总结
我们已经证明BBTV元件1到6的基因间区或DNA序列具有启动子活性以及这种活性从一个基因间区到另一个而改变。利用瞬时和稳定表达系统，我们已经表明BBTV启动子似乎拥有一种可能与BBTV在其天然宿主中复制和蓄积的位置类似的组织特异性表达模式。另外我们已经鉴定出BBTV启动子的至少一个(元件6)之中存在似乎影响报道基因表达的潜在的调节元件。
BBTV是一种感染芭蕉属单子叶植物的病毒。因而可以预计衍生自BBTV的启动子在香蕉和潜在的其它单子叶植物中应该具有最强的活性。用小麦细胞悬液和香蕉胚胎愈伤组织的瞬时研究已经表明，在这些系统中一些BBTV启动子在某种程度上是活跃的。重要的是，我们还发现了在双子叶植物(烟草、黄瓜和密生西葫芦)的未分化组织类型中驱动高水平的瞬时表达。
插图说明图1
在图1(a)、(b)、(c)、(d)和(e)中分别给出了BBTV DNA元件2、3、4、5和6的核苷酸序列以及推导的这些元件主要ORF的氨基酸序列。潜在的TATA盒为粗体并有双下划线；潜在的聚腺苷酸化信号为粗体并有下划线；茎-环结构为斜体并有下划线，茎序列标以箭头；CR-SL有下划线；CR-M为粗体和斜体；而ORF为粗体。图2
BBTV DNA元件2到6的病毒颗粒意义方向的确定。分别用对每个元件病毒颗粒或互补意义链特异的32P标记的寡核苷酸(元件2)或全长RNA转录物(元件3到6)探测两个点。面板(a)中用与图1中所示的元件序列互补的探针同斑点杂交，而面板(b)中用图1中所示的同样序列的探针同斑点杂交。1道：每个元件的全长克隆；2道：健康香蕉的核酸；3道：从纯化的BBTV病毒颗粒中提取的DNA。图3
排列的BBTV DNA元件1到6的茎-环共同区(CR-SL)。在各个元件中的茎-环结构有下划线并且环序列为斜体。星号表示在所有元件之间都保守的核苷酸。在一些序列中包括点来使序列排列最大化。图4
排列的BBTV DNA元件1到6的主要共同区(CR-M)。在15个核苷酸的GC丰富序列下划线。星号表示在所有元件之间都保守的核苷酸。而菱形表示元件2到6之间在覆盖元件1中缺失的前面26个核苷酸中保守的核苷酸。在一些序列中包括点来使序列排列最大化并且不完整的重复序列以斜体表示。图5
所提出的BBTV基因组结构的图式。(i)所有元件的大体结构以及(ii)每个元件的线性表示。图6
元件1基因间区的各种结构。图7
元件2基因间区的各种结构。图8
元件3和4基因间区的各种结构。图9
元件5基因间区的各种结构。图10
元件6基因间区的各种结构。图11
排列的BBTV元件1到6的基因间区核苷酸序列。bbtvpro1是pBT1.1的插入片段；bbtvpro2是pBT2.1的插入片段；bbtvpro3是pBT3.1的插入片段；bbtvpro4是pBT4.1的插入片段；bbtvpro5是pBT5.1的插入片段；而bbtvpro6是pBT6.1的插入片段。在bbtvpro1中注意Adh1 US1存在于位点1004处。关于bbtvpro2，注意TGA-1b存在于位点953和1053处，Adh1 US3存在于位点137处，G-BOX存在于位点225处。关于bbtvpro3，注意Adh1 US1存在于位点1069处。关于bbtvpro4，注意TGA-1b存在于位点182处；Adh1 US1存在于位点1037处；而G-BOX存在于位点45、63、128和148处。关于bbtvpro5，注意TGA-1b存在于位点96处；Adh1 US1存在于位点1012处；而G-BOX存在于位点45和64处。关于bbtvpro6，注意TGA-1a存在于位点1083处；TGA-1b存在于位点44处；Adh1US1存在于位点173处；而G-BOX存在于位点46处。还要注意G-BOX是一个与转录核心序列CACGTG相关的植物启动子基元。图12
pBT1.INT的插入片段的DNA序列(982个碱基对)。注意BBTV元件1的基因间区序列是以小的开放读框为基础。图13
(a)pBT6.1(622个碱基对)；(b)pBT6.2(351个碱基对)；(c)pBT6.3(238个碱基对)和(d)pBT6.4(182个碱基对)的插入片段的DNA序列。注意在pBT6.3中黑体区域是与元件6基因间区的大部分启动子活性相关的序列。在pBT6.4中该区域被消除。图14
BBTV6-NPTII构建物。