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1、10申请公布号CN104042629A43申请公布日20140917CN104042629A21申请号201410240718822申请日2005111762/629,22020041117US200580039450020051117A61K35/30200601A61P21/02200601A61P29/00200601A61P25/02200601A61P25/2820060171申请人神经干公司地址美国马里兰州72发明人M马莎拉KK乔TG黑兹尔垣花修V科利亚索斯阎军PJ赖尔MJ维拉多74专利代理机构北京集佳知识产权代理有限公司11227代理人彭鲲鹏郑斌54发明名称用于治疗神经变性症状的。
2、人类神经细胞的移植57摘要提供了治疗神经变性症状的方法。可以在神经元变性区域和/或远离神经元变性区域移植神经干细胞。方法包括从生成与要替换的神经元相对应的特定类型神经元的区域中分离出神经干细胞。方法包括分离出分泌影响特定类型神经元的生长和/或再生的生长因子的神经干细胞。在本发明中，我们公开了通过移植外部培养和扩增的神经祖细胞来治疗这类病症的方法，该病症包括由于缺乏在神经回路中产生特定神经递质的细胞而出现的数种神经变性病症，上述神经祖细胞在移植到神经组织中时分化成能够以足以制服神经变性相关症状的量和方式结合和制造神经递质的神经元。30优先权数据62分案原申请数据51INTCL权利要求书4页说明书。
3、28页附图9页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书4页说明书28页附图9页10申请公布号CN104042629ACN104042629A1/4页21分离自哺乳动物的至少一个神经干细胞在制备用于治疗痉挛状态、僵硬或肌肉活动过度症状的药物中的用途，其中A将所述神经干细胞体外扩增成扩增种群；B浓缩该扩增种群；和C治疗有效量的所述扩增种群用于引入接受者脊髓的至少一个区域，其中至少20的扩增种群能够在接受者脊髓中生成神经元。2权利要求1的用途，其中所述症状源自外伤性脊髓损伤、缺血性脊髓损伤、外伤性脑损伤、中风、多发性硬化、大脑性麻痹、癫痫、亨廷顿氏舞蹈症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、慢。
4、性局部缺血、遗传性症状、或它们的任意组合。3权利要求1的用途，其中所述神经干细胞分离自选自中枢神经系统、外周神经系统、骨髓、周围血液、脐带血和至少一个胚胎的来源。4权利要求3的用途，其中所述哺乳动物是发育中的哺乳动物。5权利要求4的用途，其中所述发育中的哺乳动物的胎龄为大约65至大约20周。6权利要求4的用途，其中所述神经干细胞分离自人类胎儿脊髓。7权利要求1的用途，其中扩增神经干细胞包括在不存在血清的情况下培养神经干细胞。8权利要求1的用途，其中扩增神经干细胞包括使神经干细胞接触至少一种生长因子。9权利要求8的用途，其中生长因子选自BFGF、EGF、TGF、AFGF和它们的组合。10权利要求。
5、1的用途，其中治疗有效量的扩增种群能够在体内生成至少1000个GABA能神经元。11权利要求1的用途，其中治疗有效量的扩增种群能够在体内生成至少1000个甘氨酸能神经元。12权利要求1的用途，其中至少40的扩增种群能够在脊髓中生成神经元。13权利要求1的用途，其中引入治疗有效量的扩增种群包括将治疗有效量的至少一部分注入接受者脊髓的多个区域。14权利要求1的用途，其中至少30的扩增种群能够在体外分化成神经元。15分离自哺乳动物的至少一个神经干细胞在制备用于治疗慢性疼痛的药物中的用途，其中A将所述神经干细胞体外扩增成扩增种群；B浓缩扩增种群；和C治疗有效量的所述扩增种群用于引入接受者脊髓的至少一个。
6、区域，其中至少20的扩增种群能够在接受者脊髓中生成神经元。16权利要求15的用途，其中慢性疼痛源自外伤性脊髓损伤、缺血性脊髓损伤、外伤性脑损伤、中风、多发性硬化、大脑性麻痹、癫痫、亨廷顿氏舞蹈症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、慢性局部缺血、遗传性症状、或它们的任意组合。17权利要求15的用途，其中所述神经干细胞分离自选自中枢神经系统、外周神经系统、骨髓、周围血液、脐带血、至少一个胚胎和它们的任意组合的来源。18权利要求17的用途，其中哺乳动物是发育中的哺乳动物。权利要求书CN104042629A2/4页319权利要求18的用途，其中发育中的哺乳动物的胎龄为大约65至大约20周。20权利要求18的用途。
7、，其中所述神经干细胞分离自人类胎儿脊髓。21权利要求15的用途，其中扩增神经干细胞包括在不存在血清的情况下培养神经干细胞。22权利要求15的用途，其中扩增神经干细胞包括使神经干细胞接触至少一种生长因子。23权利要求22的用途，其中生长因子选自BFGF、EGF、TGF、AFGF和它们的组合。24权利要求15的用途，其中治疗有效量的扩增种群能够生成至少1000个GABA能神经元。25权利要求15的用途，其中治疗有效量的扩增种群能够生成至少1000个甘氨酸能神经元。26权利要求15的用途，其中至少40的扩增种群能够在脊髓中生成神经元。27权利要求15的用途，其中引入治疗有效量的扩增种群包括将治疗有效。
8、量的至少一部分注入接受者脊髓的多个区域。28权利要求27的用途，其中这些区域包括背角。29权利要求27的用途，其中这些区域包括鞘内空间。30权利要求15的用途，其中至少30的扩增种群能够在体外分化成神经元。31分离自哺乳动物的至少一个神经干细胞在制备用于治疗运动神经元变性的药物中的用途，其中A将所述神经干细胞体外扩增成扩增种群；B浓缩扩增种群；和C治疗有效量的所述扩增种群的至少一个神经干细胞用于引入接受者脊髓的一个区域，其中至少20的扩增种群能够在接受者脊髓中生成神经元。32权利要求31的用途，其中运动神经元变性源自外伤性脊髓损伤、缺血性脊髓损伤、外伤性脑损伤、中风、多发性硬化、大脑性麻痹、癫。
9、痫、亨廷顿氏舞蹈症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、慢性局部缺血、遗传性症状、或它们的任意组合。33权利要求31的用途，其中所述神经干细胞分离自选自中枢神经系统、外周神经系统、骨髓、周围血液、脐带血和至少一个胚胎的来源。34权利要求33的用途，其中哺乳动物是发育中的哺乳动物。35权利要求34的用途，其中发育中的哺乳动物的胎龄为大约65至大约20周。36权利要求34的用途，其中所述神经干细胞分离自人类胎儿脊髓。37权利要求31的用途，其中所述神经干细胞分离自富含至少一种神经元亚型的区域中，其中所述神经元亚型产生能够有效改善运动缺陷的生长因子。38权利要求31的用途，其中扩增种群包括一定量的能够分化成足以。
10、分泌治疗有效量的至少一种生长因子的神经元的神经干细胞。39权利要求31的用途，其中所述神经干细胞分离自富含运动神经元的区域。40权利要求31的用途，其中扩增神经干细胞包括在不存在血清的情况下培养神经干细胞。41权利要求31的用途，其中扩增神经干细胞包括使神经干细胞接触至少一种生长因权利要求书CN104042629A3/4页4子。42权利要求41的用途，其中生长因子选自BFGF、EGF、TGF、AFGF和它们的组合。43权利要求31的用途，其中治疗有效量的扩增种群能够生成至少1000个GABA能神经元。44权利要求31的用途，其中治疗有效量的扩增种群能够生成至少1000个甘氨酸能神经元。45权利。
11、要求31的用途，其中至少40的扩增种群能够在接受者脊髓中生成神经元。46权利要求31的用途，其中引入治疗有效量的扩增种群包括将治疗有效量的至少一部分注入接受者脊髓的多个区域。47权利要求31的用途，其中至少30的扩增种群能够在体外分化成神经元。48分离自哺乳动物的至少一个神经干细胞在制备用于治疗脊髓空洞症的药物中的用途，其中A将所述神经干细胞体外扩增成扩增种群；B浓缩该扩增种群；和C治疗有效量的所述扩增种群用于引入接受者脊髓的脊髓空洞，其中至少20的扩增种群能够在接受者脊髓的脊髓空洞中生成神经元。49权利要求48的用途，其中脊髓空洞症源自外伤性脊髓损伤、缺血性脊髓损伤、外伤性脑损伤、中风、多发。
12、性硬化、大脑性麻痹、癫痫、亨廷顿氏舞蹈症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、慢性局部缺血、遗传性症状、或它们的任意组合。50权利要求48的用途，其中所述神经干细胞分离自选自中枢神经系统、外周神经系统、骨髓、周围血液、脐带血、至少一个胚胎和它们的任意组合的来源。51权利要求50的用途，其中哺乳动物是发育中的哺乳动物。52权利要求51的用途，其中发育中的哺乳动物的胎龄为大约65至大约20周。53权利要求51的用途，其中所述神经干细胞分离自人类胎儿脊髓。54权利要求48的用途，其中所述神经干细胞分离自富含至少一种神经元亚型的区域，其中所述神经元亚型产生能够有效改善脊髓空洞症的生长因子。55权利要求48的用途，。
13、其中所述神经干细胞分离自富含运动神经元的区域。56权利要求48的用途，其中扩增神经干细胞包括在不存在血清的情况下培养神经干细胞。57权利要求48的用途，其中扩增神经干细胞包括使神经干细胞接触至少一种生长因子。58权利要求57的用途，其中生长因子选自BFGF、EGF、TGF、AFGF和它们的组合。59权利要求48的用途，其中扩增种群包括一定量的能够分化成足以分泌治疗有效量的至少一种生长因子的神经元的神经干细胞。60权利要求48的用途，其中治疗有效量的扩增种群能够生成至少1000个神经元。61权利要求48的用途，其中至少40的扩增种群能够在脊髓中生成神经元。62权利要求48的用途，其中引入治疗有效。
14、量的扩增种群包括将治疗有效量的至少一部分注入接受者脊髓的多个区域。63权利要求48的用途，其中至少30的扩增种群能够在体外分化成神经元。权利要求书CN104042629A4/4页564权利要求48的用途，其中扩增种群的至少100,000个神经干细胞用于引入接受者脊髓的脊髓空洞中。权利要求书CN104042629A1/28页6用于治疗神经变性症状的人类神经细胞的移植0001本申请是申请号为2005800394500、发明名称为“用于治疗神经变性症状的人类神经细胞的移植”的申请的分案申请，该母案申请是2005年11月17日提交的PCT申请PCT/US2005/041631进入中国国家阶段的申请。技。
15、术领域0002本发明所公开的方法涉及通过特别有益于这类治疗方法的细胞的移植治疗病症的方法。特别地，所公开的方法提供了用神经干细胞NSCS治疗神经变性病症的方法。背景技术0003神经变性病症以伴有由疾病、遗传性症状或创伤例如外伤性或缺血性脊髓或脑损伤引起的神经元退化的症状为特征。0004控制肢干骨骼肌收缩的脊髓回路包括激感运动神经元和抑制性GABA能即生成GABA的和甘氨酸能即生成甘氨酸的中间神经元。运动神经元是源自脊髓灰质前角的神经。运动神经元的轴突作为刺激肌肉纤维的传出运动纤维自脊髓节段中出现。运动神经元进行的搏动刺激肌肉纤维收缩。GABA，氨基丁酸，是哺乳动物神经系统的天然生成的代谢物，其。
16、充当神经递质以抑制或压制电势的神经传导。GABA能中间神经元的缺失导致运动神经元引起的肌肉收缩的抑制性调节异常DYSREGULATION。在没有抑制性中间神经元对兴奋性神经元的控制的情况下，发生兴奋性神经元的烧毁，这导致肢干肌肉的痉挛性不受控收缩或不受控僵硬。运动神经元的缺失导致驰缓性截瘫，在该疾病中，患者不能收缩肌肉并因此不能移动。0005GABA能中间神经元在脊髓中受损的一个例子包括与胸降或胸腹主动脉的暂时阻断相关的并发症。这种阻断是血管手术中修复胸腹主动脉的动脉瘤所必须的步骤。在阻断持续期间，部分脊髓不能获得血液循环并可能变成缺血性的。根据缺血间隔的持续时间，随后的神经变性机能障碍可能神。
17、经变性地表现为下肢轻瘫或完全形成的痉挛性或驰缓性截瘫。0006尽管只部分了解引起缺血诱发性神经变性的机制且可能涉及兴奋性氨基酸、前列腺素和/或氧自由基的过度释放/活性，受暂时缺血性损害影响的脊髓神经元种群是确定的。例如，从具有完全形成的痉挛性截瘫的动物中取出的脊髓的组织病理学分析表现出小抑制性神经元的选择性损失；但是，神经运动元仍然存在于之前缺血的脊柱节段中。已经描述了具有脊柱缺血性损伤的人类对象中类似的脊柱神经元病理学。0007相反，在患有驰缓性截瘫的动物中，看出PANNECROTIC神经变性变化，这影响了小的抑制性和兴奋性中间神经元以及腹侧运动神经元。在脊柱局部缺血后的神经元变性期间，如同。
18、在病灶性或全面脑缺血中那样，也观察到局部小神经胶质的损伤依赖型活化和炎性变化，例如被巨噬细胞浸润。根据损伤程度，炎性变化通常在缺血性损伤后两天至七天达到顶峰，然后在两周至四周的后缺血性期间表现出炎性成分的逐渐丧失。0008在过去二三十年，已经作出相当大的努力以在动物模型中评估各种材料的脊柱移说明书CN104042629A2/28页7植的治疗潜力。因此，已经在数种脊柱损伤包括机械外伤性损伤、化学损伤的脊髓的模型或具有进行性运动神经元变性的遗传控制动物ALS转基因小鼠或大鼠中使用直接脊柱基因疗法改善神经变性机能障碍。0009一般而言，研究证实神经元表型在由胎儿组织，而不是由已经在体外扩增的神经前体。
19、生成的移植物中的长期存活和保存。实际上，体外扩增并移植到机械或化学损伤脊髓中的神经前体的仅仅有限的神经元分化和成熟已经得到证实。细胞优先分化成非神经元细胞类型。尽管这种优先的非神经元分化的机制没有被完全了解，但假设可能涉及促炎细胞因子例如TNF、TGF在先前损伤位置的局部释放。0010神经变性代表细胞疗法的特别具有挑战性的生物环境，且既定神经变性疾病中存在的细胞死亡信号ROTHSTEIN等人，1992；HOWLAND等人，2002；TURNER等人，2005可能与移植物存活不相容。此外，成人脊髓被视为缺乏允许再生的细胞和/或信号PARK等人，2002，且大部分NSC移植研究已经表现出差的或有限。
20、的分化CAO等人，2002；YAN等人，2003；YAN等人，2004。0011细胞疗法中的主要问题之一是移植的细胞的低细胞存活低于5。迄今所有移植的细胞在体内注射后不久就产生显著的细胞死亡。因此，为了输送有效剂量的细胞，最终剂量必须以至少20倍注射。这又要求大得多的细胞制造规模，这引起更进一步的规章和经济障碍。此外，这类细胞在体内的存活率不能保持。不能证明有效剂量的细胞疗法的可再现施用就不能被政府和其它管理机构例如食品和药品管理局批准使用。0012当治疗神经变性疾病和在大面积的身体、组织或器官例如整个神经系统而非单个局部区域上散布的症状时，产生更多挑战。例如，在ALS中，神经变性涉及沿整个脊。
21、髓的运动神经元以及运动皮层中的那些神经元的缓慢死亡。同样，在多数溶酶体病中，神经元破坏牵涉脑和脊髓的多数区域。阿尔茨海默氏症牵涉大脑的大部分。即使在更局部的神经变性疾病，例如帕金森症和亨廷顿氏舞蹈病中，受影响的纹状体面积也相当大，比手术可以到达的移植区域大得多。因此，神经变性疾病的细胞疗法预计需要更宽的移植程序。0013因此，需要改进的治疗神经变性症状的方法。还需要改进的培养和移植动物神经干细胞和人类神经祖细胞的方法，这类细胞一经移植，就可以克服之前发现的所有限制并提供功能益处。因此，这种治疗神经变性症状的方法在体内产生强劲的神经元分化，能够实现在各种变性条件下的长期神经元存活和在缺乏发育信号。
22、DEVELOPMENTALCUES的成人组织中成熟成与治疗相关的神经元亚种群，并提供比细胞本身的位置宽的治疗范围。发明内容0014所公开的方法包括治疗神经变性症状的方法。特别地，所公开的方法包括将已经体外扩增的NSCS、神经祖细胞或神经前体移植到需要它们的对象体内，从而使这些细胞可以改善神经变性症状。在一个实施方案中，所公开的方法包括确认、分离、扩增并制备要用于治疗神经变性症状的供体细胞。可以选择要移植的供体细胞以对应于对该症状、其征候和/或其效应有作用的单元或其欠缺。0015所公开的方法的细胞包括在移植时产生足以结合到神经元下部结构中以改善病状或症状的量的神经元的细胞。在一个实施方案中，所公。
23、开的方法包括通过移植从哺乳动物的中枢神经系统中分离出的并已经在体外扩增的多能神经祖细胞或神经干细胞来治疗说明书CN104042629A3/28页8神经变性疾病或症状。例如，扩增的神经干细胞的移植可用于在患有各种形式脊髓病伴有痉挛状态、僵硬、抽搐、麻痹或任何其它肌肉活动过度的征候的对象中改进行走功能。0016治疗方法可以包括经由移植向受损神经区域供应适当数量的NSCS，其可以分化成足量的GABA能神经元和/或甘氨酸能神经元以减弱有缺陷的神经回路，包括活动过度的神经回路。0017在一个实施方案中，所公开的方法包括在运动神经元疾病中恢复运动功能。可以向至少一个神经变性区域，例如神经变性脊髓供应能够分。
24、化成运动神经元的适当数量或治疗有效量的NSCS或神经祖细胞以恢复运动功能。NSCS通过取代变性的神经肌肉接点来发挥其治疗效果。0018协同地或替代性地，NSCS通过表达和释放出保护变性组织的神经元以使它们更多地存活更长时间的营养分子来发挥其治疗效果。可以促使NSC源神经元投射到脊神经前根中并刺激肌肉，其中NSCS参与患有变性运动神经元疾病的患者体内与宿主运动神经元的广泛相互联系。因此，在一个实施方案中，来自人类胎儿脊髓的NSCS可以移植到腰索中，在此这些细胞可以分化成与宿主神经元形成突触性接触并表达和释放出运动神经元生长因子的神经元。0019在一个实施方案中，所公开的方法包括提供神经干细胞或神。
25、经祖细胞，它们与宿主组织结合并为宿主神经元提供一种或多种生长因子以保护它们免受组织中存在的变性影响。该方法包括在脊髓区域中引入足量的NSCS或神经祖细胞以使NSCS分泌有效量的至少一种生长因子。0020在一个实施方案中，所公开的方法包括提供在神经变性症状中进行细胞替换的干细胞的临床前评测中使用动物模型的方法。0021在一个实施方案中，所公开的方法包括提高移植的NSCS分化成神经元的效力。该方法包括使高度富集的NSCS或神经祖细胞以其未分化状态扩增，从而在移植时，移植物中足量例如20的细胞选定神经元方向FATE。0022在一个实施方案中，所公开的方法包括在不提高要移植的NSCS或神经祖细胞数量的。
26、情况下提高分化细胞的数量。在一个实施方案中，该方法包括以下述方式制备扩增的供体种群一经移植，NSCS或神经祖细胞就高达十倍地在体内分裂且不形成肿瘤，由此有效地提高输送细胞的总数。0023所公开的方法的细胞可以分离自或获自非人类的哺乳动物的胎儿、新生儿、青少年、成人或死后组织。所公开的方法的细胞可以分离自或获自中枢神经系统、血液或分化成神经元的干细胞的任何其它合适来源。细胞也可以获自胚胎干细胞。例如，在一个实施方案中，细胞包括从发育中的胎儿脊髓中分离出的神经上皮细胞。在某些例子中，神经前体细胞可以是从中枢神经系统的特定子区域中分离出的神经祖细胞。0024根据所公开的方法，神经干细胞在培养时扩增。。
27、在一个实施方案中，神经前体细胞可以是能够在培养时扩增并能够在分化时生成神经元和神经胶质的多能NSCS。0025在移植时，细胞可以是未分化的、在体外预分化或完全分化的。在一个实施方案中，诱导细胞分化成神经谱系LINEAGE。所公开的方法的细胞可以在促炎细胞因子和受损组织中存在的其它环境因子的存在下就地进行神经元分化。0026使用本方法，可以通过将细胞移植或引入适合改善疾病、失调或症状的区域来处说明书CN104042629A4/28页9理神经回路。通常，移植到支持移植细胞存活的神经组织或非神经组织中。在所公开的方法中使用的NSC移植物在神经变性环境中良好地存活，在此NSCS可以以延缓神经变性症状或。
28、疾病的发作和推进的形式发挥有力的临床作用。0027在一些情况下，可以移植到身体的边远REMOTE区域中，且细胞可以迁移到其预计靶点。相应地，所公开的方法也可以包括人类NSCS的部分移植。本文所用的术语“部分移植”是指在部分神经变性区域中移植扩增的NSCS。例如，将人类NSCS部分移植到脊髓的腰段中。NSCS对变性运动神经元的至少部分作用包括将神经营养素和营养细胞因子经由典型细胞机制输送到变性宿主运动神经元中。为此，使用所公开的方法部分移植到脊髓腰段中的NSCS在患有运动神经疾病的转基因动物模型中表现为存活、产生大量神经元分化、促进运动神经元存活并在移植临近区域以及远离移植区域的区域中发挥作用。。
29、0028相应地，所公开的方法提供了治疗痉挛状态、僵硬或肌肉活动过度症状的方法。该方法包括从哺乳动物中分离出至少一个神经干细胞并使神经干细胞体外扩增成扩增种群。该方法还包括使扩增种群浓缩并将治疗有效量的扩增种群引入接受者脊髓的至少一个区域。至少20的扩增种群能够在接受者脊髓中生成神经元。0029在一个实施方案中，症状源自外伤性脊髓损伤、缺血性脊髓损伤、外伤性脑损伤、中风、多发性硬化、大脑性麻痹、癫痫、亨廷顿氏舞蹈症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、慢性局部缺血、遗传性症状、或它们的任意组合。0030在一个实施方案中，从选自中枢神经系统、外周神经系统、骨髓、周围血液和脐带血中分离出神经干细胞。0031在一。
30、个实施方案中，哺乳动物是发育中的非人类的哺乳动物DEVELOPINGMAMMAL。0032在一个实施方案中，发育中的非人类的哺乳动物的胎龄为大约65至大约20周。0033在一个实施方案中，从人类胎儿脊髓中分离出神经干细胞。0034在一个实施方案中，扩增神经干细胞包括在不存在血清的情况下培养神经干细胞。0035在一个实施方案中，扩增神经干细胞包括使神经干细胞接触至少一种生长因子。0036在一个实施方案中，生长因子选自BFGF、EGF、TGF、AFGF和它们的组合。0037在一个实施方案中，治疗有效量的扩增种群能够在体内生成至少1000个GABA能神经元。0038在一个实施方案中，治疗有效量的扩增。
31、种群能够在体内生成至少1000个甘氨酸能神经元。0039在一个实施方案中，至少40的扩增种群能够在脊髓中生成神经元。0040在一个实施方案中，引入治疗有效量的扩增种群包括将治疗有效量的至少一部分注入接受者脊髓的多个区域。0041在一个实施方案中，至少30的扩增种群能够在体外分化成神经元。0042在另一实施方案中，提供神经干细胞。该神经干细胞能够治疗痉挛状态、僵硬和肌肉活动过度症状。该神经干细胞分离自哺乳动物中并在体外扩增成扩增种群。将包括该神经干细胞的扩增种群浓缩，并将治疗有效量的扩增种群引入接受者脊髓的至少一个区域。至少20的扩增种群能够在接受者脊髓中生成神经元。说明书CN104042629。
32、A5/28页100043在所公开的方法的另一实施方案中，提供了治疗慢性疼痛的方法。该方法包括从哺乳动物中分离出至少一个神经干细胞并将神经干细胞体外扩增成扩增种群。该方法还包括使扩增种群浓缩并将治疗有效量的扩增种群引入接受者脊髓的至少一个区域。至少20的扩增种群能够在接受者脊髓中生成神经元。0044在一个实施方案中，慢性疼痛源自外伤性脊髓损伤、缺血性脊髓损伤、外伤性脑损伤、中风、多发性硬化、大脑性麻痹、癫痫、亨廷顿氏舞蹈症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、慢性局部缺血、遗传性症状、或它们的任意组合。0045在一个实施方案中，治疗有效量的扩增种群能够生成至少1000个GABA能神经元。0046在一个实施方。
33、案中，治疗有效量的扩增种群能够生成至少1000个甘氨酸能神经元。0047在一个实施方案中，至少40的扩增种群能够在脊髓中生成神经元。0048在一个实施方案中，引入治疗有效量的扩增种群包括将治疗有效量的至少一部分注入接受者脊髓的多个区域。0049在一个实施方案中，这些区域包括背角。0050在一个实施方案中，这些区域包括鞘内空间。0051在进一步实施方案中，提供神经干细胞。该神经干细胞能够治疗慢性疼痛。该神经干细胞分离自哺乳动物中并在体外扩增成扩增种群。将包括该神经干细胞的扩增种群浓缩，并将治疗有效量的扩增种群引入接受者脊髓的至少一个区域。至少20的扩增种群能够在接受者脊髓中生成神经元。0052在。
34、所公开的方法的另一实施方案中，提供了治疗运动神经元变性的方法。该方法包括从哺乳动物中分离出至少一个神经干细胞并将神经干细胞体外扩增成扩增种群。该方法还包括使扩增种群浓缩并将治疗有效量的扩增种群引入接受者脊髓的至少一个区域。至少20的扩增种群能够在接受者脊髓中生成神经元。0053在一个实施方案中，运动神经元变性源自外伤性脊髓损伤、缺血性脊髓损伤、外伤性脑损伤、中风、多发性硬化、大脑性麻痹、癫痫、亨廷顿氏舞蹈症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、慢性局部缺血、遗传性症状、或它们的任意组合。0054在一个实施方案中，该方法包括从富含至少一种神经元亚型的区域中分离出神经干细胞，其中该神经元亚型产生能够有效改善运。
35、动缺陷的生长因子。0055在一个实施方案中，扩增种群包括一定量的能够分化成足以分泌治疗有效量的至少一种生长因子的神经元的神经干细胞。0056在一个实施方案中，该方法包括从富含运动神经元的区域中分离出神经干细胞。0057在进一步实施方案中，提供能够治疗脊髓空洞症的神经干细胞。该神经干细胞分离自哺乳动物并在体外扩增成扩增种群。将包括该神经干细胞的扩增种群浓缩，并将治疗有效量的扩增种群引入接受者脊髓的至少一个区域。至少20的扩增种群能够在接受者脊髓中生成神经元。0058在所公开的方法的另一实施方案中，提供了治疗脊髓空洞症的方法。该方法包括从哺乳动物中分离出至少一个神经干细胞并使神经干细胞在体外扩增成。
36、扩增种群。该方法还包括使扩增种群浓缩并将治疗有效量的扩增种群引入接受者脊髓的脊髓空洞。至少20的扩增种群能够在接受者脊髓的脊髓空洞中生成神经元。说明书CN104042629A106/28页110059在一个实施方案中，脊髓空洞症源自外伤性脊髓损伤、缺血性脊髓损伤、外伤性脑损伤、中风、多发性硬化、大脑性麻痹、癫痫、亨廷顿氏舞蹈症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、慢性局部缺血、遗传性症状、或它们的任意组合。0060在一个实施方案中，该方法包括从富含至少一种神经元亚型的区域中分离出神经干细胞，其中该神经元亚型产生能够有效改善脊髓空洞症的生长因子。0061在一个实施方案中，包括从富含运动神经元的区域中分离出神。
37、经干细胞。0062在一个实施方案中，扩增种群包括一定量的能够分化成足以分泌治疗有效量的至少一种生长因子的神经元的神经干细胞。0063在一个实施方案中，治疗有效量的扩增种群能够生成至少1,000个神经元。0064在一个实施方案中，将扩增种群的至少100,000个神经干细胞引入接受者脊髓的脊髓空洞中。0065在再一实施方案中，提供能够治疗脊髓空洞症的神经干细胞。该神经干细胞分离自哺乳动物并在体外扩增成扩增种群。将包括该干细胞的扩增种群浓缩，并将治疗有效量的扩增种群引入接受者脊髓的脊髓空洞。至少20的扩增种群能够在接受者脊髓的脊髓空洞中生成神经元。0066在所公开的方法的再一实施方案中，提供了将至少。
38、一个神经干细胞扩增成神经干细胞的扩增种群的方法。每次神经干细胞扩增在不分化的情况下超过30次细胞倍增。该方法包括从中枢神经系统组织中离解神经干细胞并向培养皿提供至少一种细胞外蛋白质。细胞外蛋白质包括至少大约10微克/毫升的聚D赖氨酸和大约1毫克/毫升纤连蛋白。该方法还包括在培养皿中在不存在血清的情况下培养离解的神经干细胞并在培养皿中添加至少一种生长因子。生长因子选自BFGF、EGF、TGF、AFGF和它们的组合。该方法进一步包括使培养的细胞在汇合之前传代PASSAGING。0067在一个实施方案中，扩增的神经干细胞能够分化成神经元。0068在一个实施方案中，将神经干细胞扩增包括将纤连蛋白作为可。
39、溶因子添加到培养基中。0069在一个实施方案中，离解细胞并使细胞传代包括酶促离解。0070在一个实施方案中，酶促离解包括用胰蛋白酶处理细胞。0071在一个实施方案中，将治疗有效量的扩增种群引入接受者神经系统的至少一个区域中以治疗神经变性症状。0072因此，所公开的方法优于现有药理学方案的优点是提供促进移植的NSCS分泌营养分子的能力的方法，这些营养分子可以在最佳生物利用率的条件下输送到变性运动神经元中。0073所公开的方法的再一优点包括提供实现NSCS种群的更高比例的神经元分化的方法。0074所公开的方法的再一优点包括实现来自NSCS的部分移植的临床作用。0075在本发明和附图的下列详述中描述。
40、并容易看出所公开的方法的其它特征和优点。附图说明0076图1人类脊柱干细胞的扩增。从78周大的死后胎儿脊髓组织中分离出人类脊说明书CN104042629A117/28页12柱祖细胞AKANSC系，并连续传代大约130天的纯培养期。在每次传代时，将收取时回收的细胞数除以平板接种时的初始细胞数以获得细胞数的增加倍数。将每次传代时增加的倍数相乘，由此获得累积增加倍数左Y轴。将细胞数量的增加倍数除以每一培养期X轴，由此计算每次传代时的细胞倍增次数右Y轴。将该方法重复三次连续扩增1、2和3。0077图2扩增的人类脊柱干细胞的形态。A固定的未染色扩增培养物的相衬图，20X物镜，B抗巢蛋白ANTINESTI。
41、N抗体染色。0078图3获自扩增的人类脊柱干细胞的分化培养物的表征。使第1516代的扩增细胞在培养时分化大约14天，固定并用各种神经元特异性抗体染色。ATAU和MAP2；B3型微管蛋白；CGABA；D乙酰胆碱转移酶。0079图4人类中脑干细胞的扩增。从78周大的死后胎儿中脑组织中分离出人类中脑祖细胞AKANSC系并连续传代大约170天的纯培养期。在每次传代时，将收取时回收的细胞数除以平板接种时的初始细胞数以获得细胞数的增加倍数。将每次传代时增加的倍数相乘，由此获得累积增加倍数Y轴。0080图5扩增的人类中脑干细胞的多巴胺吸收UPTAKE活性。活细胞中的多巴胺转运体活性DAT由中脑干细胞系及其一。
42、种无性亚系其在检定时分化22或44天决定。在存在或不存在DAT抑制剂诺米芬辛10M的情况下，用放射性同位素标记的多巴胺培养细胞。洗涤细胞以去除未并入的多巴胺并溶解在液态闪烁体SCINTILLATIONCOCKTAIL中。然后使用闪烁计数器测定总细胞放射性DPM。0081图6外因对人类中脑干细胞系的神经元分化和多巴胺能分化的影响。将来自两个人类中脑干细胞系527RMB和796RMB的冷藏神经干细胞解冻并以40,000个细胞/孔的密度在存在BFGF的4孔小室载玻片中平板接种，使其增殖6天。随后，取出细胞并使细胞再分化8天。细胞根据与塞尔托利细胞条件培养基SCCM，在N2中稀释11接触的时机和持续时。
43、间分成四组。一组在增殖和分化过程中接触SCCM条件1；第二组仅在增殖过程中接触条件2；第三组仅在分化过程中接触条件3；第四组不接触SCCM对照物，CONT。每隔一天改变培养基，并在增殖阶段每天添加促细胞分裂剂。每种条件维持四个孔以允许对多个标记物进行染色。在分化时，将细胞使用4低聚甲醛固定，并使用抗MAP2AB图6A和酪氨酸羟化酶图6B的抗体以及GFAP和GALC免疫染色。使用40X物镜计数免疫染色细胞，且每个孔计数至少三个视场。在分析保持在任何条件下的细胞时都几乎或完全没有检测到GFAP或GALC，因此从分析中排除这些抗原。0082图7人类脊柱干细胞移植引起的大鼠痉挛状态/僵硬和运动缺陷的降。
44、低。通过腰脊髓的缺血性损害制造痉挛大鼠。在一组BLACKCIRCLE中，用培养时扩增的人脊柱干细胞16代移植大鼠N9，而另一对照组WHITECIRCLE，N7仅接受没有细胞的培养基。在研究持续期间8周，每天以1毫克/千克向两组施用免疫抑制剂FK506。每周一次用BBB评分法评估各个动物的运动协调。0083图8人类脊柱干细胞移植引起的大鼠痉挛状态/僵硬和运动缺陷的降低。通过腰脊髓的缺血性损害制造痉挛大鼠。在一组BLACKCIRCLE和BLACKSQUIRE中，用培养时扩增的人脊柱干细胞16代移植大鼠N13，而另一对照组LLEDTRIANGLE，N6仅接受没有细胞的培养基。在研究持续期间12周，每。
45、天以3毫克/千克向两组施用免疫说明书CN104042629A128/28页13抑制剂FK506。每周一次用BBB评分法评估各个动物的运动协调。0084图9在使用活细胞L，红和死细胞对照物，C移植物蓝的情况下，用临床和病理学测量的级数AB以及终点CE分析表示的人类NSC治疗对G93ASOD1大鼠运动神经元疾病严重性的作用。0085AB图A是显示在整个观察过程中实验和对照动物之间的显著区别的KAPLANMEIER图P00003。图B显示了两组之间P分别000168和000125肌肉衰弱的两个主要测量标准BBB和斜面分数的区别。0086CE实验和对照大鼠中的存活C、疾病发作时间TIMETODISEA。
46、SEONSETD和运动神经元数E。图C显示了两组之间P00005显著的11天寿命差异。图D显示了两组之间P00001疾病发作时间显著的7天差异。图E显示了活和死NSC组P001之间腰部隆突中3,212个细胞的差异。E底部的插页显示了128天大的代表性实验上和对照下大鼠之间运动神经元存活的差异；箭头代表侧向运动神经元组。SIZEBARS150微米。具体实施方式0087所公开的方法涉及治疗神经变性症状。此外，所公开的方法包括移植到有需要的对象中的神经干细胞的制备方法。制备移植用的细胞可以包括在体外将特定细胞种群扩增至足以作为神经变性症状的治疗方法进行商业应用的程度。在一个实施方案中，变性或受损神经。
47、区域的治疗方法包括向该区域供应有效数量的足以改善神经变性症状的神经干细胞。0088本文所用的神经变性症状可以包括伴有神经元的损伤或退化的任何疾病或病症或征候或其病因或影响。神经变性症状可以包括，但不限于，亚历山大病、ALPERSDISEASE、阿尔茨海默氏症、肌萎缩侧索硬化症、共济失调毛细血管扩张、脑白质海绵状变性、科凯恩综合征、皮质基底节变性、克雅氏病，亨廷顿氏舞蹈病、KENNEDYSDISEASE、克拉伯病、路易体痴呆、马查多约瑟夫病、多发性硬化、帕金森氏病、佩梅氏病、NIEMANNPICKSDISEASE、原发性侧索硬化、REFSUMSDISEASE、山德霍夫氏病，SCHILDERSDI。
48、SEASE、STEELERICHARDSONOLSZEWSKIDISEASE、脊髓痨与受损神经元有关的任何其它症状。其它神经变性症状可以包括或由外伤性脊髓损伤、缺血性脊髓损伤、中风、外伤性脑损伤和遗传性症状引起。0089所公开的方法包括使用NSCS改善神经变性症状。本文所用的术语“NSCS”也可以指神经或神经元祖蛋白，或神经上皮前体。可以根据它们分化成三种主要CNS细胞类型神经元、星形细胞和少突胶质细胞的能力在功能上定义NSCS。0090在一个实施方案中，NSCS是多能的以使各个细胞具有分化成神经元、星形细胞或少突胶质细胞的能力。在一个实施方案中，NSCS是双能的以使各个细胞具有分化成三种CN。
49、S细胞类型中的两种的能力。在一个实施方案中，NSCS包括在体外生成神经元和星形细胞的至少双能细胞并包括在体内生成神经元的至少单能细胞。0091生长条件可以影响细胞向一种或另一种细胞类型分化的方向，这意味着细胞没有被限定为单一谱系。在有利于神经元分化的培养条件中，细胞，特别是来自人类CNS的细胞大部分对于神经元和星形细胞是双能的，且极少分化成少突胶质细胞。因此，所公开的方法说明书CN104042629A139/28页14的分化细胞培养物可以产生神经元和星形细胞。在一个实施方案中，神经元与星形细胞的比率可以达到5050比率。0092所公开的方法包括获得位于哺乳动物CNS区域例如神经上皮中的NSCS。其它可以分离出NSCS的CNS区域包括CNS的脑心室和SUBVENTRICULAR区域和包括有丝分裂前体以及后有丝分裂神经元的其它CNS区域。在一个实施方案中，所公开的方法可以使用位于发育中的哺乳动物CNS区域中的NSCS。0093在一个实施方案中，NSCS获自对所需神经元种群天然为神经原性的区域。所需细胞种群可以包括特定神经元表型的细胞，其可以取代或增补在神经病症状中缺失或失活的这类表型。0094通过从CNS的不同区域并跨越胎儿发育期间的不同胎龄分离出NSCS，可以获得各种不同的。