埃坡霉素口服药用剂型 相关申请的交叉参考
本申请要求2001年1月25日申请的临时申请序号60/264,228和2001年5月11日申请的临时申请序号60/290,019的优先权，所述申请通过引用结合到本文中。
发明领域
本发明涉及以提高生物利用度的方式将埃坡霉素(epothione)口服给予患者的方法。本发明还涉及在本发明方法中使用的药用组合物、药用剂型和药盒。本发明特别涉及埃坡霉素固体口服剂型。
发明背景
埃坡霉素为可用于药物领域的16元环大环内酯化合物。例如，埃坡霉素A和B是天然化合物，可从某些微生物分离获得；这两种化合物的结构如下：
埃坡霉素A R＝H
埃坡霉素B R＝Me自从埃坡霉素引入药学领域以来，许多研究小组一直在设计、合成和测试天然埃坡霉素的类似物，试图获得有用的药物。(参见例如D.Schinzer等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，1997，36，No.3,523-524；K.C.Nicolaou等，J.Amer.Chem.Soc.，1997，119，7974-7991；K.C.Nicaloau等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，1996，35，No.20，2399-2401；A.Balog等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，1996，35，No.23/24，28012803)。
已知埃坡霉素的微管稳定作用类似于Taxol，因此对快速增殖的细胞具有细胞毒性作用，例如对癌症和其它快速增殖性细胞疾病具有细胞毒性作用(参见Angew.Chem.Iht.Ed.Engl.，Vol.35，No.13/14，1996和D.M.Bollag，Exp.Opin.Invest.Drugs，6(7)：867-873，1997)。
但是在将埃坡霉素用于治疗患者疾病之前，必须将其配制成可给予患者的药用组合物；例如配制成口服剂型、粘膜用剂型(例如鼻、舌下、阴道、口腔颊膜或直肠)、胃肠外剂型(例如皮下、静脉内、快速大剂量注射、肌肉或动脉内)或透皮给药剂型。特别优选口服制剂，因为口服制剂比其它制剂更方便，更容易使用。此外，口服给药途径避免了胃肠外给药的疼痛和不适。因此，患者优选口服制剂，使得患者按服药方案治疗的顺从性更好。
然而，口服制剂发挥作用需要活性药物能够吸收。口服药物的生物利用度受各种因素的影响，包括例如药物在整个胃肠道中吸收、药物在胃肠道中的稳定性和首过效应。因此，有效口服给予活性药物要求活性药物在胃和肠腔中具有足够稳定性，以使能够通过肠道壁。然而，许多药物往往在肠道中迅速降解或在肠道中的吸收差，导致口服不是用药的有效方法。
口服应用的药用组合物通常为固体剂型(例如片剂)或液体制剂(例如溶液剂、混悬剂或酏剂)。但是，固体剂型对活性药物的药学应用具有一些限制，因为部分患者生理性或心理性难以吞服固体剂型。如果有液体剂型，这些患者会因为服用它们能够饮用的口服液体制剂或者例如经鼻胃管使用而更容易应用需要剂量的活性成分。因此，需要液体口服制剂。
液体口服药用组合物需要合适地溶剂或载体系统溶解或分散活性成分，使得能够将药用组合物给予患者。溶剂系统必须与活性药物匹配，而且对患者没有毒性。一般来说，用于液体口服制剂的溶剂为含水溶剂。
除了常见障碍之外，某些埃坡霉素制剂的难题在于，某些埃坡霉素对酸不稳定和/或难溶于含水介质，而含水介质为口服溶液剂首选介质。然而，本发明克服了上述难题，提供口服应用埃坡霉素的方法和药用制剂，其中埃坡霉素能够充分吸收，产生药理作用。
发明概述
本发明包括口服给予哺乳动物埃坡霉素的方法，同时降低或避免胃肠道系统、尤其是胃中胃液对埃坡霉素的降解、分解或失活。在一个实施方案中，本发明方法包括给予在药学上可接受的酸中和缓冲液中的埃坡霉素或者用药学上可接受的酸中和缓冲液给予埃坡霉素。在一个优选实施方案中，所述给药方法包括应用两种溶液，一种溶液为单独的活性埃坡霉素或在药学上可接受的载体中的埃坡霉素，另一种溶液为药学上可接受的中和缓冲液。
因此，本发明包括固体或预制溶液形式的埃坡霉素药用组合物，所述固体组合物适合配制或复制(冻干时)成药学上可接受的溶液。本发明还包括固体或预制成溶液、含药学上可接受的中和缓冲剂的药用组合物，所述固体组合物适合配制或复制(冻干时)成药学上可接受的溶液。
在一个更具体的实施方案中，本发明涉及提高口服给予的埃坡霉素的生物利用度的方法。该方法包括口服给予一种或多种下式埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、包合物或前体药物：
或
其中
G选自烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环基、
W为O或NR16；
X为O；S；CHR17；或者H、R18；
Y选自O；H、H；H、OR22；OR23、OR23；NOR24；H、NOR25；H、HNR26R27；NHNR28R29；H、NHNR30R31或CHR32，其中OR23、OR23可以为环状酮缩醇；
B1和B2选自H、OR33、OCOR34、OCONR35R36、NR37R38或NR39CONR40R41；
D选自NR42R43或杂环基；
R1、R2、R3、R4和R5选自H、低级烷基；
R8、R9、R10和R11选自H、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、环烷基、杂环基或取代的杂环基；
R17、R18、R22和R23选自H、烷基和取代的烷基；
R24、R25、R26、R28、R30、R32、R33、R34、R35、R36、R37、R39、R40、R41、R42、R51、R52、R53和R61选自H、烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基；
R12、R16、R27、R29、R31、R38和R43选自H、烷基、取代的烷基、取代的芳基、环烷基、杂环基、R51C＝O、R52OC＝O、R53SO2、羟基和O-烷基或O-取代的烷基；
并且口服给予一种或多种药学上可接受的酸中和缓冲剂。
可以在口服给予一种或多种目的埃坡霉素的同时、之前、之后、或给予埃坡霉素之前或之后均给予药学上可接受的酸中和缓冲剂。给予活性埃坡霉素之前给予时，药学上可接受的酸中和缓冲剂在给予埃坡霉素之前约1小时内给予。给予活性埃坡霉素之后给予时，药学上可接受的酸中和缓冲剂在给予埃坡霉素之后约1小时内给予。
药学上可接受的酸中和缓冲剂溶液可以为液体制剂而且可以在临用前配制，该溶液包含一种或多种在一定时间内能够中和酸性溶液、尤其是胃酸的组分。缓冲组分包括但不限于药学上可接受的弱酸、弱碱或它们的混合物。缓冲组分优选为磷酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸、柠檬酸、醋酸、抗坏血酸、天冬氨酸、盐酸、硫酸、谷氨酸以及它们的盐等水溶性物质。
药学上可接受的酸中和缓冲剂的用量足以中和胃中的胃液，而且提高胃肠道系统的埃坡霉素吸收量。药学上可接受的酸中和缓冲剂可以pH约5-9的水溶液使用。可以给予为无水磷酸氢二钠、柠檬酸钠二水合物和无水柠檬酸的水溶液的药学上可接受的酸中和缓冲剂。
本发明提高口服给予的埃坡霉素生物利用度，其明显高于不用中和缓冲剂的埃坡霉素口服生物利用度。在一个实施方案中，一种或多种埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂化物、包合物、水合物或前体药物的生物利用度为至少20％。一种或多种埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂化物、包合物、水合物或前体药物可以以丙二醇和乙醇溶液口服给予，例如其中丙二醇∶乙醇比例为约80∶20。
优选的埃坡霉素为[1S-[1R*，3R*(E)，7R*，10S*，11R*，16S*]]-7，11-二羟基8，8，10，12，16-五甲基-3-[1-甲基-2-(2-甲基-4-噻唑基)乙烯基-17-氧杂-4-氮杂双环[14.1.0]十七烷-5，9-二酮。
本发明还包括各种药盒，药盒包括所需要的埃坡霉素和缓冲溶液组合物。本发明还包括一种药盒，其包括(a)包含适合口服用药的埃坡霉素的药用组合物和(b)包含适合口服应用的酸中和缓冲剂的药用组合物。
在一个实施方案中，所述药盒包括：
(i)第一种组分，其包含一种或多种下式埃坡霉素：
或
其中G、W、X、Y、B1、B2、D、R1、R2、R3、R4、R5、R8、R9、R10、R11、R12、R16、R17、R18、R22、R23、R24、R25、R26、R27、R28、R29、R30、R31、R32、R33、R34、R35、R36、R37、R38、R39、R40、R41、R42、R43、R51、R52、R53和R61的定义同上。
(ii)第二种组分，其包含药学上可接受的酸中和缓冲剂，
其中第一种组分和第二种组分为口服液体剂型或固体药用组合物，固体组合物可用溶剂配制或复制获得液体口服剂。
可用溶剂复制的药用组合物可以为片剂。第一种组分或第二种组分可以为无水组分。药盒可以任选包含复制第一种或第二种组分的溶剂。复制第一种组分的溶剂可以为丙二醇和乙醇的混合物，其中丙二醇∶乙醇比例为约80∶20。
本发明还涉及一种药用组合物，其包含：
(i)固体形式的一种或多种下式埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂化物、包合物、水合物或前体药物：
或其中G、W、X、Y、B1、B2、D、R1、R2、R3、R4、R5、R8、R9、R10、R11、R12、R16、R17、R18、R22、R23、R24、R25、R26、R27、R28、R29、R30、R31、R32、R33、R34、R35、R36、R37、R38、R39、R40、R41、R42、R43、R51、R52、R53和R61的定义同上；
(ii)固体药学上可接受的酸中和缓冲剂，其量足以当用溶剂复制所述药用组合物获得液体口服剂型时，降低所述一种或多种埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂化物、包合物、水合物或前体药物的分解。
附图简述
图1为IV给予狗0.5mg/kg(-±-)和口服给予2mg/kg溶液(-□-)后化合物(A)随时间变化的平均血浆浓度曲线。垂直线为标准差，当大于标记大小时，标示出标准差。
图2为IV给予狗0.5mg/kg(-±-)和口服给予2mg/kg溶液(-□-)后化合物(B)随时间变化的平均血浆浓度曲线。垂直线为标准差，当大于标记大小时，标示出标准差。
发明详述
基于埃坡霉素的药理学优点，需要一些给予这些化合物的剂型和方法使其有足够的生物利用度以获得药理学效果。特别需要口服剂型，尤其需要液体口服剂型，这样的剂型能够吸收足以治疗疾病量的埃坡霉素。本发明一部分是基于如下发现：式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、包合物或前体药物：
或
其中：
G选自烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环基、
W为O或NR16；
X为O；S；CHR17；或者H、R18；
Y选自O；H、H；H、OR22；OR23、OR23；NOR24；H、NOR25；H、HNR26R27；NHNR28R29；H、NHNR30R31或CHR32，其中OR23、OR23可以为环状酮缩醇；
B1和B2选自H、OR33、OCOR34、OCONR35R36、NR37R38或NR39CONR40R41；
D选自NR42R43或杂环基；
R1、R2、R3、R4和R5选自H、低级烷基；
R8、R9、R10和R11选自H、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、环烷基、杂环基或取代的杂环基；
R17、R18、R22和R23选自H、烷基和取代的烷基；
R24、R25、R26、R28、R30、R32、R33、R34、R35、R36、R37、R39、R40、R41、R42、R51、R52、R53和R61选自H、烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基；
R12、R16、R27、R29、R31、R38和R43选自H、烷基、取代的烷基、取代的芳基、环烷基、杂环基、R51C＝O、R52OC＝O、R53SO2、羟基和O-烷基或O-取代烷基；
当上述化合物与药学上可接受的酸中和缓冲剂口服给予时，有获得生理学效果的足够生物利用度。因此，本发明涉及通过口服给予一种或多种式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂化物、包合物、水合物或前体药物，同时口服给予药学上可接受的酸中和缓冲剂，从而提高式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂化物、包合物、水合物或前体药物的口服用药的生物利用度的方法。本发明还涉及本发明方法中使用的药用组合物、药用剂型、药盒。
一种优选用于本发明的方法、组合物以及剂型的埃坡霉素为以下图示的[1S-[1R*，3R*(E)，7R*，10S*，11R*，16S*]]-7，11-二羟基8，8，10，12，16-五甲基-3-[1-甲基-2-(2-甲基-4-噻唑基)乙烯基-17-氧杂-4-氮杂双环[14.1.0]十七烷-5，9-二酮(“化合物(A)”)：
定 义
以下为本发明使用的各种术语的定义。除非另有具体说明，否则这些定义适用于整个说明书。
本文使用的术语“烷基”是指1-20个碳原子、优选1-7个碳原子的直链或支链的未取代烃基。
举例来说，本文使用的术语“取代的烷基”是指1-4个例如以下取代基取代的烷基：卤基、三氟甲基、三氟甲氧基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、氧代、链烷酰基、芳氧基、链烷酰氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、环烷基氨基、杂环基氨基、二取代的胺(氨基的2个取代基选自：烷基、芳基或芳烷基)、链烷酰基氨基、芳酰基氨基、芳烷酰基氨基、取代的链烷酰基氨基、取代的芳基氨基、取代的芳烷酰基氨基、巯基、烷硫基、芳硫基、芳烷硫基、环烷硫基、杂环硫基、烷基硫羰基、芳基硫羰基、芳烷基硫羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、亚磺酰氨基(例如SO2NH2)、取代的亚磺酰氨基、硝基、氰基、羧基、氨基甲酰基(例如CONH2)、取代的氨基甲酰基(例如CONH烷基、CONH芳基、CONH芳烷基或氮原子有选自烷基、芳基或芳烷基的两个取代基的基团)、烷氧基羰基、芳基、取代的芳基、胍基以及杂环基(例如吲哚基、咪唑基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、吡咯烷基、吡啶基和嘧啶基)。上述取代基进一步被取代时，其取代基团为卤素、烷基、烷氧基、芳基或芳烷基。
本文使用的术语“卤素”或“卤基”是指氟、氯、溴和碘。
本文使用的术语“芳基”是指环部分有6-12碳原子的单环或双环芳族烃基，例如苯基、萘基、联苯基和二苯基，以上个基团可以被取代。
本文使用的术语“芳烷基”是指芳基直接通过烷基连接，例如苄基。
举例来说，本文使用的术语“取代的芳基”是指被1-4个例如以下取代基取代的芳基：烷基；取代的烷基、苯基、取代的苯基、杂环基、卤基、三氟甲氧基、三氟甲基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、链烷酰基、链烷酰氧基、氨基、烷基氨基、芳烷基氨基、环烷基氨基、杂环基氨基、二烷基氨基、链烷酰基氨基、巯基、烷硫基、环烷硫基、杂环硫基、脲基、硝基、氰基、羧基、羧基烷基、氨基甲酰基、烷氧基羰基、烷基硫羰基、芳基硫羰基、烷磺酰基、亚磺酰氨基和芳氧基。上述取代基可以进一步被以下基团取代：卤基、羟基、烷基、烷氧基、芳基、取代的芳基、取代的烷基或芳烷基。
本文使用的术语“环烷基”是指任选取代的、饱和环烃环系，优选包含1-3个环并且每个环有3-7个碳原子，环可以进一步与不饱和C3-C7碳环稠合。示例性基团包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环癸基、环十二烷基和金刚烷基。示例性的取代基包括一个或多个上述烷基或者一个或多个上述烷基取代基。
本文使用的术语“杂环”、“杂环的”和“杂环基”是指任选取代的、完全饱和或不饱和、芳族或非芳族环基，例如4-15元体系或4-7元单环、7-11元双环或10-15元三环环系，其中至少一个含碳原子环中含有至少一个杂原子。杂环基团中含杂原子的各环可以含有1、2或3个选自氮、氧和硫原子的杂原子，其中氮和硫杂原子还可以任选被氧化，并且氮杂原子还可以任选被季铵化。杂环基可以在任何杂原子或碳原子连接。
示例性单环杂环基包括但不限于吡咯烷基、吡咯基、吲哚基、吡唑基、氧杂环丁烷基、吡唑啉基、咪唑基、咪唑啉基、咪唑烷基、噁唑基、噁唑烷基、异噁唑啉基、异噁唑基、噻唑基、噻二唑基、噻唑烷基、异噻唑基、异噻唑烷基、呋喃基、四氢呋喃基、噻吩基、噁二唑基、哌啶基、哌嗪基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、2-氧杂环庚烷基、吖庚因基、4-哌啶酮基、吡啶基、N-氧代-吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、四氢噻喃磺基、吗啉基、硫代吗啉基、硫代吗啉基亚砜基、硫代吗啉基磺基、1，3-二氧戊环和四氢-1，1-二氧代噻吩基、二氧杂环己烷基、异噻唑烷基、硫杂环丁烷基、硫杂丙环基、三嗪基和三唑基。
双环杂环基的示例性基团包括但不限于苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并噻吩基、奎宁环基、喹啉基、喹啉基-N-氧化物、四氢异喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并吡喃基、吲嗪基、苯并呋喃基、对氧萘酮基、氧杂萘邻酮基、邻二氮杂萘基、喹喔啉基、吲唑基、吡咯并吡啶基、呋喃并吡啶基(例如呋喃并[2，3-c]吡啶基、呋喃并[3，1-b]吡啶基或呋喃并[2，3-b]吡啶基)、二氢异吲哚基、二氢喹唑啉基(例如3，4-二氢-4-氧代-喹唑啉基)、苯并异噻唑基、苯并异噁唑基、苯并二嗪基、苯并呋咱基、苯并硫代吡喃基、苯并三唑基、苯并吡唑基、二氢苯并呋喃基、二氢苯并噻吩基、二氢苯并硫代吡喃基、二氢苯并硫代吡喃基磺基、二氢苯并吡喃基、二氢吲哚基、异色满基、异二氢吲哚基、萘啶基、2，3-二氮杂萘基、3，4-亚甲二氧苄基、嘌呤基、吡啶并吡啶基、喹唑啉基、四氢喹啉基、噻吩并呋喃基、噻吩并吡啶基和噻吩并噻吩基。
示例性的取代基包括但不限于一个或多个上述烷基或者一个或多个上述烷基取代基。还包括较小的杂环基，例如，环氧化物和环乙亚胺。
本文使用的术语“杂原子”应该包括氧、硫和氮。
本文使用的前缀“低级”表示最多7个(包括7个)碳原子、优选最多4个(包括4个)碳原子的基团。
本文使用的术语“生物利用度”是指药物吸收进入活体系统并且进入活体系统的循环血液中的程度。确定药物的生物利用度的方法为本领域普通技术人员所熟知。
本文使用的短语“足以获得生理学效果的生物利用度”是指埃坡霉素的生物利用度大于20％、优选大于30％、更优选大于50％。
本文使用的术语“药学上可接受的盐”是指用含有碱性官能团(例如胺)的式(Ia)或(Ib)埃坡霉素与药学上可接受的无毒性无机或有机酸制备的盐。合适的无毒性酸包括但不限于醋酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、富马酸、葡糖酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、羟乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、半乳糖二酸、硝酸、双羟萘酸、遍多酸、磷酸、丁二酸、硫酸、酒石酸和对甲苯磺酸。举例来说与酸生成的盐可以如下获得：用含有碱性官能团的式(Ia)或(Ib)埃坡霉素和等当量无毒性酸反应获得酸加成盐。反应通常在所述酸加成盐可沉淀的介质中进行，或在含水介质中反应后蒸发。术语“药学上可接受的盐”还指用含有酸性官能团(例如羧酸官能团)的式(Ia)或(Ib)埃坡霉素和药学上可接受的无毒无机或有机碱制备的盐。合适的无毒性碱包括碱金属(例如钠、钾和锂)的氢氧化物；碱土金属(例如钙和镁)的氢氧化物；其它金属(例如铝和锌)的氢氧化物；氨水和有机胺(例如未取代或羟基-取代的单-、二-或三烷基胺；二环己胺；三丁基胺；吡啶；N-甲基，N-乙胺；二乙胺；三乙胺；单-、双-或三-(2-羟基-低级烷基)胺(例如单-、双-或三-(2-羟乙基)胺、2-羟基-叔丁基胺或三(羟甲基)甲胺)、N，N，-二-低级烷基-N-(羟基低级烷基)-胺(例如N，N-二甲基-N-(2-羟乙基)胺或三-(2-羟乙基)胺；N-甲基-D-葡糖胺)；氨基酸(例如精氨酸、赖氨酸)等。举例来说，与碱形成的盐可以如下获得：用含有酸性官能团的式(Ia)或(Ib)埃坡霉素与等当量无毒性碱反应。反应通常在所述盐可沉淀的介质中进行，或在含水介质中反应后蒸发。
本发明还包括两性离子。
本文使用的术语“药学上可接受的酸中和缓冲剂”是指药学上可接受的无毒性酸和酸的药学上可接受的无毒性盐的组合物，当其加入一种溶液后，向所述溶液加入酸或碱时，与没有加入所述缓冲剂的溶液相比，缓冲剂的加入使得该溶液更能抵抗pH的变化。术语“药学上可接受的酸中和缓冲剂”还包括化合物例如碱性化合物，当其加入酸性溶液时中和酸并提高溶液的pH。
本文使用的术语“包合物”是指一“客体”化合物分子被包在若干“主体”化合物分子形成的笼样空间中所形成的包含化合物。
本文使用的术语“前体药物”是指在生物学条件下(体外或体内)可以通过水解、氧化或其它反应提供一种式(Ia)或(Ib)的埃坡霉素的衍生化合物。例如，可以通过酯化羧酸官能团方便地生成羧酸酯；如果式(Ia)或(Ib)埃坡霉素包含酸官能团，可以将其酯化获得前体药物。各种前体药物为本领域众所周知(前体药物的实例参见：Design ofProdrugs，主编：H.Bundgaard，Elsevier，1985；Methods inEnzymology，vol.42，p.309-396，K.Widder等主编，Academic Press，1985；A Textbook of Drug Design and Development，Krosgaard-Larsen和H，Bundgaard主编，第5章，“Design and Application of Prodrugs”，H.Bundgaard主编，p.113-191，1991；H.Bundgaard，Advanced DrugDelivery Reviews，8，1-38，1992；H.Bundgaard等，Journal ofPharmaceutical Sciences，77，285，1988；N.Kakeya等，Chem.Phar.Bull.，32，692，1984)。
本文使用的短语“酸中和能力”是指可以使pH变为3.5的1N HCl用量(表达为毫当量)，见U.S.Pharmacopeia，301定义。
本文使用的术语“溶液剂”是指一种或多种可溶解的活性成分溶于溶剂中的液体制剂。
本文使用的术语“混悬剂”是指微细的不溶性活性成分悬浮于溶剂。
本文使用的术语“酏剂”是指活性成分在包含水和醇的溶剂中的溶液。
本文使用的术语“糖浆剂”是指糖(例如蔗糖)在水或其它含水液体中的浓溶液剂，任选包含多元醇(例如甘油或山梨醇)以延迟糖结晶或提高所加入成分的溶解度。
可用于本发明的方法、组合物以及剂型的埃坡霉素
任何埃坡霉素可用于本发明的方法、组合物以及剂型。优选埃坡霉素对酸不稳定和难溶于水，这样它们在口服用药时不容易被生物利用。在一个具体实施方案中，式(Ia)或(Ib)埃坡霉素用于本发明的方法、组合物以及剂型。式(Ia)或(Ib)埃坡霉素可以按照以下我们的共同未决申请中公开的方法制备：申请号09/280,191，申请日1999年3月29日；申请号09/170,482，申请日1998年10月13日，明确将其内容结合到本文。本领域普通技术人员也知道，式(Ia)或(Ib)埃坡霉素也可以通过适当改进例如以下文献公开的方法制备，K.C.Nicolau等，“An Approach to Epothilones Based on Olefin Metathesis”，Angew.Chem Int.Ed.Engl.，35(20)：2399-2401(1996)；K.C.Nicolau等，“TheTotal Synthesis of Epothilone A：The Macrolactonization Approach”Angew.Chem Int.Ed.Engl.，36(5)：525-527(1997)；K.C.Nicolau等，“Designed Epothilones：Combinatorial Synthesis，Tubulin AssemblyProperties，and Cytoxic Action Against Taxol Resistant Tumor Cells”Angew.Chem Int.Ed.Engl.，36(19)：2097-2103(1997)；K.C.Nicolaou等，“The Olefin Metathesis Approach to Epothilone A anditsAnalogues”，J.Am.Chem.Soc.，119(34)：7960-7973(1997)；K.C.Nicolaou等，“Total SyntHeses of Epothillones A and B via aMacrolactonization-Based Strategy”，J.Am.Chem.Soc.，119(34)：7974-7991(1997)；K.C.Nicolaou等，“Synthesis of Epothilones A and Bin Solid and Solution Phase”Nature，387：268-272(1997)；D.Meng等，“Remote Effects in Macrolide Formation Through Ring-FormingOlefin Metathesis：An Application to the Synthesis of FllyActiveEpothilone Conegeners”，J.Am.Chem.Soc.，Vol.119，No.11，27332734(1997).
优选结晶和无水埃坡霉素。任选埃坡霉素在用于本发明组合物前灭菌处理。
埃坡霉素或其组合物的效用和用途
本发明埃坡霉素为微管-稳定剂，因此可用于治疗各种癌症和其它异常细胞增殖疾病。本发明方法特别可用于给予患有癌症和其它增殖性细胞疾病的患者一种或多种式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物、水合物或前体药物。本文使用的术语“癌症”包括但不限于实体肿瘤和血液源性肿瘤。术语癌症是指皮肤、组织、器官、骨、软骨、血液和脉管癌症。术语“癌症”进一步包括原发性癌和转移性癌。可用本发明方法治疗的癌症实例包括但不限于癌，包括膀胱癌、乳癌、结肠癌、肾癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、子宫颈癌、甲状腺癌和皮肤癌(包括鳞状细胞癌)；淋巴系造血性肿瘤，包括但不限于白血病、急性淋巴细胞白血病、急性成淋巴细胞白血病、B-细胞淋巴瘤、T-细胞淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤和Burketts淋巴瘤；髓系造血性肿瘤，包括但不限于急性和慢性骨髓白血病和早幼粒细胞白血病；间充质来源肿瘤，包括但不限于纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；其它肿瘤，包括黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、成神经细胞瘤和神经胶质瘤；中枢神经系统和外周神经系统的肿瘤，包括但不限于星形细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；其它肿瘤，包括但不限于着色性干皮病(xenoderma，pigmentosum)、角化棘皮瘤(keratoactanthoma)、甲状腺滤泡癌和畸胎癌。
本发明方法可用于治疗已经治疗过的癌症患者以及先前没有治疗过的癌症患者。实际上，本发明方法和组合物可用于一线和二线癌症治疗。
本发明方法还可与其它抗癌治疗方法(包括放疗)联合应用。本发明方法尤其可用于与给予以下这样的第二种药物的治疗方法联合应用：与在G2-M阶段发挥作用的式(Ia)或(Ib)埃坡霉素相比，第二种药物在不同细胞周期阶段(例如S阶段)发挥作用。
式(Ia)或(Ib)埃坡霉素还可抑制肿瘤血管形成，因此影响异常的细胞增殖。因此，本发明方法还可用于治疗某些形式的视网膜血管形成性失明、关节炎(尤其是炎性关节炎)、多发性硬化、再狭窄和牛皮癣。
式(Ia)或(Ib)埃坡霉素还可以诱导或抑制细胞凋亡，细胞凋亡是对正常发育和体内平衡非常重要的生理细胞死亡过程。细胞凋亡过程异常促进各种疾病的发生。因此，本发明方法可用于治疗人的各种细胞凋亡失常性疾病，包括癌症(特别包括但不限于滤泡性淋巴瘤；p53突变的癌；乳腺、前列腺及卵巢激素依赖性肿瘤；癌症病变例如家族性腺瘤性息肉病)、病毒感染(包括但不限于疱疹病毒、痘病毒、Epstein-Barr病毒、Sindbis病毒和腺病毒)、自身免疫性疾病(包括但不限于系统性红斑狼疮、免疫性肾小球性肾炎、类风湿性关节炎、牛皮癣、炎症性肠病和自身免疫性糖尿病)、神经变性疾病(包括但不限于阿耳茨海默氏病、AIDS-相关性痴呆、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化、视网膜色素变性、脊髓肌肉萎缩症和脑退化)、AIDS、骨髓增生异常综合征、再生障碍性贫血、心肌梗塞性局部缺血性损伤、中风和再灌注损伤、心律失常、动脉硬化症、毒素性或乙醇性肝病、血液疾病(包括但不限于慢性贫血和再生障碍性贫血)、肌肉骨骼系统退化性疾病(包括但不限于骨质疏松症和关节炎)、阿司匹林敏感性鼻窦炎、囊性纤维化、多发性硬化症、肾病和癌症疼痛。
式(Ia)或(Ib)埃坡霉素还可以与其它治疗性药物配制在一起或同时用药，在上述疾病伴随病症的药物治疗中，其它治疗药物因为其特殊效用而被选用。举例来说，各式I和II化合物可以与防止恶心、过敏和胃刺激作用(例如抗呕吐药物)以及H1和H2抗组胺药配制在一起。上述治疗性药物与式(Ia)或(Ib)埃坡霉素联合用药时可以使用的用量见Physicians’Desk Reference(PDR)，也可由本领域普通技术人员确定用量。
可用于本发明的方法、组合物以及剂型的缓冲剂
本发明方法中使用缓冲剂的目的是暂时中和胃液，由此减少埃坡霉素在患者胃中降解。此外，在包含一种或多种式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物、水合物或前体药物的含水或部分含水口服制剂中，缓冲剂减少式(Ia)或(Ib)埃坡霉素的分解。令人惊奇的是，申请者发现包含一种或多种式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物、水合物或前体药物以及缓冲剂的液体口服剂型比没有缓冲剂的液体口服剂型更稳定。
可用于本法发明方法、组合物以及剂型的缓冲剂可以很容易如下制备：按一定比例混合一种或多种酸和一种或多种酸的盐，组合比例使得将其溶解于水溶液时溶液的pH在约5-9。通常，所述一种或多种酸的pKa在约4-10。本领域普通技术人员很容易知道如何制备缓冲剂使得溶液具有需要的pH值。此外，本发明也包括使用缓冲化合物，例如碱性化合物，当其加入酸性溶液时提高溶液的pH。
本领域熟练技术人员容易理解不同缓冲剂可以用于本发明的方法、组合物以及剂型。典型的缓冲剂包括但不限于药学上可接受的弱酸、弱碱或其混合物。优选缓冲剂组分为水溶性物质，例如磷酸、酒石酸、乳酸、丁二酸、柠檬酸、醋酸、抗坏血酸、天门冬氨酸、谷氨酸以及它们的盐。优选药学上可接受的酸中和缓冲剂为磷酸一氢盐-磷酸二氢盐缓冲剂或者磷酸一氢盐缓冲剂-柠檬酸-柠檬酸盐缓冲剂。上述缓冲剂市售可得或者普通技术人员可以用例如上述市售可得的缓冲剂制备。
口服给予酸不稳定的式(Ia)或(Ib)埃坡霉素的方法
本发明包括提高口服给予的埃坡霉素的生物利用度的方法，该方法是口服给予式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物、水合物或前体药物并口服给予药学上可接受的酸中和缓冲剂。本发明特别适合酸不稳定的埃坡霉素，但也可用于在碱性条件下易水解的埃坡霉素以及对水解不敏感的埃坡霉素。此外，本发明可用于难溶于水性介质的埃坡霉素。
应当理解本发明埃坡霉素可以胃肠外用药，这种方式不通过胃肠系统并且克服任何生物利用度问题。但是，所述用药方式对病人来讲既不方便又不舒服，而且产生其它潜在副作用。本发明组合物和方法使得可通过口服途径用药，这是一个重要优点，尤其是对人患者来说。
联合给予一种或多种式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物、水合物或前体药物和药学上可接受的酸中和缓冲剂使得所述一种或多种式(Ia)或(Ib)埃坡霉素的生物利用度提高。尽管不希望受制于理论，但是还是认为生物利用度的提高至少很大程度上是由于缓冲剂降低了式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物、水合物或前体药物在胃酸性环境中的分解率。某些埃坡霉素，包括优选的埃坡霉素化合物(A)，在酸性含水环境不稳定并分解，推测可能是由于酸催化水解打开环氧化物环。举例来说，化合物(A)水溶液在37℃、pH7.4时，5％药物损失的时间(t95)大约为38min，但是在pH2.5时t95仅约0.2min。因此，当式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物、水合物或前体药物口服用药时，它们在患者胃中分解使得胃肠道吸收极少或没有吸收。
但是，当一种或多种式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物、水合物或前体药物联合药学上可接受酸中和缓冲剂给予患者时，所述缓冲剂中和患者胃中的酸使得所述一种或多种式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物、水合物或前体药物的分解速率充分降低，从而使所述一种或多种式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物、水合物或前体药物在胃肠道保持足够的吸收时间。
本发明的另一个实施方案中，抗酸性物质(例如铝和镁的氢氧化物；碳酸盐例如碳酸钠和碳酸钙；硅酸盐以及磷酸盐)可以在给予埃坡霉素之前、同时、之后给予以中和胃酸。
根据本发明方法口服用药时，式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物、水合物或前体药物至少有约20％生物利用度、优选至少约40％生物利用度、更优选至少约50％生物利用度。
本发明一个实施方案中，所述一种或多种式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物、水合物或前体药物和药学上可接受的酸中和缓冲剂以单一口服剂型提供并且同时用药。包含所述一种或多种式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物、水合物或前体药物和药学上可接受的酸中和缓冲剂的单一组合物可以口服给予固体口服剂型(例如片剂、胶囊或粉末)或液体口服制剂(例如溶液剂、混悬剂或酏剂)给药。溶液剂或混悬剂可以利用适当的溶剂或助溶剂溶解埃坡霉素和缓冲组分在临用前配制。
举例来说，一种或多种式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物、水合物或前体药物和药学上可接受的酸中和缓冲剂可以溶液剂同时给予，所述溶液剂由式(Ia)或(Ib)埃坡霉素溶于包含比例约为58∶12∶30的丙二醇∶乙醇∶磷酸盐缓冲剂(例如1M，pH约8)的液体。
本发明另一个实施方案中，式(Ia)或(Ib)埃坡霉素和药学上可接受的酸中和缓冲剂可以独立的不同药用组合物提供并分开给予。以上各组合物以固体口服剂型或液体口服剂型用药。
分开给予一种或多种式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物、水合物或前体药物和药学上可接受的酸中和缓冲剂时，可以在给予所需式(Ia)或(Ib)埃坡霉素之前、之后或在之前和之后都口服给予药学上可接受的酸中和缓冲剂。优选在给予所需式(Ia)或(Ib)埃坡霉素之前和之后都口服给予药学上可接受的酸中和缓冲剂，口服量足以中和胃酸。当药学上可接受的酸中和缓冲剂在给予一种或多种式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物、水合物或前体药物前给予时，将其在给予所需式(Ia)或(Ib)埃坡霉素前约5h内给予，优选约3h内、更优选约1h内、最优选在约10min内给予。当药学上可接受的酸中和缓冲剂在给予所需式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物、水合物或前体药物后给予时，将其在给予所需式(Ia)或(Ib)埃坡霉素后约5h内给予，优选约3h内、更优选约1h内、最优选在约10min内给予。
在另一实施方案中，式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物、水合物或前体药物以肠溶包衣丸剂或胶囊剂给药，使其延迟至给予药用有效的酸中和缓冲剂后释放埃坡霉素。肠溶包衣片剂和胶囊剂包覆能够耐受胃液但是在肠中崩解的物质。
在另一实施方案中，缓冲剂以可分散片剂用药。
所需式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物、水合物或前体药物的治疗剂量通常根据具体的疾病和所治疗疾病的严重程度变化。剂量，也许还有给药频率也可以根据患者的年龄、体重、反应和既往病史变化。本领域熟练技术人员在考虑上述因素后可以很容易确定合适的给药方案。通常，式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物、水合物或前体药物口服给药总剂量约0.05至约200mg/kg/天、优选约5至100mg/kg/天、更优选少于约100mg/kg/天，一次性给药或者以约2-4次分剂量给药。
本发明包括所需埃坡霉素的药用单位剂型，包括5mg/单位、10mg/单位、15mg/单位、20mg/单位、25mg/单位、50mg/单位以及100mg/单位。类似地，本发明的液体单位剂量包括但不限于2.5mg/mL和10mg/mL。
本发明使用的术语“总剂量”是指如果一种以上式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物、水合物或前体药物以单位剂型给予患者，则为式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物、水合物或前体药物的联合用量。
此外，药学上可接受的酸中和缓冲剂的给药剂量足以产生至少约20毫当量的酸中和能力、优选至少约30毫当量的酸中和能力、更优选至少约40毫当量的酸中和能力、最优选至少约50毫当量的酸中和能力。
本发明还包括所需缓冲剂的药用单位剂型，包括约5-100mg/单位、优选约22.5mg/单位、最优选约22.5mg/单位。类似地，本发明缓冲剂的液体单位剂量包括约5-100mg/单位、优选约22.5mg/单位、更优选约22.5mg/单位，缓冲剂溶于约50-300mL溶剂、优选约100-200mL溶剂、更优选约150mL溶剂中。
通常，药学上可接受的酸中和缓冲剂以水溶液给药，其pH为约5-9、优选约6-8.5、更优选约7-8。可使溶液具有所需pH范围的任何药学上可接受的酸中和缓冲剂可以用于本发明方法。优选药学上可接受的酸中和缓冲剂为磷酸一氢盐-磷酸二氢盐缓冲剂或磷酸一氢盐缓冲剂-柠檬酸-柠檬酸盐缓冲剂。
本发明一个实施方案中，患者首先给予药学上可接受的酸中和缓冲剂，约为150mL的水溶液中包含无水磷酸氢二钠(约0.2M)、柠檬酸钠二水合物(约0.07M)和无水柠檬酸(约0.008M)，pH约7.4；接着口服一种或多种式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物、水合物或前体药物，为溶于比例约80∶20的丙二醇∶乙醇体系中的液体剂型；接着再口服约150mL水溶液，其中包含无水磷酸氢二钠(约0.2M)、柠檬酸钠二水合物(约0.07M)和无水柠檬酸(约0.008M)，pH约为7.4。
组合物、单位剂型和药盒
本发明还涉及包括第一和第二种组分的药盒，第一种组分包括一种或多种式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物、水合物或前体药物，第二种组分包括药学上可接受的酸中和缓冲剂。第一和第二种组分以独立的不同药用组合物提供，它们用于分开给药。第一和第二种组分以适合口服给药的药用剂型提供或者为可以用液体配制或溶解稀释为液体口服剂型的固体药用组合物。优选式(Ia)或(Ib)埃坡霉素装在避光小瓶中。
适合口服用药的药用组合物和剂型可以为离散剂型，例如但不限于片剂(例如可咀嚼片剂)、囊片、胶囊剂、小药囊中的散剂、肠溶包衣片剂、肠溶包衣珠、肠溶包衣软凝胶胶囊剂以及液体(例如调味糖浆剂)。所述剂型包含预定剂量的活性成分，可以按照本领域熟练技术人员众所周知的药学方法制备(参见Remington’sPharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing，Easton PA(1990)).
典型的口服剂型如下制备：根据常规药学共混技术使活性成分与至少一种赋型剂紧密混合。赋型剂可以根据用药所需的剂型采用各种类型赋形剂。例如，适用于固体口服剂型(例如散剂、片剂、胶囊剂和囊片)的赋型剂包括但不限于淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘合剂和崩解剂。适用于口服液体剂型的实例包括但不限于水、二元醇类、油、一元醇类、调味剂、防腐剂和着色剂。
片剂和胶囊剂为方便的药用组合物和口服剂型，这些剂型使用固体赋型剂。如果需要，片剂可以通过标准含水或不含水技术包衣。所述剂型可以按照药学中的任何方法制备。通常，药用组合物和剂型如下制备：使活性成分与液体载体、微细固体载体或两者均匀、紧密地混合，如果需要，然后将产物成形为所需形式。
例如片剂可以通过压缩或模塑制备。压缩片剂可以如下制备：将自由流动形式(粉末或颗粒)的活性成分任选与赋型剂混合后在适当机器上压制。模塑片剂可以将用惰性液体稀释剂润湿的粉状化合物混合物在适当机器上模塑获得。
本发明口服剂型可以使用的赋型剂实例包括但不限于粘合剂、填充剂、崩解剂和润滑剂。适用于药用组合物和剂型的粘合剂包括但不限于玉米淀粉、马铃薯淀粉或其它淀粉、明胶、天然和合成树胶(例如阿拉伯胶)、藻酸钠、海藻酸、其它藻酸盐、粉状西黄蓍胶、瓜尔胶、纤维素及其衍生物(例如乙基纤维素、醋酸纤维素、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠)、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、预凝胶化淀粉、羟基丙基甲基纤维素(例如Nos.2208，2906，2910)、微晶纤维素以及它们的混合物。
合适形式的微晶纤维素包括但不限于以如下名称出售的原料：AVICEL-PH-101、AVICEL-PH-103、AVICEL RC-581、AVICEL-PH-105(FMC Corporation，American Viscose Division，Avicel Sales，MarcusHook，PA)以及它们的混合物。一种具体的粘合剂为微晶纤维素和羧甲基纤维素钠AVICEL RC-581的混合物。合适的无水或低水分赋型剂或添加剂包括AVICEL-PH-103TM和淀粉1500LM。
适用于本发明的药用组合物和剂型的填充剂实例包括但不限于滑石粉、碳酸钙(例如颗粒或粉末)、微晶纤维素、粉状纤维素、dextrates、高岭土、甘露糖醇、硅酸、山梨醇、淀粉、预凝胶化淀粉以及它们的混合物。本发明药用组合物和剂型的粘合剂或填充剂通常为药用组合物或剂型的约50至约99％(重量)。
本发明药用组合物和剂型使用的崩解剂使得片剂暴露于含水环境时崩解。包含太多崩解剂的片剂可能在贮存时崩解，而包含太少崩解剂的片剂在预定的环境下可能不崩解或者不能以需要的的速率崩解。因此，应该使用足量的崩解剂制备本发明的药用组合物和固体口服剂型，不应该太多或太少以致造成活性成分释放速率的不利变化。崩解剂用量根据制剂类型变化，本领域普通技术人员也很容易确定。典型的药用组合物和剂型包含约0.5至约15％(重量)崩解剂、优选约1至约5％(重量)崩解剂。
可用于本发明药用组合物和剂型的崩解剂包括但不限于琼脂、海藻酸、碳酸钙、微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮、聚克立林钾、淀粉羟乙酸钠、马铃薯或木薯淀粉、其它淀粉、预凝胶化淀粉、其他淀粉、粘土、其他褐藻酸、其他纤维素、树胶以及它们的混合物。
可用于本发明药用组合物和剂型的润滑剂包括但不限于硬脂酸钙、硬脂酸镁、矿物油、轻质矿物油、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇、聚乙二醇、其它二醇、硬脂酸、十二烷基硫酸钠、滑石粉、氢化植物油(例如花生油、棉籽油、向日葵油、芝麻油、橄榄油、玉米油以及大豆油)、硬脂酸锌、油酸乙酯、十二烷酸乙酯、琼脂以及它们的混合物。其它的润滑剂包括例如syloid硅胶(AEROSIL 200，生产商W.R.Grace Co.，Baltimore，MD)、合成二氧化硅的凝固气溶胶(DegussaCo.of Plano，TX销售)、CAB-O-SIL(热解二氧化硅，Cabot Co.，Boston，MA)以及它们的混合物。如果使用，润滑剂通常在所加入的药用组合物或剂型中的用量少于约1％(重量)。
药用组合物和剂型还可以进一步包含一种或多种降低活性成分分解速率的化合物。这样的化合物在本文成为“稳定剂”，包括但不限于抗氧化剂例如抗坏血酸和盐缓冲剂。
用于口服的溶液为另一种方便的口服剂型，此剂型中使用溶剂。液体口服剂型如下制备：在适当溶剂中混合活性成分形成活性成分在液体中的溶液剂、混悬剂、糖浆剂或酏剂。
溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂可以任选包含其它添加剂，包括但不限于甘油、山梨醇、丙二醇、糖、调味剂和稳定剂。
本发明药盒包含的第一和/或第二组分可以是已经制备好用于给药的液体口服剂型，或者包含的第一和/或第二组分可以是用溶剂溶解稀释为液体口服剂型的固体药用组合物。所述药盒为包含第一和/或第二组分的可以用溶剂溶解稀释为液体口服剂型的固体药用组合物时，药盒可以任选包含溶解稀释用溶剂。
配制或溶解稀释用溶剂与活性成分混合获得活性成分的液体口服剂型。优选所述活性成分可溶于所述溶剂并形成溶液。所述溶剂可以为水、不含水液体或不含水组分和含水组分的混合物。合适的不含水组分包括但不限于油；一元醇，例如乙醇；甘油；以及二元醇类，例如聚乙二醇和丙二醇。
本发明药学上可接受的酸中和缓冲剂优选具有水溶性。因此，药学上可接受的酸中和缓冲剂的优选溶剂为为水或水基体系(包括盐水溶液或葡萄糖溶液)。
式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物、水合物或前体药物较难溶于水。因此，对于式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物、水合物或前体药物，优选不含水液体或者为可溶混的含水组分和不含水组分的混合物的液体，最优选不含水液体。
用于式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物、水合物或前体药物的优选不含水液体为表面活性剂，例如丙二醇和乙醇，优选比例约为80∶20。合适的不含水液体或表面活性剂包括但不限于聚乙二醇、聚山梨醇酯、丙二醇、甘油酯、Cremophor、脂肪酸酯和醇、聚氧化乙烯以及脂肪醇的酯和醚。
用于式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物、水合物或前体药物的溶剂包括含水组分时，优选含水组分被缓冲以减少式(Ia)或(Ib)埃坡霉素的分解。包含一种或多种式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物、水合物或前体药物溶于水或部分含水溶剂中的液体口服剂型提供比没有缓冲剂的口服剂型更稳定的液体口服剂型。具体来讲，已经发现一种或多种式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物、水合物或前体药物的缓冲液体口服制剂的分解速率小于未缓冲的液体口服制剂的分解速率。尽管希望不受理论束缚，但是还是认为式(Ia)或(Ib)埃坡霉素在酸性和碱性介质中不稳定，推测大概是酸或碱催化水解打开环氧化物环的结果。但是，通过缓冲所述液体口服制剂有可能保持液体口服制剂的pH在某一值，这样pH值使得式(Ia)或(Ib)埃坡霉素的分解速率足够慢，这样式(Ia)或(Ib)埃坡霉素可在给予患者前不会分解。含水或部分含水液体口服剂型优选缓冲至pH为约5-9、优选约6-8.5、更优选约7-8。
当活性成分提供为可用溶剂配制或溶解稀释为液体口服剂型的固体药用组合物时，药用组合物通常为粉末形式，在患者临用前用液体配制。粉状药用组合物可以装在例如小瓶中，溶剂就加入小瓶。或者，小瓶内含物可以加入单独容器中的溶剂。本发明粉状活性成分还可以装在可以小药囊中，例如箔包装，小药囊可以打开，然后将内含物加入到溶剂中。本发明粉状活性成分还可以配制为片剂，片剂在加入溶剂时溶解。片剂常常包含崩解剂以促进片剂溶解。
本发明还涉及药用组合物，该组合物中包含固体形式的一种或多种式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物、水合物或前体药物和一定量的药学上可接受的酸中和缓冲剂，在所述药用组合物用液体溶解稀释为液体口服剂型时，缓冲剂的剂量足以减少所述一种或多种式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物、水合物或前体药物的分解。
除提供更稳定的液体口服剂型外，本发明药用组合物还提供一种口服给予患者时埃坡霉素生物利用度更高的液体口服剂型。因此，本发明还涉及液体口服剂型，该剂型包含溶于或分散于溶剂中的一种或多种式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物、水合物或前体药物以及药学上可接受的固体酸中和缓冲剂。优选一种或多种式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物、水合物或前体药物以及药学上可接受的固体酸中和缓冲剂溶于液体获得溶液。
优选缓冲剂在所述药用组合物中的含量使得液体口服制剂的pH为约5-9、优选约6-8.5、更优选约7-8。一般来说，当用液体溶解稀释提供液体口服剂型时，药学上可接受的酸中和缓冲剂的剂量足以产生至少约20毫当量的酸中和能力、优选至少约30毫当量的酸中和能力、更优选至少约40毫当量的酸中和能力、最优选至少约50毫当量的酸中和能力。可以获得上述pH值范围的药学上可接受的任何酸中和缓冲剂可以用于本发明组合物。优选药学上可接受的酸中和缓冲剂为磷酸一氢盐-一价磷酸缓冲剂或磷酸一氢盐缓冲剂-柠檬酸-柠檬酸盐缓冲剂。
通常，本发明药用组合物包含的一种或多种式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物、水合物或前体药物的总剂量约为0.05至约200mg、优选约5至约100mg、更优选约10至50mg。
本发明进一步涉及包含药用组合物的药盒，所述组合物包含：(i)固体形式的一种或多种式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物、水合物或前体药物和药学上可接受的固体酸中和缓冲剂的混合物；(ii)用于溶解稀释药用组合物以提供液体口服剂型的溶剂，在所述混合物用所述溶剂溶解稀释以提供液体口服剂型时，药用组合物中的药学上可接受的酸中和缓冲剂的剂量足以减少所述一种或多种式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物、水合物或前体药物的分解。
溶解稀释用溶剂与活性成分混合获得活性成分的液体口服剂型。液体口服剂型可以为溶液剂或混悬剂。优选活性成分可溶于所述溶剂并形成溶液剂。溶剂可以为水、不含水液体或不含水组合和含水组分的混合物。合适的不含水组分包括但不限于油；一元醇，例如乙醇；甘油；二元醇类，例如聚乙二醇和丙二醇。一种用于本发明的药盒的合适溶剂为丙二醇∶乙醇∶磷酸盐缓冲剂(1M，pH8)，比例约为58∶12∶30。
所述溶剂还可以进一步包含一种或多种添加剂(例如但不限于甘油、山梨醇、丙二醇、调味剂和防腐剂)以改善液体口服剂型的口感。
本发明进一步涉及无水药用组合物和剂型，其中包含活性成分(即一种或多种式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物、水合物或前体药物)和/或药学上可接受的酸中和缓冲剂。无水药用组合物和剂型具有优势，因为水可能促进部分化合物降解。举例来说，作为模拟长期贮存确定某些特性(保存期限或制剂随时间的稳定性)的方法，加入水(例如5％)在药学领域被广泛接受(参见例如，Jens T.Carstensen，Drug Stability：Principles & Practice，第2版，Marcel Dekker，NY，NY，1995，pp.379-80)。实际上，水和加热加速某些化合物的分解。因此，水对制剂的影响具有重要的意义，因为水分和/或湿气在制剂的生产、装卸、包装、贮存、运输以及使用过程中常常遇到。无水药用组合物和剂型对于包含一种或多种式(Ia)或(Ib)埃坡霉素或其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物、水合物或前体药物的药用组合物和剂型尤其有利，因为上述化合物为水分敏感性物质。
无水药用组合物和剂型应该在制备和贮存时保证其无水性质。本发明无水药用组合物和剂型可以用无水或低水分含量的成分在低水分或低湿度条件下制备。无水药用组合物和剂型优选用已知的防止暴露于水的材料包装，这样它们可以包装在合适的规定药盒中。合适的包装实例包括但不限于密封箔、塑料、单位剂量容器(例如小瓶)、凸泡包装和条形包装。
实施例
本发明某些实施方案以及某些优点通过以下的非限制性实施例示例性说明。
实施例1：用小鼠、大鼠和狗对化合物(A)进行药代动力学和药效学研究
1.1样品分析：分析药动学/药效研究的血浆样品中化合物(A)浓度，用LC/MS/MS(液相色谱法/质谱/质谱)检测法，小鼠研究在5-20,000ng/mL(10-40,000nM)曲线范围，对大鼠和狗的研究在2-1000ng/mL(4-2000nM)的曲线范围。药效研究中，化合物(A)的浓度用LC/MS/MS检测法测定，小鼠血浆标准曲线范围5-20,000ng/mL(10-40,000nM)。LC/MS/MS检测法还可用于确定大鼠和狗的血浆中化合物(B)的浓度，即母液或给药溶液或体内形成的化合物(A)的降解产物。化合物(B)的结构为：
化合物(B)
各样品如下分析：将内标物质加入0.2mL样品中，加入丙酮沉淀，然后用1-氯代丁烷萃取上层清液。移出有机层，蒸发至干。将残余物重新溶解稀释并注射到LC/MS/MS系统。人血浆用色谱法分离，其中采用无梯度洗脱，YMC ODS-AQ柱(4.6×50mm，3mm)，流动相为乙腈：0.01M醋酸铵，pH5.0(65∶35)。狗血浆用色谱法分离，其中采用无梯度洗脱，保持在40EC的Zorbax Stable Bond C18柱(2.1×150mm，5mm)，流动相为0.1M醋酸铵，pH 5和乙腈。大鼠血浆用色谱法分离，其中采用无梯度洗脱，保持在40EC的Stable Bond C18柱(2.1×150mm，5mm)，流动相为乙腈：0.1M醋酸铵，pH5.0(1∶1)。用负电喷雾串联质谱检测。对于所有分析样2-500ng/mL范围的标准曲线拟合为1/x加权二次型回归模型。
发现在大鼠和狗的EDTA(乙二胺四乙酸)血浆中，化合物(A)和化合物(B)在用于分析工作的处理前在室温中稳定至少4h，而处理后，在自动取样器中于4℃至少稳定至少24h，而大鼠和狗的血浆在经过至少3个冷冻-解冻循环后，在-20℃或-20℃以下至少稳定5周。此外，还发现在新鲜大鼠和狗EDTA全血中两种分析样在室温下稳定至少0.5h。
1.2小鼠体内的药动学：将化合物(A)静脉内(5mg/kg)或口服(48mg/kg)给予雌性CDF1小鼠。对于IV方式，将化合物(A)溶于20％乙醇溶液，快速注射给药。对于口服方式，将化合物(A)溶于乙醇∶磷酸盐缓冲盐水(0.25M，pH8.0)的3∶7混合物，管饲法给药。用于测定化合物(A)浓度的血浆样品从3只小鼠分别在IV给药后5、15和45min以及给药后2、4和6h采集，在口服给药后15和45min以及给药后2、4和6h小时采集。
IV给药后，化合物(A)的系统清除率或总体清除率(CLT)为68mL/min/kg，为肝血流的76％(90mL/min/kg)，6.3L/kg稳态容积分布说明广泛血管外分布，因为小鼠全身水分约为0.7L/kg(参见B.Davies和T.Morris，Physiological Parameters in Laboratory Animals andHumans，＂Pharmaceutical Research，1993，10(7)，10931095)。最终消除半衰期(T-HALF)约为3h。
口服给予化合物(A)后，血浆浓度峰值(CMAX)为5983ng/mL，达到CMAX的时间(TMAX)是给药后0.25h，说明化合物(A)的吸收很快。化合物(A)的绝对口服生物利用度为31％。
1.3大鼠体内的药动学：将化合物(A)通过动脉内(2mg/kg；10min输注)、口服(8mg/kg)或十二指肠内(8mg/kg)一次性给予禁食的雄性Sprague Dawley大鼠(n＝3-6只/组)。所有给药溶液用20％乙醇制备。在给药后24小时内采集血浆样品，化合物(A)浓度用LC/MS/MS检测法测定。
动脉内给药后，血浆浓度-时间曲线图显示双相清除，一个是给药后2小时内快速下降阶段，一个是缓慢的终末期。化合物(A)的CLT(平均值＝56mL/min/kg)为肝血流(56mL/min/kg)的100％，VSS(平均值＝23L/kg)显示广泛血管外分布，因为大鼠全身水分约为0.7L/kg(参见B.Davies和T.Morris，Physiological Parameters in LaboratoryAnimals and Humans，＂Pharmaceutical Research，1993；10(7)，1093-1095)。T-HALF平均值为9.6h。
在口服和十二指肠内给药后，CMAX平均值分别为228和642ng/mL；TMAX值分别为0.17h和0.08h，说明化合物(A)的吸收很快。口服和十二指肠内给药后，化合物(A)的绝对口服生物利用度分别为7.5％和27％。
在另一个研究中，胆管插入导管的Sprague Dawley大鼠(n＝2只/组)接受化合物(A)的一次性动脉内(10mg/kg)或口服(20mg/kg)给药，给药后9小时内采集胆汁、尿和血浆样品。胆汁中存在可以忽略不计的完整化合物(A)排泄物(给药量的1％)。尿中含有可检测量的化合物(A)，但是没有定量表示实际浓度，因为缺乏尿中化合物(A)的稳定性数据。用LC/MS不很确定地鉴定出尿和血浆中若干药物相关的化合物，包括异构体(M+0)和水解产物(M+18)。此外，血浆中检测到代谢产物(M-2)。
1.4狗体内的药动学：10min IV输注给予雄性小猎兔犬(n＝3)0.5mg/kg化合物(A)(10％乙醇溶液)。给药后32小时内采集血浆样品，检测化合物(A)的血浆浓度。血浆浓度-时间曲线显示多相曲线，包括在给药后2小时内浓度的初始快速下降阶段以及缓慢的终末消除阶段。化合物(A)的CLT(平均值＝17.3mL/min/kg)为肝血流(30.9mL/min/kg)的约56％，VSS平均值为25.2L/kg说明有大量血管外分布，因为狗的全身水分为0.6L/kg。估计T-HALF约为24h。
作为单剂量IV给药的毒理学研究的一部分，还评价了化合物(A)的动力学。化合物(A)通过IV输注(约15min)给药，剂量0.5mg/kg和5mg/kg，给予2只狗/性别/剂量。化合物(A)的给药溶液在给药前一天制备，用40％丙二醇、5％Cremophor EL、5％乙醇和50％磷酸盐缓冲液(50mM，pH7.4)制备。在给药后48小时内采集血样，LC/MS/MS检测法测定化合物(A)和化合物(B)的血浆浓度，两种分析物的标准曲线范围为2-500ng/mL。对于化合物(A)的0.5和5mg/kg剂量，不考虑性别，化合物(A)的CMAX平均值分别为218和5118ng/mL，而AUC平均值分别为316和6925h.ng/mL。对于比例为1∶10的各剂量，化合物(A)的CMAX及AUC平均值分别为1∶23和1∶27，这说明化合物(A)动力学与剂量在0.5-5mg/kg时为非线性关系。由于研究中取样有限没有检测T-HALF、MRT(INF)、CLT和VSS。
对于化合物(B)，对于剂量为0.5和5mg/kg的两组，CMAX平均值分别为95.6和984ng/mL，AUC平均值分别为55.0和1109h·ng/mL。化合物(B)的CMAX及AUC平均值比分别为1∶10和1∶20。由于取样量小，性别对化合物(A)的动力学影响不能做出结论性评价，但是两种性别之间的动力学似乎相当接近。
以上研究表明，观测到化合物(A)的系统性暴露量呈剂量相关性增长并且其增长比例超过剂量增长的比例。此外，也观测到化合物(B)的系统性暴露量呈剂量相关性增长。
实施例2：大鼠体内的毒物代谢动力学
化合物(A)的毒动学通过单剂量IV给予大鼠的毒理学研究评价。化合物(A)的给药溶液在给药前一天制备，使用50％丙二醇、10％Cremophor EL、10％乙醇和30％磷酸盐缓冲液(50mM，pH7.4)。化合物(A)以IV输注(约3min)给药，剂量为10、25和30mg/kg，给予3只大鼠/性别/剂量。给药后24小时内采集系列血样，用LC/MS/MS检测法测定化合物(A)和化合物(B)的血浆浓度，两种分析物的标准曲线范围为2-500ng/mL。在剂量为10、25和30mg/kg时，雄性大鼠体内化合物(A)的CMAX平均值分别为6422、19066和24414ng/mL；雌性大鼠的CMAX平均值分别为8384、20524和25054ng/mL。对于剂量为10、25和30mg/kg的试验组，雄性大鼠的浓度-时间曲线下面积(AUC)平均值分别为3864、11980和19269h.ng/mL；雌性大鼠的值分别为8156、28476和34563h.ng/mL。对于比例为1∶2.5∶3的各剂量，雄鼠和雌鼠体内化合物(A)的CMAX平均值比分别为1∶3.0∶3.8和1∶2.5∶3.0，AUC值比分别为1∶3.1∶4.9和1∶3.5∶4.2。由于研究中取样有限没有检测T-HALF、0至无穷的时间间隔内的平均停留时间MRT(INF)、总体清除率(CLT)和VSS。
对于化合物(B)，所有性别和剂量组的CMAX值和AUC值的范围分别为499-1787ng/nt和222-2003h.ng/mL。雄性和雌性大鼠中化合物(B)的CMAX值比分别为1∶2.6∶3.6和1∶3.0∶2.8，AUC值比分别为1∶3.4∶7.0和1∶4.3∶5.5。雌性大鼠中化合物(A)和化合物(B)的AUC值比雄性大鼠的相应值分别高1.8-2.4倍和1.3-2.0倍。
以上研究表明化合物(A)的系统性暴露量呈剂量相关性增长并且其增长比例超过剂量增长的比例，雌性大鼠比雄性大鼠的暴露量高。此外，观测到化合物(B)的系统性暴露量也呈剂量相关性增长。
实施例3：化合物(A)的药效研究
进行一系列试验评价化合物(A)的抗癌活性，将化合物(A)在10小时内IV输注给予皮下带有人卵巢癌(Pat-7肿瘤)的雌性裸小鼠。化合物(A)以10％乙醇溶液给药，剂量3-150mg/kg。试验结果说明化合物(A)的3-6mg/kg剂量为最小有效剂量(定义为产生相当于0.5log细胞杀死活性所需的剂量)。在一系列平行试验中，在IV输注3-150mg/kg的剂量10小时后，检测小鼠体内化合物(A)的表观稳态浓度。在输注开始后2、4和6小时后，检测化合物(A)的血浆浓度，所有时间点的各剂量水平显示在2h时达到稳态。因此，平均2、4和6h的浓度确定表观稳态浓度。在3-150mg/kg的整个剂量范围观测到表观稳态浓度呈剂量相关性增加。最小有效浓度定义为3-6mg/kg的最小有效IV输注剂量达到的表观稳态浓度，观测到最小有效浓度为15-45ng/mL(约30-90nM)。
实施例4：化合物(A)代谢的体外研究
将化合物(A)(40：M)与用烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)强化的小鼠、大鼠、狗和人的肝微粒体一起温育后，化合物(A)的氧化代谢速率分别为2.1、0.7、1.2和1.3nmol/min/mg蛋白质。此外，代谢产物在所有动物类型中相似(代谢产物包括若干M+6和M-2化合物)。定性比较研究表明，化合物(A)和大鼠或人肝细胞温育后与化合物(A)和微粒体温育后产生的代谢产物类似。类似于化合物(A)化学降解产物的物质似乎为所述肝细胞温育的主要产物。
用重组人CYP同种型在体外评价化合物(A)抑制参与药物代谢的主要人细胞色素P450s(CYPs)的能力。检测抑制3-氰基-7-乙氧基香豆素(CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19和CYP2D6)的脱乙基化以及抑制苄酰基试卤灵(CYP3A4)的脱烷基化的IC50值。化合物(A)为人CYP3A4的弱抑制剂，平均IC50值为7.3p.M(3.7p.g/mL)。化合物(A)不抑制CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19和CYP2D6。上述体外试验结果说明化合物(A)可能改变主要被CYP3A4代谢的药物的代谢清除率的可能性极小，而且不太可能明显改变由CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19和CYP2D6代谢的药物的代谢清除率。
化合物(A)与人肝微粒体以及特异性抑制通常参与药物代谢的个别细胞色素P450s的化合物一起温育。使用的所述抑制剂有呋拉茶碱(CYPIA2)、8-甲氧基补骨脂素(CYP2A6)、奥芬那君(CYP2B6)、磺胺苯吡唑(CYP2C9)、反苯环丙胺(CYP2C19)、奎尼丁(CYP2D6)、醋竹桃霉素(CYP3A4)和酮康唑(CYP3A4)。观测到只有CYP3A4抑制剂具有显著的抑制作用，两种抑制剂都完全抑制化合物(A)的生物转化。因此，在人体内，化合物(A)可以为用于CYP3A4的底物。
化合物(A)的(Pc)渗透系数用一种用于人肠吸收体外模型Caco-2细胞培养系统研究。浓度为10、30和100pM(分别约为5、15和50pg/mL)的化合物(A)的Pc分别为94、105和128nm/sec。部分模型化合物在人体的生物利用度已知，其Pc也用相同的试验检测。这些化合物包括水杨酸、对乙酰氨基酚、布洛芬和心得安，所有这些化合物的Pc＞200nm/sec并且吸收至少90％。化合物(A)的94-128nm/secPc值说明化合物(A)有可能在人体有很好的吸收。
实施例5：化合物(A)的各种制剂在小猎兔狗体内的药动学和绝对口服生物利用度
评价化合物(A)的各种制剂在成年雄性小猎兔狗(n＝4)的绝对口服生物利用度。化合物(A)以10min.静脉内(IV)输注(0.5mg/kg)、缓冲的口服溶液剂(2mg/kg)或缓冲的口服混悬剂(1mg/kg)形式给药。
5.1实验方案：用于此研究的试验方案见表1。
表1.试验方案 周期 处理 方法 给药 途径 剂量 (mg/kg) 制剂 狗的 数量 1 A IV 0.5溶液剂，溶于40％丙二醇、5％乙醇和55％磷酸盐缓冲液(50mM，pH-7.4) 4 2 B 口服 2溶液剂，溶于58％丙二醇、12％乙醇和30％磷酸盐缓冲液(1M，pH8.0) 4 3 C 口服 2a缓冲的混悬剂，悬浮于包含磷酸盐缓冲液(2M，pH8.0)以及柠檬酸(85mM)的1％AvicelRC591 4 4 D 口服 2n.a.d n.a.d
a由于毒性，此剂量减少至1mg/kg。
b在给予五肽胃泌素(6：g/kg；肌内)先处理15min。
c由于缺少可评估制剂，没有给予此处理方法。
d不适用。
所述方案为一次性给予、四次处理、四个周期、非随机交叉方案。化合物(A)以10min IV输注(0.5mg/kg)、缓冲的口服溶液剂(2mg/kg)或缓冲的口服混悬剂(1mg/kg)形式给予四只成年雄性小猎兔狗。对于IV用药，化合物(A)配制为溶于40％丙二醇、5％乙醇和55％磷酸盐缓冲液(50mM，pH＝7.4)的溶液剂(浓度约为0.375mg/mL)。化合物(A)的口服溶液剂(浓度约为1.5mg/mL)用58％丙二醇、12％乙醇和30％磷酸缓冲液(1M，pH8.0)作溶媒制备。对于口服混悬剂，将化合物(A)混悬于包含磷酸盐缓冲液(2M)以及柠檬酸(85mM)的1％AvicelRC591中。在用溶液稀释后，缓冲的混悬剂的pH约为8.0，浓度约为0.75mg/mL。由于累积毒性，在第三个处理周期的预定口服混悬剂的剂量从2mg/kg减少至1mg/kg。此外，第4次处理因为缺少可评估的制剂没有给予。在两次处理之间的洗脱期至少为7天。在给药后24小时采集系列血样，化合物(A)和化合物(B)的浓度用LC/MS/MS检测法测定，两种分析样的标准曲线范围都为2-500ng/mL。LC/MS/MS检测法与实施例1中使用的一样。
分析操作由标准、质量控制(QC)和研究样品组成。用于分析的血浆体积为0.2mL，两种分析样的标准曲线范围都是2-500ng/mL，分别定义为定量检测下限(LLQ)和定量检测上限(ULQ)。如果预估研究的样品浓度小于最小标准，则预付浓度值报告为＜LLQ；如果预付浓度值变于最高标准，则预估浓度的值报告为ULQ，将适当体积的这种样品用空白血浆稀释并重新分析。
5.2动物的准备、处理以及给药方法：选择有给药和血液采集的静脉通道的四只成年雄性狗用于研究。这些狗在研究开始前应该适应新环境至少一个星期，置于单独的钢笼中。这些狗用唯一的数字标记并在笼上系上标签。狗可随意饮水，用标准犬食每天喂食一次，除了在给药前需禁食过夜(约12h)，直到给药后4小时继续喂食。在给予缓冲的口服混悬液前15分钟，用五肽胃泌素(6：g/kg；肌内给药)预处理狗。五肽胃泌素预处理仅用于口服混悬剂的狗。IV剂量用校准的输注泵在10分钟内以恒定速率输注。口服溶液剂和混悬剂剂量通过管饲法给药，管饲法的管子用20mL水冲洗。
5.3样品采集和处理：在给药前以及给药后10min(IV仅输注结束)、15min、20min(仅IV)、30min、45min、1h、1.5h、2h、4h、6h、8h、12h和24h采集系列血液样品(3mL)。将血液样品采集到含有抗凝血剂K3-EDTA的Vacutainer管中，轻轻翻转所述管以混合各个管中的内含物。然后立即将血液样品放在碎冰上。在采集血液样品后30分钟内获取血浆：在约4℃以2000xg离心5min。血浆样品在-20℃或-20℃以下贮存直至分析化合物(A)和化合物(B)的浓度。
将以下公认标准先验式(a prtori)应用到各分析操作以分析血浆中化合物(A)和化合物(B)。所有校准标准的至少3/4的预估浓度应该在它们的各自标称浓度的15％内(LLQ为20％)；在标准曲线中最低浓度的至少一个平行测定的预估浓度应该在它们的标称浓度的20％内，在此水平限定为LLQ；在所有QC样品的至少3/4的预估浓度应该在它们各自标称浓度的15％内。
5.4药动学分析：血浆浓度峰值(CMAX)以及达到峰值浓度的时间(TMAX)直接记录观测结果。从时间0-T的血浆浓度-时间曲线下的面积(AUC(0-T))按照梯形规则计算，其中T为最后可测量血浆浓度的时间(参见M.Gibaldi等，Pharmacokinetics，第2版，New York，NY，Marcel Decker，p.445-91982)。由于研究中末段取样有限，所以没有检测T-HALF。
化合物(A)和化合物(B)的平均血浆浓度-时间数据见表2。化合物(A)和化合物(B)的相应图形表示分别见附图1和2。
表2化合物(A)和化合物(B)在狗体内的平均(标准差(SD))血浆浓度 时间a (h) 平均(SD)血浆浓度(ng/mL)b 化合物(A) 化合物(B) IVc口服溶液剂d IVc口服溶液剂d 给药前 0 0 0 0 0.17 1120(189) ---e 0 ----e 0.25 152(9.9) 251(150) 3.8(0.4) 4.1(3.9) 0.33 73.0(4.2) ---e 2.3(0.2) ---e 0.5 38.2(2.8) 335(73.7) 1.4(1.2) 21.3(6.6) 0.75 28.6(1.6) 141(75.8) 0 27.2(3.6) 1 24.7(3.9) 74.1(26.4) 0 23.8(1.7) 1.5 20.1(2.3) n.s.f 0 n.s.f 2 17.4(1.8) 35.5(7.9) 0 8.4(2.7) 4 14.5(1.4) 21.8(6.9) 0 2.8(0.3) 6 12.6(0.9) 17.2(4.7) 0 0.8(1.3) 8 12.6(1.7) 17.6(4.4) 0 0 12 9.5(1.4) 12.8(4.1) 0 0 24 5.7(1.3) 7.5(1.9) 0 0
a表示标称采集时间。认为与标称时间有较小差异对解释整个结果没有明显的影响。
b所有缓冲口服混悬剂的浓度＜LLQ(2ng/mL)并且没有在表中列出。浓度值＜LLQ则为0平均(SD)计算值。如果在指定时间所有狗的浓度＜LLQ，则平均血浆浓度表示为0。
cn＝3。有一只狗的血浆浓度时间特征与10min IV输注剂量不一致，因为其TMAX为1.0h；计算平均值时忽略这只狗。
dn＝3。有一只狗在给药后即呕吐，因此计算平均值时忽略这只狗。
e没有计划采集此时的样品。
f未采集此样品(但非故意)；认为此偏差不会影响整个研究的结论。
化合物(A)和化合物(B)的平均药动学参数分别见表3和表4
表3.狗体内化合物(A)的平均(SD)药动学参数 参数(单位) IVa 口服溶液剂b CMAX(ng/mL) 1120(189) 365(40.9) TMAX(h)c 0.17(0.17，0.17) 0.50(0.25，0.50) AUC(0-T)(h.ng/nt)d 420(36.8) 560(159)
an＝3。有一只狗的血浆浓度-时间数据与10min IV输注剂量不一致，因为其TMAX为1.0h；这只狗未用于药动学分析。
bn＝3。有一只狗在给药后很快呕吐，这只狗未用于作药动学分析。
c中位值(最小值，最大值)。
dT＝24h。
表4.狗体内化合物(B)的平均(SD)药动学参数 参数(单位) IVa 口服溶液剂b CMAX(ng/mL) 3.8(0.42) 27.2(3.6) TMAX(h)c 0.17(0.17，0.17) 0.75(0.75，0.75) AUC(0-T)(h.ng/nt)d 0.69(0.15) 45.2(4.7)
an＝3。有一只狗体内化合物(A)的血浆浓度-时间数据与10min IV输注剂量不一致，因为其TMAX为1.0h；这只狗未用于化合物(A)和化合物(B)的药动学分析。
bn＝3。有一只狗在给药后很快呕吐，这只狗未用于化合物(A)和化合物(B)的作药动学分析。
c中位值(最小值，最大值)。
dT＝24h。
有一只狗的血浆浓度-时间数据与10min IV输注剂量不一致，因为其TMAX为1.0h；这只狗未用于药动学分析。在IV给予化合物(A)后CMAX以及AUC(0-T)的平均值(SD)[n＝3]分别为1120(189)ng/mL和420(36.8)h.ng/nt。在此研究中IV给药后获得的AUC值与在给予狗0.5mg/kg后的初步IV药动学研究(平均值(SD)483(34)h.ng/mL)观测到的AUC值相当接近。
在口服给予缓冲的溶液剂后，有一只狗在给药后很快呕吐，因此这只狗的数据未用于药动学评价。在给予化合物(A)的缓冲的口服溶液剂后，CMAX和AUC(0-T)的平均值(SD)[n＝3]分别为365(40.9)ng/mL和560(159)h.ng./mL。此研究中给予口服溶液剂后获得的AUC平均值是在狗一次性剂量的口服毒性研究中获得剂量标化AUC平均值(257h.ng/mL)的约两倍。尽管用于这两个研究中的口服制剂相同，在该研究中给予的口服溶液剂总体积大约为1.3mL/kg，而在毒性研究中为0.4mL/kg。因此在当前研究中给予的缓冲剂的毫当量是毒性研究中的大约3-倍，这可能是在当前研究中提供了对胃酸(pH)更好的中和作用。化合物(A)为酸不稳定药物，因此在口服给药后，与毒性研究相比在当前研究中具有更高的暴露度有可能是更好保护化合物避免被胃酸降解的原因。在IV和口服溶液剂的剂量都给予并且有药动学参数数据的两只狗，绝对口服生物利用度分别为48.3％和30.6％(平均值＝39.5％)。
化合物(B)的CMAX和AUC(0-T)值说明狗在给予IV和口服溶液剂的剂量后暴露于化合物(B)；狗在给予口服混悬液后没有暴露于化合物(B)。在口服给药后的化合物(B)系统性暴露量明显高于IV给药后的相应量。
上述结果显示有IV和口服药动学参数数据的两只狗，绝对口服生物利用度分别为48.3％和30.6％(平均值＝39.5％)。
实施例6：药学上可接受的酸中和缓冲剂的液体口服制剂
配制的缓冲剂的组成如下： 缓冲剂组合物#1 缓冲剂组合物#2 成 分 用量(g) 用量(g)无水磷酸氢二钠，USP 4.258 5.688柠檬酸钠二水合物，USP 2.941 2.942无水柠檬酸，USP 0.232 0.256蔗糖，NF(任选) 15.00 15.00樱桃调味剂(任选) 0.075 0.075总量 22.5 24.0
上述缓冲剂用140mL水配制获得150mL液体口服剂型。液体口服剂型的pH为7.43±0.07(测量6次)。5个液体口服剂型的平均酸中和能力为49.7(标准差0.17，相对标准差0.34％)。
实施例7：化合物(A)的液体制剂的稳定性
化合物(A)在80∶20丙二醇∶乙醇中的稳定性通过将25mg化合物(A)用80∶20丙二醇∶乙醇稀释获得浓度为2.5mg/mL至12.5mg/mL的液体口服制剂用于评价。然后将所得液体口服剂型在室温(20℃至25℃)和室内光线下以及在冷藏温度(2℃至8℃)下贮存20h。
从开始贮藏起，两种贮藏条件下的液体口服剂型的外观都没有变化。在室温和室内灯光下贮存20小时后观测到杂质/降解产物总量增加以及效能的降低。在冷藏温度贮存20小时后，观测到杂质/降解产物总量有轻微增加。杂质总量变化是由于具有以下结构的噁嗪杂质/降解产物的增加：
样品用HPLC(75mm×4.6mm内径，粒径3.5∶m Waters SymmetryShield RP8柱，用UV在240nm检测)分析。使用10∶L注射体积，色谱柱保持在室温，流动速率1mL/min。分析时间为1h，样品用梯度洗脱液洗脱，水流动相(0.05％醋酸)(流动相A)和乙腈流动相(0.05％醋酸)。洗脱数据见下表。 流动相组分 时间(min) ％A ％B 梯度特征 0 90 10 等度 3 90 10 等度 43 40 60 线性 45 40 60 等度 50 90 10 线性 60 90 10 等度
这些检测结果证明浓度为2.5mg/mL至12.5mg/mL的液体口服剂型可以在室温下贮存达6小时，而在冷藏温度下可贮存达20小时。
实施例8：合成化合物A.
[1S-[1R*，3R*(E)，7R*，10S*，11R*，12R*，16S*]]-7，11-二羟基-8，8，10，12，16-五甲基-3-[1-甲基-2-(2-甲基-4-噻唑基)乙烯基]-4-氮杂-17-氧杂二环[14.1.0]十七烷-5，9-二酮
化合物1：(3S，6R，7S，8S，12R，13S，15S)-15-叠氮基-12，13-桥氧基-4，4，6，8，12，16-六甲基-7-羟基-1 7-(2-甲基-4-噻唑基)-5-氧代-16-十七碳烯酸
将埃坡霉素B(0.35g，0.69mmol)的脱气THF(4.5mL)溶液用催化量(80mg，69mmol)四(三苯基膦)钯(0)处理，将悬浮液在25℃、Ar气氛下搅拌30min。所得嫩黄色均匀溶液全部用叠氮化钠(54mg，0.83mrnol)的经脱气的H2O(2.2mL)溶液一次性处理。将反应混合物升至45℃1h，用H2O(5mL)稀释，用EtOAc(4×7mL)萃取。有机萃取液用饱和NaCl(15mL)水溶液洗涤，用硫酸钠干燥，然后真空浓缩。将残余物用快速色谱法提纯(SiO2，3.0×15cm，95∶5.0∶0.5 CHCl3-MeOH-AcOH)获得无色油状化合物1(0.23g，61％)。MS(ESI+)：551(M+H)+；MS(ESI-)：549(M-H)-.
化合物2：(3S，6R，7S，8S，12R，13S，15S)-15-氨基-12，13-桥氧基-4，4，6，8，12，16-六甲基-7-羟基-17-(2-甲基-4-噻唑基)-5-氧代-16-十七碳烯酸
在25℃将化合物1(0.23g，0.42mmol)的THF(4.0mL)溶液用H2O(23mL，1.25mmol)和聚合物支撑的三苯基膦(Aldrich，2％DVB交联的聚苯乙烯，0.28g，0.84mmol)处理。将所得悬浮液在25℃、Ar气氛下搅拌(32h)，通过Celite垫过滤，真空浓缩。残余物用快速色谱法提纯(SiO2，1.5×10cm，95∶5.0∶0.5至90∶10∶1.0 CHCl3-MeOH-AcOH梯度洗脱)获得无色油状物化合物2(96mg，44％)。MS(ESI+)：525.2(M+H)+；MS(ESI-)：523.4(M-H)-。
或者，在装有化合物1(0.26g，0.47mmol)和PtO2(0.13g，50wt％)的25mL圆底烧瓶中于氩气氛下加入无水EtOH。将所得黑色混合物在1个大气压水蒸汽气氛下搅拌10h，在此之后系统通入氮气净化，再加入PtO2(65mg，25wt％)。将反应混合物再次在水汽下搅拌10h。然后系统用N2净化，反应混合物通过Celite垫过滤，用CH2Cl2(3×25mL)洗脱。真空除去溶剂，将残余物按上述方法提纯获得化合物2(0.19g，75％)。
或者，将化合物1(20mg，36mmol)的THF(0.4mL)溶液在氩气氛下用三苯基膦(19mg，73mmol)处理。将反应混合物升至45℃，搅拌14h，然后冷却至25℃。将所得的亚氨基正膦用氢氧化铵(28％，0.1mL)处理，然后再次将反应混合物升至45℃。4小时后，真空除去挥发分，残余物按照上述方法提纯获得化合物2(13mg，70％)。
化合物A：[1S-[1R*，3R*(E)，7R*，10S*，11R*，12R*，16S*]]-7，11-二羟基-8，8，10，12，16-五甲基-3-[1-甲基-2-(2-甲基-4-噻唑基)乙烯基]-4-氮杂-17-氧杂二环[14.1.0]十七烷-5，9-二酮
在0℃、氩气氛下，将化合物2(0.33g，0.63mmol)的经脱气的DMF(250mL)溶液用固体NaHCO3(0.42g，5.0mmol)和二苯基磷酰基叠氮化物(diphenylposphoryl azide)(0.54mL，2.5mmol)处理。所得悬浮液在4℃搅拌24h，在0℃用磷酸盐缓冲液(250mL，pH＝7)稀释，用EtOAc(5×100mL)萃取。有机萃取液用10％LiCl水溶液(2×125mL)洗涤，用硫酸钠干燥，真空浓缩。残余物首先用快速色谱法提纯(SiO2，2.0×10cm，2-5％MeOH-CHCl3梯度洗脱)，然后用Chromatotron提纯(2mm SiO2，GF转子，2-5％MeOH-CHCl3梯度洗脱)获得无色油状标题化合物(0.13g，40％)：1H NMR(CDCl3，400MHz)*6.98(s，1H)，6.71(d，1H，NH，J＝8.1Hz)，6.56(s，1H)，4.69-4.62(m，1H)，4.18-4.12(m，1H)，4.01-3.96(m，1H)，3.86(s，1H)，3.38-3.34(m，1H)，2.82(dd，1H，J5.6，6.0Hz)，2.71(s，3H)，2.58(s，1H)，2.43(dd，1H，J＝9.0，14.5Hz)，3.34(dd，1H，J＝3.0，14.5Hz)，2.14(s，3H)，2.05-1.92(m，2H)，1.82-1.41(系列多重峰，7H)，1.35(s，3H)，1.28(s，3H)，1.18(d，3H，J＝6.8Hz)，1.14(s，3H)，1.00(d，3H，J＝6.8Hz)；MS(ESI+)：507.2(M+H)+；MS(ESI-)：505.4(M-H)-.
实施例9：化合物A口服给予癌症患者的药动学
晚期恶性肿瘤患者每周进行一次30-min输注给药化合物A(一个疗程＝3次静脉内给药)。患者接受的剂量为1、2.5、5、10、20、25或30mg/m2。以20mg/m2剂量水平开始，化合物A的一次口服剂量在第6天溶于80％丙二醇和20％乙醇(v/v)的溶媒后给予，接着在疗程1前给予柠檬酸盐/磷酸盐缓冲剂(22.5gm)以评价化合物A的绝对生物利用度。第6天口服给予化合物A的剂量与第1天IV给予化合物A的剂量一样。在疗程1的第6天和第1天采集系列血浆样品用LC/MS/MS评价药动学。LC/MS/MS检测与实施例1使用相同的方法。
口服给予的化合物A(25mg/小瓶)以“瓶装药物”提供。用于溶解稀释化合物A的溶媒(缓冲液)(25mg/小瓶)为80％丙二醇和20％乙醇(v/v)的混合物。丙二醇/乙醇混合物如下制备：将80份(体积)丙二醇和20份(体积)乙醇在适当容器中混合，轻轻旋转容器直到溶液完全混合。
在化合物A后口服给予的柠檬酸盐/磷酸盐缓冲剂装在单独的瓶中。用于化合物A的缓冲剂用注射用水(WFI)溶解稀释。
如下制备给予患者的化合物A：根据给予患者的剂量，用适当的注射器将2.5、5或10mL丙二醇/乙醇混合物缓慢注射到装有25mg化合物A的20cc小瓶中分别获得浓度为10、5或2.5mg/mL的制剂。取出注射器，剧烈振荡小瓶10秒。将小瓶置于超声波浴中，超声波处理直到溶液变澄清。根据剂量合并小瓶溶液。
与化合物A一起给予的缓冲剂装于8oz.透明玻璃瓶中，用注射用水(WFI)稀释溶解。将缓冲剂瓶上的儿童安全盖除去，加入约140mL注射用水(WFI)。剧烈振荡玻璃瓶或者在间歇振荡下用超声波处理直到获得澄清溶液。
在第6天口服给药后，根据以下时间表(表示为开始口服给药后的小时:分钟)将7mL血液样品采集到含有K3EDTA抗凝剂的BectonDickinson Vacutainer管(淡紫色盖)：给药前、00:15、00:30、00:45、1:00、1:30、2:00、3:00、4:00、6:00、8:00、24:00、48:00以及72:00。在第1天IV给药后，根据以下时间表(表示为开始IV给药后的小时:分钟)将7mL血液样品采集到含有K3EDTA抗凝血剂的BectonDickinson Vacutainer管(淡紫色盖)：给药前、00:15、00:30(输注结束)、00:45、1:00、1:30、2:00、3:00、4:00、6:00、8:00、24:00、48:00以及72:00。
血液采集完成后立即将Vacutainer管翻转几次以确保与抗凝血剂混合，然后立即放在碎冰上。采集后30分钟内将样品在0-5℃以约2000xg离心5分钟。然后将血浆转移到单独预先标记的螺盖聚丙烯管中，在-70℃贮存直到生物分析。用LC/MS/MS检测法按照实施例1的介绍分析化合物A的血浆浓度。
血浆浓度-时间数据用非区室法分析。化合物A的药动学参数检测包括观测到的最大血浆浓度(Cmax)、达到Cmax的时间(Tmax)、从时间0到最后取样时间T的血浆浓度-时间曲线下的面积(AUC(0-T))。
总共18个患者接受了化合物A溶液剂，在第6天口服给予，在第一天为IV给药。从这些患者得到的药动学结果的总结见表5。
表5.患者口服和静脉内给药后的药动学总结剂量(mg/m2) 20 25 30 N 3 11 4 给药途径 IV 口服 IV 口服 IV 口服 制剂 IV 口服溶 液剂 IV 口服溶 液剂 IV 口服溶 液剂 CMAXa (ng/mL) 251 (108) 142 (106) 447 (189) 180 (110) 711 (530) 274 (104) TMAXb (h) 0.25(0.25，0.25) 1.0(0.25，1.50) 0.50(0.25，050) 0.50(0.25，3.00) 0.50(0.25，0.50) 0.50 (0.25，0.75) AUC(0-T)a，c (h.ng/mL) 796 (587) 404 (381) 848 (284) 533 (284) 1155 (292) 708 (291) ％Fa NA 43.5(16.1) NA 55.6(18.4) NA 62.2(25.1)
a平均值(SD)
b中位数(min，max)
c表示AUC(0-T)
本发明上述实施方案仅用于示例性说明，只需使用常规的试验方法、许多等同具体化合物、原料和方法，本领域熟练技术人员就能够认同或者能够理解本发明。所有这样的等价内容都被认为是包括在本发明范围内并包括在所附的权利要求内。