低剂量熊果酸作为治疗糖尿病早期肾脏病变药物的用途 【技术领域】
本发明涉及低剂量熊果酸作为治疗糖尿病并发症药物的用途，特别是涉及作为治疗糖尿病早期肾脏病变药物的用途。
背景技术
糖尿病肾病是糖尿病微血管并发症之一，是造成糖尿病患者慢性肾病和晚期肾衰竭的主要原因。造成糖尿病肾病的原因众多，包括糖尿病引起的肾组织的血流动力学改变(包括肾素-血管紧张素和激肽-前列腺素-血栓素对肾血管的血流调节失去平衡)、糖尿病引起肾组织的生化代谢紊乱(包括多元醇途径升高、蛋白质非酶糖基化增加、脂质代谢紊乱等)及部分糖尿病患者同时具有高血压的症状等等。约20-30％的糖尿病患者患有肾病，早期表现为尿中排出微量白蛋白，继之出现大量蛋白尿，最后进展为肾功能不全，需要通过透析甚至换肾以维持生命。糖尿病引起的肾衰竭是目前糖尿病患者死亡的主要原因之一。
目前糖尿病肾病的治疗关键在于早期诊断及防御性治疗。研究表明患者一旦出现了临床大量蛋白尿症状，糖尿病造成的肾脏的损害往往就难以逆转。如果能够在糖尿病患者大量蛋白尿出现前采取措施，就能积极地延缓糖尿病患者的临床症状和后期的肾衰竭。鉴于全世界范围内无论是1型还是2型的糖尿病患者的数量均在显著增加，寻找到治疗糖尿病肾病的方法已十分迫切和重要。
熊果酸(Ursolic acid)是一类三萜类化合物，广泛存于山楂、女贞子等多种天然植物中。近几年的研究发现，熊果酸具有多种生物活性，在抗癌、防癌、保肝、抗菌、抗病毒、抗氧化等方面均有一定的作用，具有良好的开发利用前景。目前熊果酸在糖尿病中的运用主要是集中在高剂量熊果酸所具有的降糖作用上。在动物水平上特别是在不影响非空腹血糖水平的情况下，低剂量熊果酸是否能显著抑制糖尿病引起的肾小球肥大和IV型胶原在肾小球的堆积并作为治疗糖尿病早期肾脏病变的药物，还没有研究报道过。
【发明内容】
本发明的目的在于弥补上述现有技术的不足，提供一种低剂量熊果酸作为治疗糖尿病早期肾脏病变药物的用途。
实现本发明目的的技术方案是：低剂量熊果酸作为治疗糖尿病早期肾脏病变药物的用途，给药方式为口服，给药剂量为50-70mg/kg体重。
糖尿病啮齿动物是用于研究糖尿病的主要动物模型，而链脲佐菌素诱导的1型糖尿病(胰岛素依赖性)啮齿动物模型已非常成熟，并被广泛地运用于研究各种糖尿病并发症。在该模型中，糖尿病小鼠与临床糖尿病病人在肾脏病变的早期表现上相似：都具有肾小球病理性肥大、肾小球系膜细胞增生、肾小球基质蛋白沉积导致的基底膜增厚等重要早期病理现象，而这些都是最终导致肾小球硬化和肾衰竭重要原因。目前普遍认为，能够抑制这些早期病理现象的药物也许可以延缓甚至抑制糖尿病肾病后期的大量蛋白尿和肾衰竭的出现。
本发明研究了口服低剂量的熊果酸对糖尿病引起的肾小球病理性肥大、肾小球基质蛋白沉积导致的基底膜增厚等重要早期病理现象的作用效果以及对糖尿病的肾脏早期病变相关通路的作用效果。研究证实，口服低剂量的熊果酸在不降低非空腹血糖的同时，对糖尿病早期肾脏病变有着显著的治疗效果：主要表现在抑制糖尿病引起的肾小球肥大和IV型胶原在肾小球的堆积，而这两个现象正是糖尿病早期肾脏病变最主要的病理现象。本发明还证明了熊果酸对由糖尿病诱导的肾脏中MAPK通路中ERK1/2和JNK通路的激活具有显著的抑制作用，对由糖尿病诱导的肾脏中STAT3酪氨酸的磷酸化水平有显著的抑制作用，并对由糖尿病诱导的肾脏中iNOS的表达有显著的降低作用。而这些通路的激活和改变都被证明与糖尿病的肾脏早期病变相关。本发明中熊果酸为低剂量，副作用小，喂食熊果酸3个月对实验小鼠的生理特性无显著性影响。
【附图说明】
图1为口服熊果酸抑制糖尿病导致的肾小球肥大地结果图(*p＜0.05与非糖尿病小鼠相比；**p＜0.05与糖尿病小鼠相比)。
图2为口服熊果酸抑制糖尿病导致的IV型胶原在肾小球中的堆积结果图(*p＜0.05与非糖尿病小鼠相比；**p＜0.05与糖尿病小鼠相比)。
图3-A为蛋白质印迹法检测磷酸化的ERK1/2和相应总蛋白表达水平在肾皮质部分变化的结果图。
图3-B为口服熊果酸抑制糖尿病导致的ERK1/2通路在肾脏皮质中激活的量化结果图(*p＜0.05与非糖尿病小鼠相比；**p＜0.05与糖尿病小鼠相比)。
图4-A为蛋白质印迹法检测磷酸化的JNK和总JNK的蛋白表达水平在肾皮质部分变化的结果图。
图4-B为口服熊果酸抑制糖尿病导致的JNK通路在肾脏皮质中激活的量化结果图(*p＜0.05与非糖尿病小鼠相比；**p＜0.05与糖尿病小鼠相比)。
图5-A为蛋白质印迹法检测磷酸化的STAT3表达水平在肾皮质部分变化的结果图。
图5-B为口服熊果酸抑制糖尿病导致的STAT3转录活性在肾脏皮质中激活的量化结果图(*p＜0.05与非糖尿病小鼠相比；**p＜0.05与糖尿病小鼠相比)。
图6-A为蛋白质印迹法检测肾脏皮质中iNOS的表达水平的结果图。
图6-B为口服熊果酸抑制糖尿病导致的iNOS的表达量在肾脏皮质中的增加的量化结果图(*p＜0.05与非糖尿病小鼠相比；**p＜0.05与糖尿病小鼠相比)。
【具体实施方式】
下面通过具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
以下实施例中所用的百分比浓度如无特别说明，均为质量百分比浓度。
本发明实施例中所使用的熊果酸由南京替斯艾么中药技术研究所生产。将30只C57BL小鼠(从武汉大学动物实验中心购置)随机分成3组：一型糖尿病小鼠组，熊果酸喂养的糖尿病小鼠组，和非糖尿病小鼠组，每组十只。
所用的1型糖尿病小鼠模型为链脲佐菌素诱导：
1.链脲佐菌素注射剂量：60mg链脲佐菌素/kg小鼠体重(链脲佐菌素购于美国Amresco公司)。
2.动物注射方式：采用小鼠腹腔注射，连续注射5天。
3.糖尿病小鼠的判定：完成链脲佐菌素腹腔注射7天后，从小鼠尾部静脉取血，采用OneTouch血糖仪测定血糖。当血糖大于250mg/dl时，即认为该小鼠为糖尿病小鼠。
所用熊果酸给药方式和剂量：
熊果酸按0.01％质量/质量与小鼠粉状食物混合均匀后，挤压成块。无摄取限制地喂食糖尿病小鼠，并每星期记录给药食物的消耗量，经计算表明每只小鼠的熊果酸给药剂量为50-70mg/kg体重。
所采用的指标体系：
实验小鼠的各种生理特性的检测(包括体重、血糖、肾重量以及肾重量/体重)；采用PASH染色法以计算肾小球的体积；采用IV型胶原免疫组织染色法来半定量IV型胶原在肾小球的堆积；采用蛋白质印迹反应以定量ERK和JNK通路、STAT3通路在肾脏皮质中的激活水平；采用蛋白质印迹反应以定量iNOS在肾脏皮质中的表达。
实施例1：口服熊果酸对糖尿病小鼠各种生理特性的影响
熊果酸喂养糖尿病小鼠3个月后，测量各实验组小鼠的体重，并尾部静脉取血测定血糖水平。称取每组小鼠的肾脏重量，并计算肾脏重量/体重，结果见表1。
表1.小鼠生理特性实验结果
组别(样本量) 体重(g) 血糖(mmol/dl) 肾脏重量(mg) 肾脏重量/ 体重(％) 糖尿病组(10) 22.9±1.6a 27.2±5.6a 178.6±19.6a 0.78±0.10a 糖尿病组+口服熊果酸(10) 24.2±1.2a 23.0±4.4a 177.6±14.4a 0.74±0.07a 非糖尿病组(10) 27.5±2.3 11.2±1.4 163.8±20.3 0.60±0.07
注：表1中a表示p＜0.05，即与非糖尿病小鼠相比有显著性差异。
实验结果显示虽然链脲佐菌素诱导的1型糖尿病小鼠与非糖尿病小鼠相比，表现出显著性的体重下降和高血糖水平，以及肾脏重量升高和肾脏重量/体重升高。但口服熊果酸对于糖尿病小鼠的这些生理特性无显著性影响，表明下文所述的口服熊果酸对糖尿病小鼠肾脏的保护作用并非是通过减缓糖尿病的严重程度而达到的。
实施例2：口服熊果酸对糖尿病导致的肾小球肥大的抑制作用
肾小球是肾脏里最主要的超滤器官，它保持了血液和尿液里低浓度的蛋白水平，以此来保证机体正常功能。由于糖尿病中，肾小球超负荷进行超滤工作，造成了肾小球的病理性肥大。
将各实验组小鼠的肾脏用10％的中性甲醛固定后，进行常规石蜡包埋。肾脏切片进行PASH染色。每个小鼠的肾脏切片中随机选取25-35个肾小球，在400倍放大倍数的视野下，用配备CCD的Olympus BX60显微镜照相后，利用ImagePlus 6.0软件测量每个肾小球的面积。而肾小球的体积则用以下公式计算：肾小球的体积(Vg)＝β/k[肾小球的面积]3/2，其中β和k均为常数。计算后，取每个实验组的肾小球的平均体积和标准差，并以非糖尿病组的肾小球的平均体积为标准，设为1。结果见图1。
结果显示与非糖尿病组相比，3个月的糖尿病造成了肾小球轻微但显著的肥大(与非糖尿病组相比有37％的增加)。口服熊果酸显著地降低了由糖尿病造成的肾小球体积增大(与糖尿病组相比有65％的下降)。
实施例3：口服熊果酸对糖尿病导致的IV型胶原在肾小球中的堆积的抑制作用
细胞外基质蛋白在肾小球中的堆积是造成肾小球硬化和糖尿病后期肾衰竭的主要原因之一。IV型胶原是肾细胞外基质蛋白的主要蛋白之一。IV型胶原在肾脏中的表达量采用免疫组化的方法来测定。常规的肾脏石蜡切片经过二甲苯和不同浓度的乙醇复水后，用3％的双氧水来封闭内源性的过氧化物酶的活性。切片经过2％的羊血清封闭后，用IV型胶原的抗体(美国Rockland公司)在4℃孵育过夜。经PBST洗涤，用相对应的二抗常温孵育1小时。切片经ABC试剂盒(美国Vector laboratories公司)进行信号放大，IV型胶原的阳性染色通过DAB底物显色反应后利用显微镜观察。在每个小鼠肾脏切片中随机选取20-25个肾小球，在400倍放大倍数的视野下，用配备CCD的OlympusBX60显微镜照相。根据IV型胶原的阳性染色的程度，将每个肾小球IV型胶原的表达量分为0-4级(0级为无阳性染色)。由两个不知小鼠分组情况的研究者对所有的肾小球IV型胶原的表达量分别进行独立分级鉴定。最终，取每个实验组的肾小球IV型胶原表达级别的平均值和标准差，并以非糖尿病组的平均肾小球IV型胶原的表达级别为标准(设为1)，结果见图2。
如图2结果所示，与非糖尿病组相比，3个月的糖尿病后，小鼠肾脏表现出3倍的肾小球IV型胶原的表达级别的增加。口服熊果酸显著性地降低了由糖尿病造成的肾小球IV型胶原的表达级别的增加(与糖尿病组相比有75％的下降)。
实施例4：口服熊果酸抑制了糖尿病导致的ERK1/2通路在肾脏皮质中的激活
ERK1/2通路在细胞生长、分化、炎症等生物学过程中发挥了重要作用。有报道指出，ERK1/2通路在糖尿病肾病中起举足轻重的作用。由于ERK通路的激活是由ERK1/2蛋白的磷酸化水平来调控的。因此，本实施例通过蛋白质印迹法定量检测磷酸化的ERK1/2和相应的总蛋白水平在肾皮质部分的变化程度。
在解剖显微镜下将肾脏的皮质部分切下后置于RIPA缓冲液(购自碧云天公司)中超声破碎。总蛋白质浓度用BCA蛋白定量法定量。等量的蛋白经过SDS-PAGE电泳后，转印到纤维素膜上(美国Bio-rad公司)。纤维素膜经过2％的脱脂牛奶封闭后，用抗磷酸化的ERK1/2和抗总ERK1/2的抗体分别进行孵育。漂洗经抗体孵育的纤维素膜，再加入相对应的二抗进行孵育。用ECL试剂进行反应后，抗体识别的蛋白条带可经过曝光后在X光片上显示，见图3-A。用Quantity One 1-D分析软件(美国Bio-rad公司)对蛋白条带进行定量分析。对磷酸化ERK1/2的蛋白条带的灰度进行计算后，取每个实验组的磷酸化ERK1/2表达量的平均值和标准差，并以非糖尿病组的平均值为标准(设为1)，结果见图3-B。
如图3-A、3-B所示，与非糖尿病组相比，糖尿病组显著性地增加了pho-ERK1/2(2.5倍)的表达，而对总的ERK1/2的表达并无显著影响。口服熊果酸显著地抑制了糖尿病诱导的ERK1/2(与糖尿病组相比有60％的降低)的磷酸化水平；然而口服熊果酸组对于总的ERK1/2表达无显著性差异。
实施例5：口服熊果酸抑制了糖尿病导致的JNK通路在肾脏皮质中的激活
JNK通路在细胞受到外界压力刺激时发挥着重要作用。有报道指出，JNK通路的激活在糖尿病引起的肾小球系膜细胞增生和肾小球基质蛋白沉积导致的基底膜增厚等病理变化中起举足轻重的作用。本实例通过蛋白质印迹法定量检测磷酸化的JNK和总JNK的蛋白水平在肾皮质部分的变化程度。
等量的蛋白经过SDS-PAGE电泳后，转印到纤维素膜上(美国Bio-rad公司)。纤维素膜经过2％的脱脂牛奶封闭后，用抗磷酸化的JNK和抗总JNK的抗体分别进行孵育。漂洗经抗体孵育的纤维素膜，再加入相对应的二抗进行孵育。用ECL试剂进行反应后，抗体识别的蛋白条带可经过曝光后在X光片上显示，见图4-A。用Quantity One 1-D分析软件(美国Bio-rad公司)对蛋白条带进行定量分析。对磷酸化JN的蛋白条带的灰度进行计算后，取每个实验组的磷酸化JNK表达量的平均值和标准差，并以非糖尿病组的平均值为标准(设为1)，结果见图4-B。
如图4-A、4-B所示，与非糖尿病组相比，糖尿病组显著性地增加了pho-JNK(25倍)的表达，而对总的JNK的表达并无显著影响。口服熊果酸显著地抑制了糖尿病诱导的JNK(与糖尿病组相比有73％的降低)的磷酸化水平；然而，口服熊果酸对于总的JNK的表达无显著性差异。
实施例6：口服熊果酸抑制糖尿病导致的STAT3转录活性在肾脏皮质中的激活
STAT3是一个调节细胞因子信号的转录因子。研究表明STAT3的转录活性被其酪氨酸705号位点的磷酸化所调控。最近有报告表示STAT3的转录活性与糖尿病肾病病变过程密切相关。本实例通过蛋白质印迹法来定量检测磷酸化的STAT3在肾皮质部分的变化程度。
等量的蛋白经过SDS-PAGE电泳后，转印到纤维素膜上(美国Bio-rad公司)。纤维素膜经过2％的脱脂牛奶封闭后，用抗磷酸化的STAT3的抗体分别孵育。漂洗经抗体孵育的纤维素膜，再加入相对应的二抗进行孵育。用ECL试剂进行反应后，抗体识别的磷酸化STAT3蛋白条带可经过曝光后在X光片上显示，见图5-A。用Quantity One 1-D分析软件(美国Bio-rad公司)对磷酸化STAT3蛋白条带进行定量分析。取每个实验组的磷酸化STAT3表达量的平均值和标准差，并以非糖尿病组的平均值为标准(设为1)，结果见图5-B。
如图5-A、5-B所示，与非糖尿病组相比，糖尿病引起了STAT3酪氨酸磷酸化水平显著性的增加(1.7倍)。口服熊果酸则显著性地抑制了糖尿病诱导的STAT3酪氨酸磷酸化水平的增加(与糖尿病组相比有63％的降低)。
实施例7：口服熊果酸抑制了糖尿病诱导的iNOS的表达量在肾脏皮质中的增加
慢性炎症反应被认为是造成糖尿病肾脏病变的原因之一。iNOS是炎症反应的主要调节蛋白之一。本实例中蛋白质印迹法被用于量化肾脏皮质中iNOS的表达水平。
等量的蛋白经过SDS-PAGE电泳后，转印到纤维素膜上(美国Bio-rad公司)。纤维素膜经过2％的脱脂牛奶封闭后，用抗iNOS的抗体分别进行孵育。漂洗经抗体孵育的纤维素膜，再加入相对应的二抗进行孵育。用ECL试剂进行反应后，抗体识别的iNOS蛋白条带可经过曝光后在X光片上显示，见图6-A。用Quantity One 1-D分析软件(美国Bio-rad公司)对iNOS蛋白条带进行定量分析。取每个实验组的iNOS表达量的平均值和标准差，并以非糖尿病组的平均值为标准(设为1)，结果见图6-B。
如图6-A、6-B所示，与非糖尿病组相比，糖尿病引起了iNOS水平显著性的增加(2.9倍)。口服熊果酸则显著性地抑制了糖尿病诱导的iNOS水平的增加(与糖尿病组相比有73％的降低)。
综上所述，本发明所证明的口服低剂量熊果酸对糖尿病早期肾脏病变的有明显的治疗效果，有望作为今后熊果酸用于糖尿病患者的肾脏病变的治疗或某些症状的缓解的基础。