还原敏感性的两亲性嵌段共聚物及其胶束 【技术领域】
本发明涉及一种还原敏感性的两亲性嵌段共聚物及其制备方法和其形成的胶束和胶束装载药物。
背景技术
聚合物胶束是由两亲性高分子共聚物在水溶液中自组装形成的纳米粒子，由于它载药范围广、在体内具有长循环等特点，在过去十多年里作为水难溶性药物如抗肿瘤药物载体已被广泛研究。目前将水难溶性抗肿瘤药物有效地装载到聚合物胶束里的方法主要使用透析法或溶剂挥发法[Rapoport N，Physical stimuli-responsive polymeric micelles foranti-cancer drug delivery，PROGRESS IN POLYMER SCIENCE，2007，32(8-9)，962-990]。透析法为实验室制备聚合物胶束的经典方法，但一般透析法药物装载包封效率不高，没有被包封的在水中的药物回收困难，不是很适用于工业化大规模生产[Soga，O.Biodegradable thermosensitive polymers：synthesis，characterization and drug deliveryapplications，Ph.D Thesis，Utrech University，2006]。由于大多数所用聚合物是水不溶的，也难溶于乙醇，透析法或溶剂挥发法一般使用有毒的有机溶剂溶解聚合物，这样溶剂的彻底除去将很不容易。
目前癌症化疗中最困难的问题之一在于肿瘤的多药耐药(multidrug resistance，MDR)性，但载有抗肿瘤药物的聚合物胶束通过细胞内吞作用(endocytosis)绕开P-糖蛋白(P-glycorprotein)避免药物经胞外分泌(exocytosis)外流，可以被具有多药耐药性的肿瘤细胞大量吸收，通过细胞靶向和细胞质内可控释放抗肿瘤药物是降低肿瘤化疗对正常细胞伤害和克服肿瘤化疗中耐药性问题的关键。因此需要设计和合成一种全新型的多功能聚合物胶束纳米粒子，它在储存运输和体液循环时很稳定地包覆药物，经肿瘤靶向进入细胞后很快降解释放出所载的有毒药物。实现这一目标的最佳选择是引入含双硫键的连接，因为双硫键在体液循环时稳定(大约相当于2μM二硫苏糖醇DTT浓度)，在细胞内还原条件下(大约相当于10mM DTT浓度)很快裂解断裂[Chari R.V.J.Targetedcancer therapy：conferring specificity to cytotoxic drugs，Accounts of Chemical Research，2008，41(1)，98-107]。日本Kataoka等最近综述了使用高分子胶束装载抗癌药物用于预临床和临床的研究进展[Yasuhiro Matsumura，and Kazunori Kataoka，Preclinical and clinicalstudies of anticancer agent-incorporating polymer micelles，Cancer Sci，2009，100(4)，572-579]，但未涉及引入含双硫键连接的高分子胶束药物载体。
【发明内容】
本发明所要解决的问题是提供一种还原敏感性的两亲性嵌段共聚物及其胶束；该共聚物毒性很低；并且可以溶解在毒性很低的溶剂乙醇中，或者可以溶解在低温的水中；使用该共聚物制备胶束和装载药物方法简单，药物装载包封效率很高，并且不需要使用有毒的有机溶剂。
本发明提供的技术方案是：一种还原敏感性的两亲性嵌段共聚物，其结构为：
其中R1＝H，或者CH3；R2＝H，或者CH3；R3为憎水性基团；m为聚乙二醇的聚合度，取值范围为20-1000；n＝2-18；x∶y为3-0.25；还原敏感性的两亲性嵌段共聚物的分子量在5千-30万之间。
这种还原敏感性的两亲性嵌段共聚物，含亲水段组分聚乙二醇和疏水段组分，其中疏水段组分含有还原可降解的双硫键连接憎水性基团侧链的单体单元和甲基丙烯酸聚乙二醇酯或者丙烯酸聚乙二醇酯单体单元，该疏水段组分在还原条件下因双硫键连接断裂失去憎水性基团使疏水段组分转变成亲水性。通过自由基共聚合制备，通过核磁共振谱测试共聚物的单体单元的组成(x、y的比例)，通过凝胶渗透色谱GPC测试共聚物的分子量。其中m、n的值分别由所用大分子引发剂和原料单体确定。
还原敏感性两亲性嵌段共聚物中的亲水段组分优选含有聚合度m的取值范围为40-700的聚乙二醇；疏水段组分中的甲基丙烯酸聚乙二醇酯或者丙烯酸聚乙二醇酯单体单元中的聚乙二醇的聚合度n优选为3-12；疏水段组分中的亲水性单体单元甲基丙烯酸聚乙二醇酯或者丙烯酸聚乙二醇酯与疏水段组分中的憎水性基团单元的摩尔比例范围优选为x∶y＝1.5-0.67；还原敏感性的两亲性嵌段共聚物的分子量优选范围在1万-15万之间。
本发明还提供了一种制备上述还原敏感性共聚物的方法，根据文献[NERADOVIC D，VAN NOSTRUM CF，HENNINK WE，Thermoresponsive polymeric micelles with controlledinstability based on hydrolytically sensitive N-isopropylacrylamide copolymers，MACROMOLECULES，2001，34(22)，7589-7591]合成了含聚乙二醇亲水性的大分子引发剂4，4′-偶氮二(4-氰基戊酸)甲氧基聚乙二醇酯PEG2-ABCPA(如下式)，通过单叔丁氧甲酰基(Boc)胱胺和甲基丙烯酰氯或者丙烯酰氯反应合成得到含双硫键及憎水性基团的(甲基)丙烯酰胺类疏水性单体。用该大分子引发剂PEG2-ABCPA引发甲基丙烯酸聚乙二醇酯单体或者丙烯酸聚乙二醇酯单体，和单叔丁氧甲酰基胱胺甲基丙烯酰胺单体(Boc-Cyst-MAAm，如下式)或者单叔丁氧甲酰基胱胺丙烯酰胺单体，在DMF溶剂中和在50-90℃(更优选60-80℃)下反应进行普通自由基共聚合。其中PEG2-ABCPA中聚乙二醇的聚合度m为20-1000，优选聚合度m的取值范围为40-700。疏水段组分中的甲基丙烯酸聚乙二醇酯或者丙烯酸聚乙二醇酯单体单元中的聚乙二醇的聚合度n为2-18(n优选为3-12)；疏水段组分中的亲水性单体单元甲基丙烯酸聚乙二醇酯或者丙烯酸聚乙二醇酯与疏水段组分中的憎水性基团单元的摩尔比例范围为x∶y＝3-0.25(优选范围为x∶y＝1.5-0.67)；还原敏感性的两亲性嵌段共聚物的分子量在5千-30万之间(优选范围在1万-15万之间)。
本发明还提供了另一种制备本发明的还原敏感性共聚物的方法，先用2-溴异丁基酰溴与单甲氧基聚乙二醇酯化合成了含聚乙二醇亲水性的ATRP大分子引发剂2-溴异丁酸单甲氧基聚乙二醇酯，再在催化剂溴化亚铜和配体等存在下引发甲基丙烯酸聚乙二醇酯单体或者丙烯酸聚乙二醇酯单体，和单叔丁氧甲酰基胱胺甲基丙烯酰胺单体或者单叔丁氧甲酰基胱胺丙烯酰胺单体的ATRP共聚合，这里ATRP指原子转移自由基活性聚合，所用单甲氧基聚乙二醇的聚合度为40-700；共聚物地分子量在5千-10万之间，不同单体的使用比例及单体与大分子引发剂的比例与上述普通自由基聚合一样。
还原敏感性两亲性嵌段共聚物中的R3选自叔丁氧甲酰基，苯甲酰基，苯乙酰基，肉桂酰基(C6H5CH＝CHCO-)，甲基丙烯酰基，邻苯甲酸甲酰基(o-HOOC-C6H4-CO-)等憎水性基团或者它们的混合结构。该类憎水性基团可以在合成单体时先由(甲基)丙烯酰氯与胱胺反应后通过酰化反应引入，再共聚合制得还原敏感性两亲性嵌段共聚物；也可以先合成含有单叔丁氧甲酰基胱胺(甲基)丙烯酰胺单体单元的还原敏感性两亲性嵌段共聚物，再将该聚合物溶于二甲基甲酰胺(DMF)和三氟乙酸中脱去叔丁氧甲酰基得到胺，该侧链的胺再与苯甲酰氯、苯乙酰氯、肉桂酰氯、甲基丙烯酰氯或者邻苯二甲酸酐(见合成共聚物例6)、马来酸酐等反应引入不同的憎水性基团。其中若引入肉桂酰氯、甲基丙烯酰氯或者马来酸酐等含有双键的憎水基团0.2-10％(摩尔比)，它们可以在自由基引发剂引发或者经紫外照射交联，在该共聚物载药形成胶束粒子后进行交联，可以提高载药胶束的稳定性；也可引入0.2-10％(摩尔比)靶向基团如叶酸和抗体，提高载药胶束的肿瘤靶向传递特性；还可引入0.2-10％(摩尔比)的荧光基团进入该共聚物，以便示踪纳米粒子。
本发明还提供了一种基于所述的还原敏感性共聚物制备聚合物胶束及其方法，由于所述的共聚物能溶于毒性很低的溶剂，如可用于人体注射的溶剂乙醇，但不溶解于水中，通过将该共聚物溶液直接加入水中即形成胶束纳米粒子；或者所述的两亲性共聚物是具有最低临界溶解温度(lower critical solution temperature，LCST)的热敏性聚合物，即在较低的温度时，可溶解于水中，但在高于它的LCST不溶于水而聚集成胶束，这样通过简单的加热方法，将在低温水中溶解的还原敏感性共聚物水溶液快速加热到50-70℃即可形成胶束纳米粒子，这里的低温是指0-20℃；该方法明显不同于传统的制备胶束的透析法和溶剂挥发法，所形成的胶束粒子的粒径在40-600纳米。
本发明还提供了一种基于所述的还原敏感性两亲性共聚物通过形成胶束装载药物的方法及胶束装载药物，通过简单的加热方法，将在低温水中溶解的还原敏感性共聚物水溶液和药物在低温下混合并快速加热到50-70℃形成胶束纳米载药粒子，这里的低温是指0-20℃；或者使用毒性很低的溶剂溶解还原敏感性共聚物和药物，再加入水中形成胶束纳米载药粒子，该溶剂为环境友好，可以用于人体注射的溶剂如乙醇，或者经冷冻干燥容易除去的溶剂叔丁醇；载药胶束粒子的粒径在40-600纳米。该方法明显不同于传统的制备载药胶束的透析法和溶剂挥发法，本发明所述方法工艺简单并且药物装载包封效率很高(见下述胶束载药例9)。可使用的药物可以包括以下列举的任何一种或者几种化合物，这些化合物能以一种稳定方式被聚合物胶束所包载，并能以医疗中有效剂量被给药。本发明中优选疏水性药物，包括抗肿瘤药物紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、阿霉素或者它们的混合物。本发明中制得的共聚物载药胶束纳米粒子水分散液，可经冻干得到粉末，可以再分散在用于人体注射用水溶液如pH为7.4的磷酸钠缓冲水溶液，0.9％的氯化钠水溶液，或者5％葡萄糖水溶液。本发明中的所指的水，不局限于纯水，可以是用于人体注射用水溶液如pH为7.4的磷酸钠缓冲水溶液，0.9％的氯化钠水溶液，或者5％葡萄糖水溶液等。本发明合成还原敏感性两亲性嵌段共聚物，通过所述的简单方法制备装载药物胶束纳米粒子，所得的载药粒子在储存运输和体液循环时很稳定地包覆药物；在模拟细胞还原条件下因双硫键连接断裂失去憎水性基团使疏水段组分转变成亲水性，胶束破坏，胶束所载药物很快释放(图3)，实现细胞内可控快速释放药物的目标。在共聚物中连上肿瘤靶向基团如叶酸和抗体，则靶向进入肿瘤细胞后由于细胞内还原环境会很快降解释放出所载的有毒药物，避免化疗药物对人体正常组织细胞的伤害。
本发明披露了一种具有还原敏感性的两亲性嵌段共聚物及其制备方法，该共聚物疏水段组分含有还原可降解的双硫键连接憎水性基团侧链的单体单元，这种疏水段组分在细胞还原条件下因双硫键连接断裂失去憎水性基团使疏水段组分转变成亲水性；并且该共聚物可以溶解在毒性很低的溶剂乙醇中，或者可以溶解在低温的水中；使用该共聚物制备胶束和装载药物的方法很简单，药物装载包封效率很高，并且不需要使用有毒的有机溶剂，因为有机溶剂可能会带来有害副作用并且需要通过蒸发或者透析加以除去。共聚物本身因为可降解毒性很低。制得的载药胶束粒子在储存运输和体液循环时很稳定，具有细胞内可控释放的能力。
【附图说明】
图1为本发明DLS测试共聚物PEG-P1胶束(2.0mg/mL)在37℃和pH＝7.4的PBS缓冲溶液中的稳定性结果图；其中图1a为胶束粒径和光散射强度随时间的变化；图1b为含有10mM DTT(二硫苏糖醇)的胶束溶液粒径和光散射强度随时间的变化；图1c为有(黑线)和无DTT(空心三角形)时胶束粒径分散指数的变化。
图2为本发明DLS测试PEG-P1胶束载紫杉醇药9.85％的纳米粒子在37℃和pH＝7.4的加入含有10mM DTT的PBS缓冲溶液中粒径及其分散指数和光散射强度随时间的变化图。聚合物浓度为2.0mg/mL。
图3为本发明加入(实心圆球点)和没有加入DTT(虚线空心正方形)对聚合物PEG-P1胶束载紫杉醇药9.85％的分散液保有的药物百分比的影响，在37℃和pH＝7.4的PBS缓冲溶液，聚合物浓度为2.0mg/mL。
图4为本发明PEG-P1胶束载紫杉醇药9.85％的纳米粒子在37℃的pH＝7.4的磷酸钠缓冲溶液中的体外释药特性(图示数据为三次独立实验的平均值和标准方差)。
【具体实施方式】
从以下说明性实施例将进一步接解释本发明，但它们不是对权利要求的限制。
实施例
合成共聚物例1：先将4，4′-偶氮二(4-氰基戊酸)(4，4’-Azobis(4-cyanovalericacid))与一端带甲氧基的聚乙二醇5000(mPEG5000)反应制备4，4′-偶氮二(4-氰基戊酸)甲氧基聚乙二醇酯大分子自由基引发剂(PEG2-ABCPA)[Neradovic D，vanNostrum CF，Hennink WE.Thermoresponsive polymeric micelles with controlled instabilitybased on hydrolytically sensitive N-isopropylacrylamide copolymers，MACROMOLECULES，2001，34(22)，7589-7591]。将甲基丙烯酸聚乙二醇酯(PEG-MEMA，Mn～300，CAS号：26915-72-0)亲水性单体0.40g，叔丁氧羰基胱胺甲基丙烯酰胺(Boc-Cyst-MAAm)疏水性单体0.64g以及大分子引发剂PEG2-ABCPA 0.25g一起溶于6mL DMF中。抽真空后充氮气保护，反复三次后，在70℃油浴中引发自由基聚合7小时，用乙醚沉淀，制得的嵌段共聚物P(PEG-MEMA-co-Boc-Cyst-MAAm)-b-PEG 0.76克，用PEG-P1表示。它在4℃时为水溶性。通过凝胶渗透色谱(GPC)测得其数均分子量为118kDa，多分散指数PDI为1.91。通过核磁共振氢谱测得的亲水性单体PEG-MEMA与疏水性单体Boc-Cyst-MAAm的摩尔比为52∶48。(核磁共振氢谱中化学位移在0.7-1.2ppm的峰为Boc-Cyst-MAAm和PEG-MEMA的甲基氢CH3，1.3-1.5ppm为Boc-Cyst-MAAm中叔丁氧羰基Boc的三个甲基的氢，1.6-2.0ppm为Boc-Cyst-MAAm和PEG-MEMA的亚甲基氢CH2，2.6-2.9ppm为Boc-Cyst-MAAm中靠近硫原子的两个亚甲基氢CH2，3.4-4.2ppm为Boc-Cyst-MAAm中靠近氮原子的两个亚甲基氢CH2及聚乙二醇中所有亚甲基氢CH2。)
合成共聚物例2：将合成共聚物例1中的甲基丙烯酸聚乙二醇酯改为丙烯酸聚乙二醇酯(PEG-MEA，Mn～480，CAS号：32171-39-4)，0.50g，叔丁氧羰基胱胺甲基丙烯酰胺(Boc-Cyst-MAAm)疏水性单体0.64g以及大分子引发剂PEG2-ABCPA 0.25g一起溶于6mL DMF中。反应条件和处理与合成共聚物例1相同，制得的嵌段共聚物P(PEG-MEA-co-Boc-Cyst-MAAm)-b-PEG 0.88克，它在4℃时为水溶性。通过凝胶渗透色谱(GPC)测得其数均分子量为105kDa，多分散指数PDI为1.72。通过核磁共振氢谱测得的亲水性单体PEG-MEA与疏水性单体Boc-Cyst-MAAm的摩尔比为44∶56。(核磁共振氢谱中化学位移在0.7-1.2ppm的峰为Boc-Cyst-MAAm的甲基氢CH3，1.3-1.5ppm为Boc-Cyst-MAAm中叔丁氧羰基Boc的三个甲基的氢，1.6-2.0ppm为Boc-Cyst-MAAm和PEG-MEA的亚甲基氢CH2，2.6-2.9ppm为Boc-Cyst-MAAm中靠近硫原子的两个亚甲基氢CH2，3.4-4.2ppm为Boc-Cyst-MAAm中靠近氮原子的两个亚甲基氢CH2及聚乙二醇中所有亚甲基氢CH2。)
合成共聚物例3：将合成共聚物例1中的叔丁氧羰基胱胺甲基丙烯酰胺改为叔丁氧羰基胱胺丙烯酰胺(Boc-Cyst-AAm)，其余与合成共聚物例1相同，制得的嵌段共聚物P(PEG-MEA-co-Boc-Cyst-AAm)-b-PEG 0.78克，它在4℃时为水溶性。通过凝胶渗透色谱(GPC)测得其数均分子量为95kDa，多分散指数PDI为1.79。通过核磁共振氢谱测得的亲水性单体PEG-MEMA与疏水性单体Boc-Cyst-AAm的摩尔比为49∶51。(核磁共振氢谱中化学位移在0.7-1.2ppm的峰为PEG-MEMA的甲基氢CH3，1.3-1.5ppm为Boc-Cyst-AAm中叔丁氧羰基Boc的三个甲基的氢，1.6-2.0ppm为Boc-Cyst-AAm和PEG-MEMA的亚甲基氢CH2，2.6-2.9ppm为Boc-Cyst-AAm中靠近硫原子的两个亚甲基氢CH2，3.4-4.2ppm为Boc-Cyst-AAm中靠近氮原子的两个亚甲基氢CH2及聚乙二醇中所有亚甲基氢CH2。)
合成共聚物例4：使用合成例1中的大分子引发剂(PEG2-ABCPA)，将甲基丙烯酸聚乙二醇酯(PEG-MEMA)亲水性单体0.30g，叔丁氧羰基胱胺甲基丙烯酰胺(Boc-Cyst-MAAm)疏水性单体0.75g以及合成例1中的大分子引发剂PEG2-ABCPA0.25g一起溶于6mL DMF中。抽真空后充氮气保护，反复三次后，在70℃中引发自由基聚合7小时，用乙醚沉淀，制得的嵌段共聚物P(PEG-MEMA-co-Boc-Cyst-MAAm)-b-PEG0.86克，它不溶于水，但能溶于乙醇，用PEG-P4表示。通过凝胶渗透色谱(GPC)测得其数均分子量为101kDa，多分散指数PDI为2.14。通过核磁共振氢谱测得的亲水性单体PEG-MEMA与疏水性单体Boc-Cyst-MAAm的摩尔比为30∶70。(核磁共振氢谱中各个H的化学位移与合成例1中的共聚物核磁共振氢谱的化学位移相同)
合成共聚物例5(ATRP)：参照文献(Jankova K，Chen X，Kops J，Batsberg W，Macromolecules，1998，31，538-541)合成ATRP用一端带甲氧基的聚乙二醇大分子引发剂，其结构式为：CH3-O-(CH2CH2O)m-COCHBr-CH3，简称MPEG-Br。其中甲氧基聚乙二醇为平均分子量5000的mPEG5000(CAS号：9004-74-4，m为80-150)。将甲基丙烯酸聚乙二醇酯(PEG-MEMA)亲水性单体0.40g，叔丁氧羰基胱胺甲基丙烯酰胺(Boc-Cyst-MAAm)疏水性单体0.64g以及PEG大分子引发剂(MPEG-Br，0.32g)，联吡啶(30mg)一起溶于5mL异丙醇中。抽真空充氮气保护，而后加入CuBr(9.5mg)，反复抽真空后充氮气保护三次后，在90℃油浴中反应7h后在乙醚中沉淀。制得的嵌段共聚物P(PEG-MEMA-co-Boc-Cyst-MAAm)-b-PEG 0.64克，用PEG-P5表示。它在4℃时为水溶性。通过凝胶渗透色谱(GPC)测得其数均分子量为12kDa，多分散指数PDI为1.3。
合成共聚物例6：将合成共聚物例4中制得的嵌段共聚物P(PEG-MEMA-co-Boc-Cyst-MAAm)-b-PEG 0.4g加入到3.0mL DMF和3.0mL三氟乙酸混合液中搅拌至其完全溶解再反应半个小时。将三氟乙酸旋转蒸发后，用乙醚沉淀，收集白色沉淀，干燥得到侧基脱叔丁氧羰基(Boc)含胺基的聚合物，脱Boc后的聚合物的核磁共振氢谱表明了化学位移为1.4ppm的单峰消失，可以说明Boc已经脱掉。再将该聚合物在5.0mLDMF中溶解，加入过量的邻苯二甲酸酐1.0g，搅拌，溶解后在70℃的油浴中反应18小时，在室温下用乙醚沉淀除去未反应的邻苯二甲酸酐等小分子，干燥得改性共聚物0.37g，该聚合物不溶于纯水，但溶于弱碱性水溶液。该改性共聚物的紫外吸收谱图中在288nm的位置，有一个明显的肩峰，为苯环的吸收峰。说明在70℃的反应条件下，邻苯二甲酸酐通过酰胺键结合到了聚合物中。
胶束制备例7：将低温水溶性共聚物PEG-P1 10.0mg加入到含有pH＝7.4的5.0mL磷酸钠(PBS，0.15M)缓冲溶液中的样品瓶中，在冰箱(4℃)中放置过夜使其充分溶解(2.0mg/mL)，然后从冰箱中取出样品瓶置于55℃的水浴中震荡一分钟后取出自然冷却至室温，得到稳定的胶束纳米粒子，经动态光散射(DLS)测得的平均粒径为63nm，分散指数PDI为0.06。该胶束的稳定性用DLS连续测试其粒径和粒径分布以及光散射强度在37℃下的变化情况见图1a和1c。同时，作为对比，对同样的聚合物胶束1.0mL，加入20μL二硫苏糖醇(DTT，0.5M)，使得DTT的最终浓度为10mM(模仿细胞内还原环境)，同样在37℃下，用DLS连续测试其粒径和粒径分布以及光散射强度的变化情况见图1b和1c。由图1可知，该胶束在37℃和pH＝7.4的PBS缓冲溶液中很稳定(10小时以上)，但加入DTT后20-40分钟内胶束聚集明显，粒子变大，光散射强度先增大再降低(说明粒子数目降低，因为光散射强度受粒径大小和粒子数目的影响)，分散指数变大，这表明DTT的加入破坏了胶束的稳定性，该共聚物PEG-P1胶束具有还原敏感性能。
胶束制备例8：将低温水不溶的聚合物PEG-P2溶解于乙醇中(20mg/mL)，取出250μL溶解好的聚合物乙醇溶液加入到pH＝7.4的PBS缓冲溶液2.25mL，摇匀制得含乙醇为10％的稳定的聚合物胶束纳米粒子，其聚合物浓度为2.0mg/mL。经动态光散射(DLS)测得的平均粒径为70nm，分散指数PDI为0.02。
胶束载药例9：对于低温水中可溶性的共聚物PEG-P1的胶束载药过程，先将紫杉醇溶解于乙醇中配成20mg/mL的紫杉醇乙醇母液，然后取其中一定量(对于样品A，20μL，对于样品B，30μL，对于样品C，40μL；对于样品D，70μL)用乙醇稀释到0.20mL；将聚合物PEG-P1溶解于pH＝7.4的PBS缓冲溶液中(2.2mg/mL)，在冰箱(4℃)中放置一夜使其充分溶解。取1.8mL聚合物溶液，将上述稀释后的紫杉醇乙醇溶液0.20mL加入到聚合物中并置于55℃的水浴中，在水浴中震荡一分钟后取出，冷却至室温，用孔径0.45微米的过滤器过滤除去沉淀的紫杉醇，得到稳定的胶束载药纳米粒子，经动态光散射(DLS)测试粒径，其载药量和载药包封效率通过HPLC测得(Angel C18分析色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为乙腈∶水(60∶40)；流速为0.5mL/min；检测波长为227nm；进样量为20μL)。结果见表1，由该表可知，该胶束粒子装载紫杉醇药物包封效率很高，载药粒子粒径小，分布较窄，最高载药量可达34.9％，载药效率均大于90％。
表1不同载药量的PEG-P1装载紫杉醇胶束纳米粒子*
*载药量＝(过滤后胶束中的紫杉醇质量/载药胶束聚合物质量)×100％，包封率＝(过滤后胶束中的药物质量/所投药物质量)×100％。聚合物浓度为2.0mg/mL。
载药胶束稳定性的考察
表2为DLS在37℃测试共聚物PEG-P1胶束装载紫杉醇19.2％的纳米粒子用pH＝7.4的PBS缓冲溶液稀释后的结果。由该表可知，该载药胶束粒子稀释到0.025mg/mL时粒径变化仍然较小，这说明该胶束载药纳米粒子很稳定。但聚合物浓度稀释到0.01和0.001mg/mL时，聚合物浓度低于其临界胶束浓度，药物可能聚集，粒径分布明显变宽，这时候的DLS测试结果不可靠(PDI＞0.3)。
表2PEG-P1胶束载药量19.2％的纳米粒子稀释后不同聚合物浓度的粒径
载药胶束的还原敏感性
图2为在PEG-P1胶束载紫杉醇药9.85％的纳米粒子加入DTT(10mM DTT，模仿细胞内还原环境)后，该胶束载药粒子在37℃时的粒径及其分散指数和光散射强度随时间的变化。由该图可知，加入DTT 20分钟后载药胶束粒子开始变大，分布变宽，光散射强度降低。这表明该载药胶束粒子具有明显的快速的还原敏感响应性能。
分别取1.96mL聚合物PEG-P1胶束载紫杉醇药9.85％的纳米粒子分散液两份，往其中之一加入40μL0.5M的DTT水溶液(最终浓度为10mM DTT，模仿细胞内还原环境)，往另一份加入40μL水，在不同的时间对载药胶束溶液用220nm的针头过滤器过滤将析出的药过滤除去后，分别取相应滤液100μL并加乙腈900μL溶解，通过HPLC测试其紫杉醇浓度并计算胶束保有的药物百分比。图3比较了胶束加入和没有加入DTT(10mM)后，该载药胶束的载药量随时间的变化。由该图可知，加入DTT 30-50分钟后胶束保有的药物百分比大大降低。这说明这段时间大量药物由于DTT的作用从胶束中释放出来，也表明该载药胶束粒子具有明显的快速的还原敏感响应性能。由图3可知，只加了少量水的胶束保有的药物百分比也降低，这可能主要是由于多次过滤胶束分散液，过滤器吸附部分药物所致，如1小时后只过滤一次测得的胶束保有的药物为97.9％。
载药胶束的体外释药特性
通过透析法评估载药胶束的体外释药特性。使用如上所述的共聚物PEG-P1载药9.85％的胶束2mL(聚合物2mg/mL，紫杉醇约0.2mg/mL)，然后用pH＝7.4的PBS缓冲溶液2mL进行稀释一倍。取稀释液1.5mL于透析袋(截留分子量3500)中，放入盛有500mL pH＝7.4的PBS缓冲溶液的烧杯中透析(烧杯置于37℃的摇床水浴)，以保证当全部紫杉醇被释放时的浓度仍然低于紫杉醇在水中的溶解度(0.3μg/mL)，即符合漏槽条件(sink condition)。在相应时间每次取透析袋外液1.5mL置于冰箱中保存待测，每次取样后都往其中补加入1.5mL PBS缓冲溶液，通过HPLC测试其紫杉醇浓度计算出释药百分比，结果见图4。由该图可知，该载药胶束在PBS缓冲溶液里没有明显的爆释现象，胶束释稀后紫杉醇的释放行为可能是扩散控制，8小时和24小时后，紫杉醇的释出百分比分别为23％和62％。48小时后，透析袋中分散液里的紫杉醇的量也通过HPLC测试为开始紫杉醇总量的9％。因此一些紫杉醇药物可能吸附到烧杯瓶壁或者透析袋。
总之，本发明的载药胶束粒子在储存运输和体液循环时很稳定地包覆药物，经肿瘤靶向进入细胞后由于还原环境会很快降解释放出所载的有毒药物。
胶束载药例10对于非水溶性的共聚物PEG-P4的胶束载药过程，先将聚合物溶解于乙醇中(20mg/mL)，紫杉醇也溶解于乙醇中(10mg/mL)。取130μL溶解好的聚合物与适量的紫杉醇乙醇溶液(对于样品E，26μL；样品F，39μL；样品G，52μL；样品H，78μL)混合后，往其中加入pH＝7.4的PBS缓冲溶液到总体积1.3mL，摇匀并用孔径0.45微米的过滤器过滤除去沉淀的紫杉醇，制得稳定的聚合物胶束纳米粒子，其聚合物胶束浓度为2.0mg/mL。经动态光散射(DLS)测试粒径，其载药量和载药包封效率通过HPLC测得，结果见表3。由该表可知，该胶束粒子装载紫杉醇药物包封效率很高，载药粒子粒径小，分布较窄，最高载药量可达30％，载药效率均大于90％。
表3不同载药量的PEG-P1装载紫杉醇药物胶束纳米粒子*
样品 名称 投药量 (药物/聚合物，w/w) 载药量 (药物/聚合物，w/w) 包封率 (％) 平均粒径 (d.nm) 分散指 数(PDI) 乙醇 含量 E 10∶100 9.5∶100 95.2 71 0.03 12％ F 15∶100 9.85∶100 99.1 70 0.01 13％ G 20∶100 20.62∶100 103.1# 71 0.02 14％ H 30∶100 30.15∶100 100.5# 75 0.02 16％
*载药量＝(过滤后胶束中的紫杉醇质量/载药胶束聚合物质量)×100％，包封率＝(过滤后胶束中的药物质量/所投药物质量)×100％。聚合物浓度为2.0mg/mL。
#包封率大于100％为实验测试误差。