紫杉烷与细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂的组合 本发明涉及Taxol、Taxotere及其类似物与其它能用于治疗肿瘤疾病的化合物的组合。更具体地说，本发明涉及Taxol、Taxotere及其类似物与细胞周期蛋白依赖激酶的组合。
紫杉烷类与紫杉烷类似物(taxoids)类构成了一类天然的双萜化合物，其中包括有效的抗肿瘤药物紫杉醇。紫杉醇(Taxol)，最初是从短叶紫杉树(Taxus brevifolia)的树皮中分离出来的，业已被证明能非常有效地用于乳房和卵巢癌患者的辅助和新辅助(neo-adjuvant)疗法。近年来，它的半合成类似物多西他赛(Taxotere)也被发现可有效地用于乳腺癌的化学疗法，该发现扩展了对这类抗肿瘤药物敏感的疾病(包括肺和结肠癌)的数目。Taxol(紫杉醇)和Taxotere(多西他赛)均可与微管蛋白结合，抑制微管解体并减弱有丝分裂，从而阻断细胞周期的M期的进程并促进细胞凋亡。
尽管紫杉醇类在临床上确实取得一定的成果，但是某些肿瘤已对这些药物显示出抗性。这种耐药性可能是肿瘤的先天特征，或者是随着肿瘤的生长而形成的。已报道的耐药机制主要包括以下3种：(i)微管蛋白基因的点突变，(ii)与紫杉烷类低结合力微管蛋白亚型的选择，和(iii)mdrl基因编码P-糖蛋白(P-gp)外流泵介导的多药耐药(MDR)表型的表达。机制(iii)可以解释在先天性表达P-gp的肿瘤(例如结肠和肾癌)中对Taxol和Taxotere的先天抗性。
本发明的组合或联合能使消除或延迟多效抗性或者“多药耐药”现象。
至于Taxol、Taxotere及其衍生物形式的制备，可参见例如欧洲专利EP0253738和EP0253739和国际申请PCT WO92/09589。
业已发现，本发明主题地这种形式，当与至少一种能用于抗癌治疗的物质(其机制与这些紫杉烷类相同或者不同)联用时，Taxol、Taxotere、及其类似物的效力得到显著改善。
在这些可与Taxol、Taxotere、或者它们类似物联用或者组合的物质中，包括酶例如L-天冬酰胺酶和细胞周期蛋白依赖激酶，例如黄酮吡啶酚(flavopiridol)、栎精(quercitin)和染色木黄酮(genistein)。也可采用各种药物例如生物反应调节剂或生长因子抑制剂，例如干扰素或白细胞介素。
这些产品的活性取决于其施用剂量，因此造血生长因子例如G-CSF或GM-CSF或某些白细胞介素与Taxol、Taxotere、它们的类似物或者它们与其它治疗活性物质组合的联用，有可能在使用高剂量和提高活性的同时降低毒性或延缓毒性发作。
具体地说，本发明涉及Taxol、Taxotere及其类似物与细胞周期蛋白依赖激酶黄酮吡啶酚的组合。
细胞周期蛋白依赖激酶(CDKs)是重要的调节剂，它可以控制细胞周期的节律和协调。CDKs可与它们的专性细胞周期蛋白配偶体形成可逆性复合物，从而调节细胞周期中的通过关键接合点(keyjuncture)转变。例如，活化的CDK4-细胞周期蛋白D1配合物通过G1期控制进程，而CDK1-细胞周期蛋白B1配合物控制细胞周期有丝分裂期的起始。可与CDK或细胞周期蛋白组分结合并抑制激酶活性的内源性细胞周期蛋白依赖激酶抑制蛋白(CDKIs)是已知的。在许多肿瘤(例如黑素瘤、胰腺和食道癌症)中，这些天然CDKIs不存在或者已突变。于是，选择性的CDK抑制剂被证明是有效的化疗剂。
黄酮吡啶酚(顺-5，7-二羟基-2-(2-氯苯基)-8-[4-(3-羟基-1-甲基)-哌啶基]-1-苯并吡喃-4-酮，Flavopiridol)是一种合成的黄酮，它具有抗癌活性，能抗各种肿瘤细胞系例如人肺癌、乳腺癌，在异种移植模型中也表现出可抑制肿瘤生长。它可诱导细胞周期中的G1和G2期停滞。黄酮吡啶酚是CDKs的有效和选择性的抑制剂，它的抗癌活性与其CDK抑制活性有关。研究表明，黄酮吡啶酚能以一种细胞周期特异性方式表现出对肿瘤细胞生长的抑制活性。参见Bioorg.& Med.Chem.Letters 10：1037-1041(2000)。
Taxotere与黄酮吡啶酚均具有相互改善对方效力的不同机制。通过测定治疗协同作用，即可证实本发明组合的改善效力。如果其疗效优于以最佳剂量水平施用的一种或其它组分，则表明所述组合具有治疗协同作用(T.H.Corbett等，Cancer Treatment Reports，66：1187(1982))。
为了证明组合的效力，有必要对组合的最大耐受量与该研究中所述每种单独组分的最大耐受量进行比较。
例如，可采用Log10细胞杀伤对效力进行定量，其中Log10细胞杀伤的定义如下：
Log10细胞杀伤＝T-C(天)/3.32×Td其中T-C表示细胞生长所用的时间，即治疗组(T)肿瘤和治疗组(C)肿瘤达到预定值(例如1g)所用的平均天数，Td表示达到对照组动物肿瘤两倍体积需要的天数(T.H.Corbett等，Cancer，40，2660-2680(1977)；F.M.schabel等，Cancer Drug Development，B部分，Methods in Cancer Research，17，3-51，纽约，Academic出版公司。(1979))。Log10细胞杀伤大于或等于0.7的产品被认为是有效的，而Log10细胞杀伤大于2.8的产品则被认为非常有效。
当组合(以其最大耐受量水平使用)的Log10细胞杀伤大于单独施用最好组分的Log10细胞杀伤时，即表明该组合出现了治疗协同作用，其中组合中的每一组分用量不超过其各自最大耐受量。
可采用下述方法测定所述组合对实体瘤的效力：
受试动物通常为小鼠，于0天经皮下两侧移植30-60mg肿瘤片断。荷瘤动物在接受各种处理和对照品以前是混杂的。至于对进展性肿瘤的处理，可允许肿瘤成长至所需的尺寸，同时剔除肿瘤发育不足的动物。挑选出的动物随机分成处理组和对照组。也可对非荷瘤动物实施与荷瘤动物相同的处理，这样可使毒性效应区别于对于肿瘤的特异性作用。通常在移植后的3-22天实施化学疗法，这取决于肿瘤的类型，期间每天观察动物。不同组的动物每周称重3或4次，直到获得最大体重下降为止；然后每周至少称重一次，直到试验结束。
每周测量肿瘤2或3次，直到肿瘤长至约2g，或者动物在肿瘤达到2g之前死亡。动物死亡后进行尸体解剖。
根据表I和II所列的不同参数测定抗癌活性。
为了研究该组合对白血病的效力，给动物移植特定数量的细胞，并通过比较处理组相对于对照组的小鼠存活时间的增加来测定抗癌活性。在P388白血病中，使存活时间的增加大于27％的产品被认为是有效的，增加大于75％的产品被认为非常有效。
在下面的实施例中，向小鼠移植乳腺癌MA13/C，并用Taxotere和黄酮吡啶酚的组合进行处理，其中Taxotere和黄酮吡啶酚的给药方案和方式均不同。Taxol和Taxotere以及黄酮吡啶酚均可经口施用和静脉内施用。某些方案显示出了明显的治疗协同作用。
关于本发明的其它目的和优点，其中一部分将在下面的描述中阐述，而另一部分则可很容易地从下面的描述或者从本发明的实施中得出。通过特别是附加权利要求书中阐明的原理和组合，可进一步了解并达到本发明的目的和优点。
可以理解的是，上述一般性描述以及下面的详细描述仅是示例性和解释性的，对权利要求书所要求的本发明范畴并没有限制。
实施例1
将Taxotere和黄酮吡啶酚单独给予荷MA13/C的小鼠，以测定所述组合中每一组分的活性。在第15和21天静脉内施用Taxotere；每天剂量为30mg/kg，总剂量为60mg/kg。单独施用该剂量后，产生的Log10细胞杀伤为4.7，并且经如此处理的5只小鼠完全应答(response)。于第15和21天每天施用6mg/kg或总剂量为12mg/kg的黄酮吡啶酚，5只试验小鼠中没有产生完全反应。
接着，按两种方法联用上述两种化合物，并按间歇性方案进行试验。在第一组合中，首先于第15和20天施用黄酮吡啶酚(总剂量为9mg/kg)，接着于第16和21天施用Taxotere(总剂量为45mg/kg)。以这种方式施用时，产生的Log10细胞杀伤为5.5，并且处理组小鼠产生5/5的完全应答。在该间歇性方案中，Log10细胞杀伤好于单独施用的Taxotere，尽管该组合中Taxotere和黄酮吡啶酚的施用量均比对照组少25％，仍然产生5/5完全有效。
当以相反顺序施用组合中的组分，即首先于第15和20天施用相同量的Taxotere，再于第16和21天施用相同量的黄酮吡啶酚时，Log10细胞杀伤略小于单独施用的Taxotere，但仍产生了5/5完全有效。表1为试验结果，黄酮吡啶酚和Taxotere的组合(各组分的施用量均低25％)与单独施用的Taxotere具有相似的效力。
表I荷MA13/C小鼠中的黄酮吡啶酚-Taxotere组合：相隔24小时IV药物 方案 HNTD(DT) mg/kg ％bwl (最低) Ick 备注 多西他赛 FlavoTaxotere黄酮吡啶酚 15，21 15，21 30.0 (60.0) - 6.0 (12.0) 8(27) 6(16) 4.7 0.4 5/5CR HDE 0/5CR组合相隔24hFlavo 1stTaxotereTaxotere1st 15，20 16，21 22.5 (45.0) 22.5 (45.0) 4.5 (9.0) 4.5 (9.0) 7(22) 7(25) 5.5 4.4 5/5CR HDE 5/5CR HDE
Td＝2.2天；对照组达到1g所用的时间＝20.3天；开始治疗时的平均荷重＝130-160mg
CR＝完全应答；IV＝静脉内；bwl＝体重降低至最低；(DT)＝总剂量；
HNTD＝最高无毒剂量：Ick＝Log10细胞杀伤
实施例2
增加施用黄酮吡啶酚的天数，在荷MA13/C小鼠的十天给药周期中，施用了8天相同剂量的黄酮吡啶酚，并且在十天周期的第一和最后一天施用Taxotere，出现了明确的协同作用。
下表2列出了每一组分单独施用时的最高无毒总剂量，其中Taxotere为96.8mg/kg，黄酮吡啶酚为23.2mg/kg。当联合施用组分，即于第14和23天施用Taxotere，而于14-17天和20-23天施用黄酮吡啶酚时，三个组合表现出明显的协同作用，而第四组合与单独施用的Taxotere效力相同。四种组合均产生了6/6完全应答，即100％完全应答。
对荷有可测肿瘤(开始治疗时为230mg)的C3H/HeN小鼠进行了3-arm剂量-反应研究。根据其对多西他赛的化学敏感性，选定鼠乳腺癌MA13/C为模型。小鼠用Flavo(即于植入肿瘤后的14-17天和20-23天，每天一次)、或者多西他赛(即于第14和23天)或者它们的组合进行处理。结果：经IV单独施用最高无毒剂量(HNTD，2.9mg/kg/剂量，总剂量23.2mg/kg)的Flavo无效，其具有0.4的Log细胞杀伤净值(Log细胞杀伤净值＝肿瘤生长延迟-治疗持续时间/3.32×肿瘤倍增时间)，非完全应答(CR)。单独施用HNTD量(48.1mg/kg/注射，总剂量为96.8mg/kg)的多西他赛表现出明显的活性(3Log细胞杀伤净值，6/6CR)。最高无毒剂量的组合(1.93mg/kg/剂量的Flavo和53.2mg/kg/注射的多西他赛)表现出明显的协同作用(7.6Log细胞杀伤净值，6/6CR)。这种组合会在最后治疗的6天后引起最低13％的体重降低，这是可以耐受的。与HNTD量的多西他赛相比，另外2个低剂量水平的组合也可具有协同作用。经口施用的Flavo也观察到了这种协同作用。
表II黄酮吡啶酚-Taxotere组合
乳腺癌MA13/C “反复暴露”IV药物mg/kg/剂量(总剂量) ％bwl (最低) Ick总量 CR 备注Taxotere14，23天 黄酮吡啶酚 14-17，20-23天78.1(156.2)48.1(96.8) - - 20(29) 8(28) - 4.4 - 6/6 2/6DD HNTD--- 4.8(38.4) 2.9(23.2) 1.75(14) ＞20 3(18) +10(24) - 1.0 0.0 - 0/6 0/6 4/5DD HNTD48.4(96.8)53.2(106.4)43.6(87.2)36.3(72.6)31.5(63.0)24.2(48.4) 2.9(23.2) 1.93(15.44) 1.6(12.8) 1.31(10.48) 1.14(9.12) 0.88(7.04) 15(27) 13(29) 9(29) 3(29) 6(28) 5(19) - 9.0 7.0 5.1 4.4 2.0 - 6/6 6/6 6/6 6/6 2/6 2/5DD HNTD
Td＝2.2天。对照达到1g所需时间＝17.8天；开始治疗时的平均荷瘤＝210-260mg；
CR＝完全应答；IV＝静脉内；bwl＝体重降低的最低点；(DT)＝总剂量；
HNTD＝最高无毒剂量；Ick＝Log10细胞杀伤。
实施例3
于肿瘤植入后的第14天和25天IV注射Taxotere。于14-18天和21-25天经口施用Flavo，每天一次。
黄酮吡啶酚(po)-多西他赛(iv)
延长暴露的MA13/C药物 方案 HNTD(DT) m/kg TXT Flavo ％bwl (最低) Ick 备注TXTFlavo 14，25 14-18，21-25 30 - (60) 2.7 (27) 3.6(33) 11.6 (26) 0.9 0.1 HNTD HNTD组合TXT 14，25 45 4.5 9.7(19) □5 HNTC组合Flavo 14-18，21-25 (90) (4.5)
14天时的肿瘤重量约320mg，
(BCM-1252)-实验编号。
如实施例2所示，与等毒性剂量的任何一种单一药物相比，多西他赛与每日重复的Flavo之间的组合更有效。细胞杀伤增加Log4证实了协同作用。
对于本领域技术人员而言，由在此所述的本发明说明书或者实施中得出本发明的其它实施方案是显而易见的。无需进一步说明，在此所述的说明书和实施例仅仅是示例性的，本发明的真实范畴和精神将体现于下列权利要求书中。