天南星提取物及其用于创伤愈合作用的用途.pdf

本发明提供天南星的水和醇提取物、从天南星分离的化合物(比如3-O-(9,12-十八碳二烯酰基)-甘油基-β-D-吡喃半乳糖苷、N-(β-D-呋喃核糖-1-基)-苯丙氨酸、和腺苷)、包含前述成分的药物组合物、以及其用于促进创伤愈合的用途。在一个实施方案中，所述药物组合物为局部剂型，比如乳膏剂、软膏剂、泡沫剂、洗剂、硬膏剂、凝胶剂和乳剂。

1.  一种用于促进受试者中创伤愈合的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的组合物，该组合物包含水溶性天南星（Rhizoma arisaematis）提取物和/或一种或多种选自由3-O-(9,12-十八碳二烯酰基)-甘油基-β-D-吡喃半乳糖苷、N-(β-D-呋喃核糖-1-基)-苯丙氨酸、腺苷、及其任意盐组成的组中的分离的化合物。

2.  根据权利要求1的方法，其中所述组合物包含天南星根的水溶性提取物。

3.  根据权利要求1的方法，其中所述组合物包含一种或多种选自由3-O-(9,12-十八碳二烯酰基)-甘油基-β-D-吡喃半乳糖苷、N-(β-D-呋喃核糖-1-基)-苯丙氨酸、腺苷、及其任意盐组成的组中的分离的化合物。

4.  根据权利要求3的方法，其中所述组合物包含分离的化合物3-O-(9,12-十八碳二烯酰基)-甘油基-β-D-吡喃半乳糖苷或其盐，和分离的化合物腺苷或其盐。

5.  根据权利要求1的方法，其中所述组合物局部施用至创伤区域。

6.  根据权利要求1的方法，其中所述受试者具有皮肤创伤、切除伤、撕裂伤、烧伤、擦伤、贯通伤、外科创伤、挤压伤或溃疡。

7.  根据权利要求6的方法，其中所述受试者患有糖尿病性溃疡。

8.  根据权利要求5的方法，其中所述组合物配制成创伤敷料、乳膏剂、软膏剂、泡沫剂、洗剂、硬膏剂、凝胶剂、乳剂、水凝胶或皮肤贴剂。

9.  一种用于促进受试者中创伤愈合的方法，包括向受试者施用治疗有效量的包含于溶剂中的天南星提取物的组合物，所述溶剂包含至少70%(v/v)的选自下列的醇：乙醇、甲醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、或其混合物。

10.  根据权利要求9的方法，其中所述受试者患有溃疡，并且将所述组合物局部施用至溃疡。

11.  根据权利要求10的方法，其中所述受试者患有糖尿病性溃疡。

12.  根据权利要求10的方法，其中所述组合物配制成创伤敷料、乳膏剂、软膏剂、泡沫剂、洗剂、硬膏剂、凝胶剂、乳剂、水凝胶或皮肤贴剂。

13.  一种用于促进成纤维细胞产生胶原蛋白的方法，其中所述方法包括向所述成纤维细胞施用有效量的包含水溶性天南星提取物的组合物。

14.  根据权利要求13的方法，其中所述成纤维细胞位于受试者中。

15.  根据权利要求14的方法，其中所述受试者具有创伤，并且将所述组合物局部施用至该创伤区域。

16.  一种用于促进角质形成细胞的迁移和/或增殖的方法，其中所述方法包括向所述角质形成细胞施用有效量的组合物，该组合物包含天南星的水溶性提取物和/或分离的化合物3-O-(9,12-十八碳二烯酰基)-甘油基-β-D-吡喃半乳糖苷或其盐。

17.  根据权利要求16的方法，其中所述角质形成细胞位于受试者中。

18.  根据权利要求17的方法，其中所述受试者具有创伤，并且将所述组合物局部施用至该创伤区域。

19.  根据权利要求16的方法，其中所述组合物包含分离的化合物3-O-(9,12-十八碳二烯酰基)-甘油基-β-D-吡喃半乳糖苷或其盐。

20.  一种分离的化合物，其为N-(β-D-呋喃核糖-1-基)-苯丙氨酸或其盐。

天南星提取物及其用于创伤-愈合作用的用途
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2011年10月18日提交的美国临时申请系列号No.61/627,772的优先权，将其全部内容通过引用并入本文。
背景技术
天南星(Rhizoma arisaematis，RA)是一种天南星科的多年生草本植物，原产自北美洲和亚洲。在中医学(TCM)中，RA被认为具有苦、辛和温的特性，常用于治疗各种病症，包括咳嗽、肌肉痉挛和癫痫。
创伤愈合是一种复杂的过程，涉及炎症、细胞增殖、组织肉芽形成、上皮再生和组织再生，并且其由角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞介导。创伤修复开始于损伤部位的血流增加和血管通透性增加。血液组分渗入创伤中，形成由血小板和细胞外基质(ECM)组成的止血栓子。中性粒细胞还作出非特异性但高度有效的破坏性吞噬应答。新到达的单核细胞和淋巴细胞也介导抗原-特异性免疫应答，其释放额外的促炎细胞因子。
内皮细胞在创伤愈合过程中炎症性应答的初始阶段期间也被活化。除此之外，内皮细胞还表达将循环白细胞附着于炎症细胞的粘附分子。免疫细胞的细胞附着于炎症部位周围内皮细胞衬里的血管，防止免疫细胞扫过(swept past)组织损伤部位；这是免疫细胞随后迁移到周围炎症组织中的一个关键步骤。
内皮细胞也降解现有的血管基底膜，并引发成纤维细胞在创伤区域中的迁移和增殖。增殖的成纤维细胞沿着纤维蛋白凝块迁移到创伤床，并引发称为基质的细胞外基质的形成。一旦基质产生，成纤维细胞产生胶原蛋白、蛋白多糖、纤连蛋白和葡糖胺聚糖，导致在创伤床周围形成新的细胞外基质；新形成的细胞外基质对于其它细胞的迁移是有用的。
与此同时，创伤愈合过程期间形成的肉芽组织覆盖创伤床。另外， 角质形成细胞从创伤边缘迁移和增殖，接着成纤维细胞在创伤近端增殖。胶原纤维在表面上再生，包含在肌成纤维细胞中的肌动蛋白将创伤边缘拉近，从而减小了创伤的尺寸。
在创伤愈合期间，角质形成细胞、成纤维细胞和内皮细胞彼此相互依赖地起作用。角质形成细胞迁移和增殖在表皮细胞再生中很重要，表皮细胞再生得到细胞外基质形成的促进。新细胞外基质的合成也由成纤维细胞的增殖所介导，成纤维细胞的增殖促进角质形成细胞的增殖。内皮细胞参与血管生成，其对于向增殖的角质形成细胞和成纤维细胞提供细胞因子、氧和营养物是关键的。内皮细胞也在整个创伤愈合过程中提供免疫保护。
促进内皮细胞、角质形成细胞和/或成纤维细胞的迁移和/或增殖的治疗剂可用于促进创伤愈合，包括急性和慢性创伤(例如，糖尿病性创伤)的愈合。
目前，(贝卡普明)，一种重组人血小板衍生生长因子-BB(rhPDGF-BB)，是FDA批准用于治疗慢性创伤(特别是糖尿病性足部溃疡)的唯一生长因子。需要开发用于创伤愈合的另外的治疗剂。
发明内容
在多个实施方案中，本发明提供天南星(RA)的水和醇提取物、天南星醇提取物的水溶性部位、从天南星分离的化合物(比如，3-O-(9,12-十八碳二烯酰基)-甘油基-β-D-吡喃半乳糖苷、N-(β-D-呋喃核糖-1-基)-苯丙氨酸、和腺苷)，包含前述成分的药物组合物、以及其用于促进创伤愈合的用途。在某些实施方案中，药物组合物为局部剂型，比如乳膏剂、软膏剂、泡沫剂、洗剂、硬膏剂、凝胶或乳剂。
在一个特定实施方案中，本发明提供一种用于促进受试者中创伤愈合的方法，其中所述方法包括向受试者的创伤区域局部施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含天南星的水溶性提取物和/或一种或多种从天南星分离的化合物或其盐，其中所述方法促进创伤闭合和/或愈合。
在另一个实施方案中，本发明提供可以从天南星分离的新化合物 N-(β-D-呋喃核糖-1-基)-苯丙氨酸。
在某些实施方案中，本发明的天南星提取物和/或从RA分离的化合物可用于促进创伤愈合，包括皮肤创伤、切除伤、撕裂伤、烧伤、擦伤、刺伤或贯通伤、外科创伤、挫伤、血肿、挤压伤和溃疡，比如糖尿病足部溃疡。
附图简要说明
图1A表示天南星(RA)的水提取物在体外闭合成年人角质形成细胞的擦伤创伤。图1B表示治疗后创伤床宽度的定量分析。
图2表示RA的粗提取物(T)和水提取部位(WA)诱导人成年成纤维细胞中I型胶原蛋白的产生。
图3表示RA的粗提取物(T)和水提取部位(WA)不会引起人新生角质形成细胞的细胞死亡。
图4表示如通过MTT(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑鎓溴化物)代谢活性表明的天南星的WA部位的增殖作用。
图5表示RA的水提取部位的亚部分(sub-fraction)RA-WA1和RA-WA2闭合成年人角质形成细胞的体外擦伤创伤。
图6A表示在第2天WA部位和RA-WA1对创伤闭合的作用。图6B表示在4和40mg/kg的RA-WA1的剂量下，为期8天的创伤闭合的作用。
图6C表示40mg/kg的RA-WA1或水的创伤愈合作用。分别用RA-WA1和水局部处理小鼠的一个创伤，而其它创伤保持未处理。在第8天采集图像。
图7表示RA-WA部位和分离的化合物的HPLC图谱。在254nm下检测UV吸光度。
图8A表示化合物G192-C07的分离流程图。图8B表示从天南星分离的3-O-(9,12-十八碳二烯酰基)-甘油基-β-D-吡喃半乳糖苷(化合物G192-C07)在体外闭合成年人角质形成细胞的擦伤创伤。
发明详述
在多个实施方案中，本发明提供天南星(RA)的水和醇提取物、天南星醇提取物的水溶性部位、从天南星分离的化合物(比如，3-O-(9,12-十八碳二烯酰基)-甘油基-β-D-吡喃半乳糖苷、N-(β-D-呋喃核糖-1-基)-苯丙氨酸、和腺苷)、包含前述成分的药物组合物、以及其用于促进创伤愈合的用途。在某些实施方案中，药物组合物为局部剂型，比如乳膏剂、软膏剂、泡沫剂、洗剂、硬膏剂、凝胶或乳剂。
天南星的种类包括一把伞南星(Arisaema erubescens)、异叶天南星(Arisaema heterophyllum)和东北天南星(Arisaema amurense)。在一个实施方案中，本发明提供东北天南星提取物和从东北天南星分离的生物活性化学成分(比如，3-O-(9,12-十八碳二烯酰基)-甘油基-β-D-吡喃半乳糖苷、N-(β-D-呋喃核糖-1-基)-苯丙氨酸、和腺苷)，及其用于促进创伤愈合的用途。
在某些实施方案中，本发明提供一把伞天南星和/或异叶天南星的提取物和由其分离的生物活性化学成分(比如3-O-(9,12-十八碳二烯酰基)-甘油基-β-D-吡喃半乳糖苷、N-(β-D-呋喃核糖-1-基)-苯丙氨酸、和腺苷)，及其用于促进创伤愈合的用途。
在一个实施方案中，天南星提取物和/或从RA分离的化合物可用于促进角质形成细胞的增殖和/或迁移、和/或成纤维细胞生成胶原蛋白。
在某些实施方案中，本发明的天南星提取物和/或从RA分离的化合物可用于促进创伤愈合，包括皮肤创伤、切除伤、撕裂伤、烧伤、擦伤、刺伤或贯通伤、外科创伤、挫伤、血肿、挤压伤和溃疡，比如糖尿病足部溃疡。
化合物
在一个实施方案中，本发明提供N-(β-D-呋喃核糖-1-基)-苯丙氨酸或其盐。N-(β-D-呋喃核糖-1-基)-苯丙氨酸化合物具有下列结构：

在另一个实施方案中，本发明涉及3-O-(9,12-十八碳二烯酰基)-甘油基-β-D-吡喃半乳糖苷和腺苷、及其盐。在一个特定的实施方案中，本发明涉及3-O-(9Z,12Z-十八碳二烯酰基)-甘油基-β-D-吡喃半乳糖苷。
在一个特定实施方案中，本发明涉及从天南星中分离得到的3-O-(9,12-十八碳二烯酰基)-甘油基-β-D-吡喃半乳糖苷、N-(β-D-呋喃核糖-1-基)-苯丙氨酸、和腺苷。在一个实施方案中，本发明涉及从东北天南星分离的3-O-(9,12-十八碳二烯酰基)-甘油基-β-D-吡喃半乳糖苷、N-(β-D-呋喃核糖-1-基)-苯丙氨酸和腺苷。
天南星提取物
在另一个方面，本发明提供天南星提取物、以及用于制备天南星提取物的方法和用于从天南星分离生物活性化学成分的方法。还提供根据本发明制备的天南星提取物。在一个实施方案中，本发明提供东北天南星提取物和从东北天南星分离的生物活性化学成分。在一个实施方案中，本发明提供天南星的极性溶剂可溶性提取物。用于制备本发明的天南星提取物的极性溶剂的实例包括水、异丙醇、正丙醇、乙醇、甲醇、正丁醇、异丁醇及其各种混合物。
在一个特定实施方案中，本发明提供天南星的极性溶剂可溶性提取物，其中所述极性溶剂选自水、C1-C4醇(例如，甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇)或C1-C4醇的混合物、或水-C1-C4醇混合物。在一个另外的特定实施方案中，本发明提供天南星的水溶性提取物。在一个实施方案中，本发明提供天南星的极性溶剂可溶性提取物的水溶性部分，其中所述极性溶剂选自水、C1-C4醇(例如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇)或C1-C4醇的混合物、或水-C1-C4醇混合物。在一个优选的实施方案中，本发明的天南星提取物是从天南星的根提取 的。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于制备天南星提取物和/或用于从天南星分离生物活性化学成分的方法，其中所述方法包括下列步骤、基本上由所述步骤组成、或由所述步骤组成：
a)提供足量的天南星原料；和
b)用包括C1-C4醇(例如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇)的溶剂提取天南星的原料，得到天南星提取物的醇可溶性提取物。
优选地，将天南星的原料干燥并粉碎成小片。在一个另外的实施方案中，将天南星的原料浸入溶剂中回流提取。
在一个实施方案中，用于制备醇提取物的溶剂包括或者为醇-水混合物。醇-水(例如，乙醇-水、甲醇-水)混合物可以包含至少(v/v)5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的醇(例如，乙醇、甲醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇)。
在一个另外的实施方案中，本发明提供天南星的醇(例如乙醇)提取物的水溶性成分。在另一个另外的实施方案中，本发明提供天南星的乙醇提取物的丁醇可溶性成分。
在一个实施方案中，本发明提供天南星的水溶性提取物，其中所述水溶性提取物包含一种或多种下列化合物∶尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤、腺苷、鸟嘌呤、异鸟嘌呤核苷、N-(β-D-呋喃核糖-1-基)-苯丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酰基苯丙氨酸、2,6-脱氧果糖嗪、酪氨酸、3-O-(9Z,12Z-十八碳二烯酰基)-甘油基-β-D-吡喃半乳糖苷、β-D-呋喃果糖-(2→5)-吡喃果糖、和β-D-呋喃果糖/β-D吡喃果糖。天南星提取物可以通过例如过滤除去残余物来收集。在一个实施方案中，天南星提取物可以被进一步蒸发，产生固体或半固体组合物。在另一个实施方案中，天南星提取物可以被浓缩和/或纯化。
在一个另外的实施方案中，本发明的方法包括使用比如NMR分析和色谱技术（例如高效液相色谱(HPLC)和亲水性相互作用液相色谱(HILIC)）建立天南星提取物的化学成分图谱。
在另一个实施方案中，本发明提供一种从天南星分离3-O-(9,12-十 八碳二烯酰基)-甘油基-β-D-吡喃半乳糖苷的方法，其中所述方法包括：
提供天南星根的丁醇-可溶性提取物；和
从天南星根的丁醇-可溶性提取物分离3-O-(9,12-十八碳二烯酰基)-甘油基-β-D-吡喃半乳糖苷。在一个实施方案中，3-O-(9,12-十八碳二烯酰基)-甘油基-β-D-吡喃半乳糖苷是根据本发明从天南星分离的。
在另一个实施方案中，本发明提供一种从天南星分离N-(β-D-呋喃核糖-1-基)-苯丙氨酸的方法，其中所述方法包括：
提供天南星根的水溶性提取物；和
从天南星根的水溶性提取物分离N-(β-D-呋喃核糖-1-基)-苯丙氨酸。
如本文使用的术语“基本上由...组成”将本发明的范围限制于指定步骤，并且其不会实质性影响本发明的基本的新特征，即，一种用于获得天南星提取物和/或从天南星分离生物活性化学组分的方法。通过使用“基本上由...组成”，制备天南星提取物的方法不包含采用未指明溶剂提取或接触天南星的任何未指明步骤。然而，通过使用术语“基本上由...组成”，所述方法可包括不会实质性影响从天南星提取生物活性化学组分的步骤，包括收集或回收天南星提取物；浓缩该天南星提取物；将多次天南星提取物合并成单一组合物；将该天南星提取物冻干或干燥成固体或半固体组合物；将该天南星提取物配制成药物组合物，比如溶液、混悬剂、片剂、胶囊、颗粒剂、粉剂、煎剂和酊剂；混合该天南星提取物与可药用载体、赋形剂、矫味剂、缓冲剂、和/或乳化剂；并且包装该天南星提取物。
促进创伤愈合
本发明的另一个方面提供天南星的C1-C4醇可溶性提取物、天南星的水溶性提取物、分离的化合物包括3-O-(9,12-十八碳二烯酰基)-甘油基-β-D-吡喃半乳糖苷、N-(β-D-呋喃核糖-1-基)-苯丙氨酸和腺苷、及其盐、以及包含一种或多种前述成分的治疗组合物，用于促进创伤愈合。在一个特定实施方案中，本发明提供分离的3-O-(9,12-十八碳二烯酰基)-甘油基-β-D-吡喃半乳糖苷用于促进创伤愈合的用途。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于促进受试者中创伤愈合的方法，其中所述方法包括向具有创伤的受试者施用治疗有效量的药物组 合物，该药物组合物包含天南星的C1-C4醇可溶性提取物、天南星的水溶性提取物、和/或一种或多种分离的化合物3-O-(9,12-十八碳二烯酰基)-甘油基-β-D-吡喃半乳糖苷、N-(β-D-呋喃核糖-1-基)-苯丙氨酸、或腺苷、或其盐。
在药物组合物的某些实施方案中，天南星提取物的重量百分数为至少50%，或者高于50%的任何重量百分数，包括但不限于高于60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%(w/w)。
在一个实施方案中，所述组合物经由局部途径施用。在一个实施方案中，所述组合物局部施用至创伤区域，比如皮肤创伤或皮肤区域的创伤组织上(例如，创伤的皮下组织)。
如本文使用的术语“创伤”包括急性和慢性创伤，以及开放性创伤和闭合性创伤。可以根据本发明治疗的创伤的实例包括皮肤创伤、切除伤、撕裂伤、烧伤、擦伤、刺伤或贯通伤、外科创伤、挤压伤和溃疡(比如糖尿病性溃疡、烧伤性溃疡、创伤性溃疡或其它慢性溃疡)。
在一个特定的实施方案中，本发明提供一种用于促进受试者中创伤愈合的方法，其中所述方法包括向受试者的创伤区域局部施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含天南星的水溶性提取物和/或一种或多种分离的化合物3-O-(9,12-十八碳二烯酰基)-甘油基-β-D-吡喃半乳糖苷、N-(β-D-呋喃核糖-1-基)-苯丙氨酸、或腺苷、或其盐，其中所述方法促进创伤的闭合和/或愈合。
在一个实施方案中，本发明提供一种促进受试者创伤愈合的方法，其中所述方法包括向受试者的创伤区域局部施用治疗有效量的包含天南星的水溶性提取物的药物组合物，其中所述水溶性提取物包含一种或多种下列化合物∶尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤、腺苷、鸟嘌呤、异鸟嘌呤核苷、N-(β-D-呋喃核糖-1-基)-苯丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酰基苯丙氨酸、2,6-脱氧果糖嗪、酪氨酸、3-O-(9Z,12Z-十八碳二烯酰基)-甘油基-β-D-吡喃半乳糖苷、和β-D-呋喃果糖/β-D吡喃果糖。
在一个特定实施方案中，本发明提供一种用于促进受试者中创伤愈合的方法，其中所述方法包括向受试者的创伤区域局部施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含分离的化合物3-O-(9,12-十八碳二烯 酰基)-甘油基-β-D-吡喃半乳糖苷和/或分离的化合物腺苷、或其盐，其中所述方法促进创伤的闭合和/或愈合。如本文使用的术语“受试者”描述为生物体，包括哺乳动物比如灵长类，可以向其提供采用根据本发明的组合物的治疗。可以受益于所公开的治疗方法的哺乳动物种类包括，但不限于：类人猿、黑猩猩、猩猩、人类、猴子；驯养的动物，比如犬、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、鸡；及其它动物，比如小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。
如本文使用的术语“有效量”指能够促进创伤愈合或以其它方式能够产生预期治疗效果的量。
在另一个实施方案中，本发明提供一种促进角质形成细胞的迁移和/或增殖的方法，其中所述方法包括：向角质形成细胞施用有效量的组合物，该组合物包含天南星的C1-C4醇可溶性提取物、天南星的水溶性提取物、和/或一种或多种选自3-O-(9,12-十八碳二烯酰基)-甘油基-β-D-吡喃半乳糖苷、N-(β-D-呋喃核糖-1-基)-苯丙氨酸、腺苷和其任何盐的分离的化合物。
在一个特定实施方案中，本发明促进受试者中角质形成细胞的迁移和/或增殖。
在另一个实施方案中，本发明提供一种促进成纤维细胞生成胶原蛋白的方法，其中所述方法包括：向成纤维细胞施用有效量的组合物，该组合物包含天南星的C1-C4醇可溶性提取物、天南星的水溶性提取物、和/或分离的化合物3-O-(9,12-十八碳二烯酰基)-甘油基-β-D-吡喃半乳糖苷或其盐。
在一个特定实施方案中，本发明促进受试者中成纤维细胞生成胶原蛋白。
在一个实施方案中，天南星的C1-C4醇可溶性提取物溶于C1-C4醇、或水-C1-C4醇混合物中。水-C1-C4-醇混合物(例如，乙醇-水、甲醇-水)可以包含至少(v/v)5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的C1-C4-醇(例如，乙醇、甲醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇)。
治疗组合物、剂型和给药途径
在另一个方面，本发明提供用于促进创伤愈合的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物被配制用于局部施用。在某些实施方案中，本发明的药物组合物被配制成创伤敷料、乳膏剂、软膏剂、泡沫剂、洗剂、硬膏剂、凝胶、乳剂、水凝胶或皮肤贴剂。
在一个实施方案中，本发明提供包含治疗有效量的本发明的天南星提取物和任选的可药用载体的药物组合物。在一个特定实施方案中，天南星提取物在创伤愈合组合物中的重量百分数高于50%重量，或高于50%的任何百分数(w/w)，包括高于60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%(w/w)。本发明还提供包含从天南星分离的化合物(例如3-O-(9,12-十八碳二烯酰基)-甘油基-β-D-吡喃半乳糖苷、N-(β-D-呋喃核糖-1-基)-苯丙氨酸、和腺苷)或其盐的治疗组合物或药物组合物。
术语"载体"指与化合物一起施用的稀释剂、辅助剂、赋形剂或溶媒。这样的药物载体可以为无菌液体，比如水和油，包括石油比如矿物油；植物油，比如花生油、大豆油和芝麻油；动物油；或合成来源的油。盐溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液体载体，特别地用于可注射溶液。
本发明的治疗组合物或药物组合物可以配制成中性或盐形式。可药用的盐包括，但不限于：与盐酸、磷酸、醋酸、草酸、酒石酸、钠、钾、铵、钙、氢氧化铁形成的盐等。
本发明还提供药物包装或套件，其包括填充一种或多种成分（例如本发明的提取物、化合物、载体或药物组合物）的一个或多个容器。
本发明的组合物也可以按照中医学实践配制。在治疗特定疾病、病症或障碍方面有效的剂型的组成和剂量将取决于通过标准临床技术确定的疾病、病症或障碍的性质。
处方量的中药可以容易地被制成适于向人类或动物施用的任何药物形式。合适的形式包括，例如酊剂、煎剂和干提取物。所有上述提及的方法均是本领域技术人员已知、书籍中有描述且是草药执业医师常用的。
提取物是药物原料的主要成分的浓缩制品。典型地，主要成分是通 过将原药材悬浮在选择的适当溶剂中而从原药材(例如草药)提取的。提取方法可以进一步利用浸润、渗滤、再渗滤、逆流提取、涡旋提取或二氧化碳超临界(温度/压力)提取。在过滤除去草药碎屑之后，可以利用喷雾干燥、真空烘箱干燥、流化床干燥或冷冻干燥将提取液进一步蒸发，浓缩以得到软提取物和/或最终得到干提取物、浸膏。可以将软提取物或干提取物进一步溶于合适的液体中至用于施用的期望浓度或加工成剂型比如乳膏剂、软膏剂、丸剂、胶囊等。
合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、干燥脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。如果需要，治疗组合物也可以包含微量的润湿剂或乳化剂、或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、混悬剂、乳剂、片剂、胶囊、颗粒剂、粉剂、缓释剂型等形式。该组合物可以采用常规粘合剂和载体比如甘油三酯配制。合适的药物载体的实例描述在E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中。这样的组合物包含治疗有效量的治疗组合物和适量的载体，以便提供合适地施用于患者的形式。剂型应当适合施用方式。
本发明的提取物、化合物和组合物可以通过标准途径施用于待治疗的受试者，所述标准途径包括局部、口服或肠胃外施用，所述肠胃外施用包括静脉内、皮下、局部、透皮、皮内、经粘膜、腹膜内、肌内、囊内、眶内、心内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射、输注和电穿孔，以及作为插入(暂时性或永久性地)受试者中的任何医疗装置或物体的组分共同施用。在优选的实施方案中，本发明的组合物通过局部施用而施用于受试者。
可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据待治疗的病症的类型和受试者变化。一般而言，治疗组合物包含约5%至约95%的活性成分(w/w)。更特别地，治疗组合物包含约20%(w/w)至约80%或约30%至约70%的活性成分(w/w)。
材料和方法
植物来源
在中国黑龙江省采集的东北天南星(一种天南星亚种)的根购自李熊记有限公司(Lee Hoong Kee Ltd.，香港)。
化学部位分离
进行化学部位分离以获得来自天南星的提取物和部位。将生草药天南星(17kg)在烘箱中60℃下干燥2小时，粉碎成小块，并浸泡于70%EtOH/H₂O中30分钟(材料与溶剂的比例=1:5)，之后进行溶剂提取。
采用回流装置提取2小时，并重复3次以提供粗溶剂提取物(T,950g)。然后，通过使粗提取物RA-T经具有不同极性的溶剂处理而依次产生不同部位提取物。首先，将RA-T溶于水(按体积计1:5)中，用氯仿(按体积计1:1)分配提取三次，然后汇集在一起并浓缩，从而得到氯仿部位提取物(RA-CF,102g)。接着，用正丁醇(按体积计1:1)处理其余RA-T三次，将得到的溶剂提取物汇集在一起并浓缩，从而得到丁醇部位提取物(RA-BU,107g)。然后，将粗提取物的残余部分浓缩，从而得到水部位提取物(RA-WA,720g)。
使用D101大孔树脂色谱进一步分离RA-WA部位提取物(720g)。将用乙醇预洗涤且用水平衡的大孔树脂(D101)填充到柱中(10×80cm)。将RA-WA部位(700g)溶于水(～2L)中，并装载到柱上。然后，将该柱子用H₂O(～42L)、60%EtOH/H₂O(～35L)和96%EtOH/H₂O(30L)连续洗脱。分别得到607g和77g重量的两种部位RA-WA1(来自H₂O的洗脱物)和RA-WA2(来自60%EtOH/H₂O和96%EtOH/H₂O的合并洗脱物)。
使用D101大孔树脂色谱分离RA-BU部位。将RA-BU(100g)部位提取物溶于500mL的20%EtOH/H₂O中，并装载到预填充柱。将该柱用H₂O(～6L)、30%EtOH/H₂O(～25L)、60%EtOH/H₂O(～20L)和96%EtOH/H₂O(10L)连续洗脱。如此，得到四个部位RA-BU1、RA-BU2、RA-BU3和RA-BU4。
通过乙醇沉淀，将RA-WA1部位又分离成两个部位。将RA-WA1(～138g)溶于～300mL的H₂O中，通过持续搅拌慢慢地加入96%乙醇/H₂O(～600mL)，并使该溶液在室温下静置过夜，以分离成两层。通过过滤分离上清液层和沉淀的残余物。通过加入另外300mL的96%乙醇/H₂O 使所述溶液进行第二次沉淀。获得第二批上清液层和沉淀的残余物，并将两批次的各溶液和残余物合并在一起。该过程进行三次，合并三个上清液层并干燥为RA-WA1-1，合并沉淀物并干燥为RA-WA1-2(42g)。
通过LH-20柱色谱分离RA-WA1-2部位。填充LH-20柱并用H2O平衡，将RA-WA1-2(11g)溶于～10%MeOH/H₂O(22mL)中，并将该溶液小心加载在柱上。最初用10%MeOH/H₂O洗脱该柱，并将MeOH连续递增为20%MeOH/H₂O、30%MeOH/H₂O、40%MeOH/H₂O和50%MeOH/H₂O。从该色谱法得到13个部分，其可用于进一步纯化。
通过硅胶(Merck,0.04-0.063μm)柱色谱分离RA-BU-4部位。将RA-BU-4溶于MeOH中，并与粗硅胶(0.063-0.20μm)混合，通过溶剂蒸发得到干燥样品。将干燥样品装载到柱上，并用5%MeOH/CHCl₃洗脱，梯度递增至10%、20%、50%和100%M_eOH。基于TLC分析监测并且合并洗脱的部分，得到总共42个部分。
各部位的分析
对于从RA-WA获得的高极性部分，采用常规反相C-18柱的HPLC不再适于其分析。亲水性相互作用液相色谱(HILIC)是一种用于分离极性和亲水性化合物的替代性和直接的色谱技术。使用Cosmosil HILIC填充柱(4.6×150mm)、PDA检测器和乙腈/H₂O梯度作为流动相分析下列部分RA-WA、RA-WA1、RA-WA2、RA-WA1-1、RA-WA1-2和RA-WA1-2-1至RA-WA1-2-13，并且优化色谱条件以便用于制备色谱。
化合物分离
通过LH-20柱色谱进一步纯化亚部分（sub-fraction）RA-BU4-33。将样品溶于MeOH(～2mL)中，小心装载在预平衡柱上，并用MeOH洗脱。
基于TLC分析获得作为纯组分的第四个部分RA-BU4-33-4，称为G192-C07。通过使用NMR谱、MS波谱测定并与文献数据对比解析，确定化合物G192-C07的结构。
通过制备级Cosmosil HILIC填充柱(20×250mm)进一步分离部分RA-WA1-2-08、RA-WA1-2-09、RA-WA1-2-10、RA-WA1-2-11、RA-WA1-2-12和RA-WA1-2-13。收集对应于UV吸收和色谱的保留时间(Rt)的峰。分离并鉴定来自RA-WA1-2-08的化合物G192-C16、G192-C17和G192-C18；来自RA-WA1-2-09的G192-C16和G192-C17；来自RA-WA1-2-10的G192-C19、G192-C23、G192-C28和G192-C29；来自RA-WA1-2-11的G192-C22和G192-C25；来自RA-WA1-2-12的G192-C09和G192-C11；来自RA-WA1-2-13的G192-C10和G192-C15。
分析所有分离的化合物，利用NMR谱、MS波谱测定并与报告数据比较，解析其结构。
化合物物理性质的分析
¹H、¹³C和2D NMR波谱在Varian Mercury300和500MHz NMR波谱仪上记录。将化合物溶于CD₃OD或DMSO-d₆或CD₃OD/H₂O(3-10mg/mL)中，并在室温下得到所有波谱。使用溶剂峰作为参照(对于CD₃OD为¹H3.31ppm和¹³C49.05ppm，对于DMSO-d₆为¹H2.50ppm、¹³C39.50ppm)，以ppm报告化学位移。使用Finnigan MAT LCQ，在Sheath气体60psi、辅助气体20psi、喷雾电压4.5KV和毛细管电压30V下获得ESI-MS图谱。在室温下，使用正和负模式获得由[M+H]⁺、[M+Na]⁺或[M-H]^-表示的质谱。在室温下，使用PERKIN-ELMER241偏光计在MeOH/H₂O中测量旋光度。
采用大孔树脂(D101,中国天津)和LH-20(40-70μm，Amersham Pharmacia Biotech AB，Uppsala,Sweden)进行柱色谱。用配备有2996Photodiode Array Detector的Waters2545Binary Gradient Module泵系统，使用Cosmosil HILIC填充柱(20×250mm i.d.)进行制备HPLC。用具有2996Photodiode Array Detector的Waters系统，使用Cosmosil HILIC填充柱(4.6×150mm i.d.,4.6μm)进行分析HPLC。
使用LDH分析法测定细胞毒性
将成年角质形成细胞保持在补充有人角质形成细胞生长补充剂(HKGS,Cascade Biologics)的Epilife(Cascade Biologics)培养基中。在第0 天，将角质形成细胞以2.5×10⁵细胞/孔的密度接种在48孔培养板(Falcon)中。在5%CO₂和37℃下孵育过夜之后，将天南星的总提取物(RA-T)、丁醇(RA-BU)、氯仿(RA-CF)和水(RA-WA)部位(100μg/mL)加入到所述细胞中。分别使用50ng/mL的表皮生长因子(EGF,Sigma)和DMSO(0.1%)作为阳性对照和溶媒对照。
在5%CO₂和37℃下孵育过夜之后，根据制造商的说明(Roche)，使用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒进行细胞毒性检测。通过分光光度酶标仪(microtiter reader)，在490nm波长下检测LDH水平。
免疫印迹
在具有低血清生长补充剂(LSGS,Cascade Biologics)的M106培养基(Cascade Biologics)中的人成年成纤维细胞以1×10⁷/培养板接种在60mm培养板(Falcon)中，并且在5%CO₂和37℃下孵育过夜24小时。在第2天，将现有培养基用0.2%LSGS培养基替代，并用100μg/mL的天南星提取物和不同部位提取物处理各个培养板。分别使用50ng/mL的成纤维细胞生长因子(EGF,Sigma)和DMSO(0.1%)作为阳性对照和溶媒对照。
在第3天，通过在4℃下以14000rpm离心10分钟获得细胞溶解产物。测定样品的蛋白质浓度。在10%SDS-PAGE上装载等量的蛋白质(30μg)和I型胶原蛋白(300ng,Invitrogen)并运行，转移到硝基纤维素膜。将该膜在无脂奶(在TBS中5%奶、0.05%吐温-20)中阻断2小时，在4℃下用胶原蛋白I一级抗体(R和D系统)孵育过夜，并洗涤三次，每次都用TBS(0.5%Tween-20)洗涤10分钟。然后，用兔HRP缀合的二级抗体(Cell Signaling)孵育膜，并且如上所述洗涤。然后，将该膜转移，并使用ECL免疫印迹试剂盒(GE Healthcare UK Ltd)展开。
体外擦伤创伤愈合测定
将群体倍增时间后期的(PD≥15)人新生的或成年角质形成细胞用胰蛋白酶处理，并在HKGS(Cascade Biologics)和EpiLife(Cascade Biologics)中以3×10⁶细胞/孔的密度接种在6-孔组织培养培养板(Falcon)上。在5%CO₂和37℃的室中孵育过夜之后，使用无菌p1000微量移液管尖端进行对切擦伤，并用PBS冲洗细胞两次，然后在测定期间使用不含补充剂的基础培养基替代。
将天南星的总提取物、各部位提取物和化合物稀释在不含补充剂的基础培养基中，并加入各孔中。使用50ng/mL的EGF(Sigma)作为阳性对照，并使用DMSO(0.1%)作为溶媒对照。
对于每个擦伤，使用下列标准选择两个相邻区域：在擦伤内的细胞碎片相对很少；均匀擦伤，具有直线边缘；使用10X物镜在单视野下可见两个边缘；视野不太接近任一擦伤末端。从第1天开始连续5天收集图像。在整个测定期间，每天补充培养基和提取物。
增殖检测
将群体倍增时间早期的(PD≤8)人新生角质形成细胞在HKGS(Cascade Biologics)和EpiLife(Cascade Biologics)基础培养基中以1000细胞/孔的密度接种在96-孔组织培养平板(Falcon)上。在37℃和5%CO₂室中孵育过夜之后，用PBS洗涤细胞两次，然后在整个检测期间用不含补充剂的基础培养基代替。
将天南星的总提取物、各部位提取物和化合物稀释在不含补充剂的基础培养基中，并加入各孔中，一式三份。使用50ng/mL的EGF(Sigma)作为阳性对照，并使用DMSO(0.1%)作为溶剂对照。然后，将处理的细胞放回37℃和5%CO₂室中培育48小时。
根据制造商的方案，使用MTT(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑鎓溴化物)代谢测定(USB)监测细胞的增殖能力。在处理后第3天、第4天和第5天，通过分光光度酶标仪在570nm波长下检测MTT水平。
体内切割创伤愈合测定
所有实验都是采用从香港科技大学动物中心获得的20-25g雄性“印记控制区”(ICR)小鼠进行。该研究经香港科技大学动物伦理委员会批准，且根据用于试验目的的动物护理和使用实施的指引进行。
简而言之，通过i.p.注射水合氯醛使一月龄的ICR小鼠麻醉。如在Gal et al.,2008Vet.Med.,52:652-659中描述的，使用6-mm直径的无菌穿孔机刮每只小鼠的背部产生两个全皮层创伤。在受创伤之后，每只小鼠在一个创伤接受天南星提取物，其它创伤保持未处理。然后，将每只小鼠分别饲养。小鼠每天接受治疗两次。每2天，使用数字照相机对每个创伤照相。测量图像中的创伤面积，并与溶媒-处理的小鼠对照比较。
实施例
下列为阐述用于实施本发明实施方案的实施例。这些实施例不应当看作是限制。除非另有说明，所有的溶剂混合物比例是以体积计。
实施例1—天南星的水提取物在体外闭合成年人角质形成细胞的擦伤创伤。
对于创伤床的闭合，需要角质形成细胞的增殖和迁移。为了鉴别具有创伤愈合活性的治疗剂，重要的是评估所述试剂是否促进角质形成细胞的迁移和/或增殖。
为了检查草药天南星(RA)在擦伤创伤的体外闭合中的功效，用RA的粗提取物(RA-T)或不同部位提取物(100μg/mL)孵育人角质形成细胞。
如图1所示，水部位(RA-WA)和阳性对照表皮生长因子(EGF，50ng/mL)显示出最高的创伤-愈合效应，并在第2天闭合创伤。丁醇部位(RA-BU)也显示出创伤愈合活性。用粗提取物(RA-T)和氯仿部位(RA-CF)处理的擦伤创伤在整个测定期间仍为开放的。
实施例2—天南星的水部位提取物和粗提取物诱导人成年成纤维细胞中I型胶原蛋白的生成
成纤维细胞形成胶原蛋白基质是创伤愈合过程中的关键步骤。在创伤周围的免疫细胞诱导促炎症反应的初期之后，成纤维细胞开始在创伤床周围和其上增殖和迁移。增殖中的成纤维细胞产生胶原蛋白，其形成覆盖创伤床的基质。该基质防止创伤区域的进一步损伤，并充当用于包括血管生成和结缔组织构建的组织修复过程的支架结构。目前，可以增加人成纤维细胞中胶原蛋白产生的治疗剂限于血小板衍生生长因子(PDGF)和某些类型的酸。
采用RA的不同部位提取物(100μg/mL)孵育人成年成纤维细胞。使用成纤维细胞生长因子(FGF，50ng/mL)作为阳性对照。使用纯化的I型胶原蛋白蛋白质(Col I,300ng，Invitrogen)作为外部阳性对照，并使用0.1%的DMSO（对照）作为溶媒对照。在24小时处理之后获得细胞溶解产物，并测定样品的蛋白质浓度。将等量的蛋白质(30μg)和I型胶原蛋白加载在10%SDS-PAGE上并运行，转移到硝基纤维素膜。用兔HRP 缀合的二级抗体(Cell Signaling公司)孵育膜。然后，将该膜转移，并展开用于分析。
如图2所示，RA的总提取物和WA部位增加人成年成纤维细胞中I型胶原蛋白的表达。阳性对照成纤维细胞生长因子(FGF)略微增加胶原蛋白的表达。I型胶原蛋白是存在于人体中的最大量的胶原蛋白类型。
实施例3—天南星的水部位提取物和粗提取物不会引起人新生的角质形成细胞的细胞死亡
乳酸脱氢酶(LDH)测定是一种用于评估由药物化合物的外源性处理引起的细胞死亡的灵敏可靠的筛选方法。LDH是一种存在于所有细胞中并在质膜被破坏时释放到上清液中的胞质酶。
检查RA提取物和不同部位提取物对新生的角质形成细胞的作用。用RA不同部位提取物(100μg/mL)处理人新生的角质形成细胞。在孵育过夜之后，测量释放到培养基中的乳酸脱氢酶(LDH)。将细胞死亡计算为与溶媒对照（0.1%DMSO，对照）相比的百分数。使用0.1%的Triton-X100作为阳性对照。Triton-X100是一种破裂细胞膜和引起细胞死亡的非离子表面活性剂。一式两份进行测定。
如图3所示，虽然RA-CF和RA-BU部位提取物分别引起重度和中度细胞死亡，但是与溶媒对照(对照，0.1%DMSO)相比，粗提取物(RA-T)和水部位提取物(RA-WA)不会引起细胞死亡。
实施例4—天南星的水部位提取物增加人新生的角质形成细胞的增殖
角质形成细胞的增殖是创伤愈合过程的另一个重要部分，其中角质形成细胞的迁移和增殖有利于创伤床的闭合。
检查RA提取物和不同部位提取物对增殖人角质形成细胞的作用。根据制造商的方案，使用MTT(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑鎓溴化物)代谢分析来测量角质形成细胞的增殖能力。MTT在活细胞中被线粒体脱氢酶还原成蓝色甲臜（formazan）产物，其可以被洗脱且以分光光度计定量。一式两份进行该测定，并重复两次。数值可以表示为平均值±SEM。*表示当与对照(Ctrl)比较时p＜0.05，Student t检验。
特别地，将人新生的角质形成细胞以在具有基础培养基的生长补充 物中1000个细胞/孔的密度接种在96-孔组织培养板上。在孵育过夜之后，将稀释在不含补充剂的基础培养基中的RA提取物(100μg/mL)加入到各孔中，一式三份。使用表皮生长因子(EGF)(50ng/mL)作为阳性对照，并使用0.1%DMSO作为溶媒对照(Ctrl)。
如图4所示，当与溶媒对照(Ctrl,0.1%DMSO)相比时，在第3天，RA-WA部位(100μg/mL)显著地增加了角质形成细胞的增殖。使用EGF(50ng/mL)作为阳性对照。EGF是一种已知的角质形成细胞的增殖剂。
实施例5—天南星的水部位亚部分在体外闭合成年人角质形成细胞中的擦伤创伤
为了测定RA的WA亚部分在闭合体外擦伤创伤中的功效，使用人角质形成细胞测试RA-WA1和RA-WA2(1μg/ml和10μg/ml)。使用如实施例1所描述的方法进行擦伤测定。评估1μg/ml和10μg/ml的RA-WA1和RA-WA2闭合体外创伤缺口的能力。
如图5所示，第四天，1和10μg/mL的RA-WA1、及10μg/mL的RA-WA2闭合了创伤。在整个测定期间，用1μg/mL的RA-WA2和溶媒对照(水)处理的擦伤创伤仍是开放的。左图：在4-天处理之后采集细胞间隙的代表性图像；右图：对创伤闭合进行定量，并表示为各种处理之后创伤闭合的百分数。重复测定三次，数值表示为平均值±SEM。*表示当与对照(水)比较时p＜0.05，Student t检验。
实施例6—天南星的水部位的亚部分促进小鼠切割创伤模型中的创伤闭合
通过i.p.注射水合氯醛使一月龄的“印记对照区”(ICR)小鼠麻醉。使用6毫米直径的无菌穿孔机刮每只小鼠的背部产生两个全皮层创伤。在受创伤之后，将小鼠分成如下五组(每组三只小鼠)：第一组：通过局部施用4mg/kg的WA部位提取物处理每只小鼠的一个创伤，其它创伤保持未处理；第二组：通过局部施用40mg/kg的WA部位提取物处理每只小鼠的一个创伤，其它创伤保持未处理；第三组：通过局部施用4mg/kg的RA-WA1亚部分处理每只小鼠的一个创伤，其它创伤保持未处理；第四组：通过局部施用40mg/kg的RA-WA1亚部分处理每只小鼠的一个创伤，其它创伤保持未处理；第五组：通过局部施用水(10μl)处理每只小 鼠的一个创伤，其它创伤保持未处理。然后，将每只小鼠分别饲养，并每天两次用RA提取物的相应部位提取物或部分处理。每2天使用数字照相机对每个创伤照相，共照相8天。追踪创伤闭合的进展，并对创伤区域定量。
图6表示在小鼠切割创伤模型中，WA部位的亚部分RA-WA1促进创伤闭合。图6A表示局部施用RA-WA部位提取物和RA-WA1在第2天促进创伤闭合。RA-WA1显著地促进了小鼠模型中创伤闭合。数值表示为平均值±SEM。*表示当与对照(水)比较时p≤0.05，Student t-检验。图6B表示局部施用4和40mg/kg的RA-WA1促进创伤闭合。在整个8天研究过程期间，用40mg/kg的RA-WA1处理的小鼠中创伤闭合比用较低浓度的RA-WA1(4mg/kg)和水处理的小鼠中创伤闭合的更快。数值表示为平均值±SEM。图6C表示通过局部施用40mg/kg RA-WA1和水处理的小鼠在第8天的图像。
实施例7—RA-WA部位和分离得到化合物的HPLC分析
建立HPLC色谱方法分析WA部位、亚部分(RA-WA1和RA-WA1-2)和分离的化合物的特征。使用HILIC亲水性相互作用色谱柱(4.6×150mm)作为固定相，同时使用乙腈(ACN)和水作为流动相梯度洗脱，从95%ACN/5%H₂O开始，在35分钟内增加至70%ACN/30%H₂O，在45分钟内继续增加至20%ACN/80%H₂O，并且在50分钟内增加至95%ACN/5%H₂O(参见表1)。使用光电二极管阵列检测器作为检测器。
以相同HPLC条件分析所有的RA-WA部位和分离的化合物，并在254nm下检测UV吸光度。RA-WA部位和分离的化合物的HPLC图谱以及其结构显示在图7中。比较RA-WA与分离化合物的保留时间，共鉴定了11个峰。
表1


实施例8—从天南星分离化合物
从天南星提取物和不同部位分离得到多种化合物。
得到化合物G192-C07，为浅黄色油状物。在正离子模式ESI-MS中，基于m/z[M+Na]⁺为539.2的分子离子峰，确定G192-C07的分子式为C₂₇H₄₈O₉。通过NMR和MS鉴定G192-C07的结构为3-O-(9Z,12Z-十八碳二烯酰基)-甘油基-β-D-吡喃半乳糖苷。
¹H-NMR(300和500MHz,CD₃OD,ppm)δ:4.22(d,8.2,Gal-1),3.53(m,Gal-2),3.51(m,Gal-3),3.83(d,2.7,Gal-4),3.49(m,Gal-5),3.74(2H,m,Gal-6),3.92,3.66(2H,H-1′),3.99(1H,t,4.8,H-2′),4.14(2H,dd,5.4,1.2,H-3′),2.33(2H,t,7.5,H-2),1.60(2H,m,H-3),1.3(8H,m,H-4,5,6,7),2.05(2H,m,H-8),5.35,5.33(4H,m,H-9,10,H-12,13),2.78(2H,m,H-11),1.3(4H,m,H-14,15),1.33(2H,m,H-16),1.26(2H,m,H-17),0.9(3H,m,H-18)。
¹³C-NMR(75MHz,CD₃OD,ppm)δ:105.2(Gal-1),72.5(Gal-2),76.7(Gal-3),70.2(Gal-4),74.7(Gal-5),62.4(Gal-6),71.8(C-1′),69.5(C-2′),66.5(C-3′),175.4(C-1),130.9,129.1,130.8,129.0(C-9,10,C-12,13),34.9(C-2),25.9(C-3),30.7-30.2(C-4,5,6,7和C-14,15),28.1(C-8),26.5(C-11),32.6(C-16),23.6(C-17),14.5(C-18)。
得到化合物G192-C09，为白色粉末。UV吸收位于λ_max(CH₃CN)∶253.2nm。在正离子模式ESI-MS中，基于m/z[M+H]⁺284.00、[2M+H]⁺566.92和[2M+Na]⁺589.11的分子离子峰，确定G192-C09的分子式为C₁₀H₁₃N₅O₅。通过NMR和MS鉴定G192-C09的结构为2-羟基腺苷(异鸟嘌呤核苷)。
¹H-NMR(300和500MHz,CD₃OD,ppm)δ:7.97(1H,s,H-8),5.85(1H,d,J6.0Hz,H-1'),4.65(1H,H-2'),4.34(1H,m,H-3'),4.17(1H,H-4'),3.86,3.77(2H,dd,H-5').¹³C-NMR(75MHz,CD₃OD,ppm)δ:156.1(C-2),147.6(C-6),142.9(C-8),120.0(C-4),116.2(C-5),90.7(C-1′),75.8(C-2') 71.7(C-3′),87.3(C-4'),62.6(C-5′)。
得到化合物G192-C10，为浅黄色胶状物。在正离子模式ESI-MS中，基于m/z[M+H]⁺343.55的分子离子峰，确定G192-C10的分子式为C₁₂H₂₂O₁₁。通过NMR和MS鉴定G192-C10的结构为β-D-呋喃果糖基-(2→5)-吡喃果糖。
¹H-NMR(300MHz,CD₃OD/D₂O,ppm)δ:4.05,4.04,4.00,3.83,3.78,3.73,3.70,3.68,3.64,3.62,3.49,3.48,3.47,3.45。¹³C-NMR(75MHz,CD₃OD/D₂O,ppm)δ:103.2,99.2,83.3,77.5,76.8,71.9,71.3,69.4,65.9,64.8,64.5,64.3。
得到化合物G192-C11，为白色粉末，UV吸收位于λ_max(CH₃CN)∶259.1和207.1nm。在正离子模式ESI-MS中，基于m/z[M+H]⁺268.32的分子离子峰，确定G192-C11的分子式为C₁₀H₁₃N₅O₄。通过NMR和MS鉴定G192-C11的结构为腺苷。
¹H-NMR(300和500MHz,DMSO-d₆,ppm)δ:8.10(1H,s,H-2),8.08(1H,s,H-8),5.86(1H,d,J6.0Hz,H-1'),4.60(1H,H-2'),4.14(1H,m,H-3'),3.96(1H,H-4'),3.68,3.65(2H,dd,H-5')。¹³C-NMR(75MHz,DMSO-d₆,ppm)δ:156.2(C-6),151.9(C-2),148.7(C-4),139.2(C-8),118.1(C-5),88.1(C-1′),72.9(C-2'),72.1(C-3′),85.6(C-4'),61.5(C-5′)。
得到化合物G192-C15，为无色凝胶。在正离子模式ESI-MS中，基于m/z[M+H]⁺为203.61的分子离子峰，确定G192-C15的分子式为C₆H₁₂O₆。通过NMR和MS鉴定G192-C15的结构为β-D-呋喃果糖和β-D-吡喃果糖组成的果糖。
¹H-NMR(300MHz,CD₃OD/D₂O,ppm)δ:4.06,3.99,3.85,3.79,3.75,3.64,3.49。¹³C-NMR(75MHz,CD₃OD/D₂O,ppm)δ:102.8,71.1,71.1,69.2,65.7,65.4。
得到化合物G192-C16，为白色粉末，UV吸收位于λ_max(CH₃CN)：209nm。在正离子模式ESI-MS中，基于m/z[M+H]⁺166.48的分子离子峰，和在负离子模式中m/z[M-H]^-为164.43的分子离子峰，确定G192-C16的分子式为C₉H₁₁NO₂。通过NMR和MS鉴定G192-C16的结构为2-氨基-3-苯基丙酸(苯丙氨酸)。
¹H-NMR(300MHz,CD₃OD/D₂O,ppm)δ:8.10(1H,s,H-2),7.14-7.26(5H,m,芳香质子),3.77(1H,dd,H-2'),3.14,2.92(2H,dd,H-1')。¹³C-NMR(75MHz,CD₃OD/D₂O,ppm)δ:174.5(C-3′),136.3(C-1),130.4,130.1(C-2,6和C-3,5),128.6(C-4),57.5(C-2′),37.6(C-1')。
得到化合物G192-C17，为浅黄色糊状物，UV吸收λ_max(CH₃CN)：257.9和207.1nm。在负离子模式ESI-MS中，基于m/z[M-H]^-为243.43的分子离子峰，确定G192-C17的分子式为C₉H₁₂N₂O₆。通过NMR和MS鉴定G192-C17的结构为尿嘧啶-β-D-呋喃核糖苷(ribofuranoside，尿苷)。
¹H-NMR(300MHz,CD₃OD,ppm)δ:8.01(1H,d,J=8.4Hz,H-4),5.70(1H,d,J=8.4Hz,H-5),5.89(1H,d,J=4.2Hz,H-1'),4.20(1H,H-2'),4.15(1H,m,H-3'),4.01(1H,H-4'),3.85,3.74(2H,dd,H-5').¹³C-NMR(75MHz,CD₃OD,ppm)δ:166.2(C-6),152.4(C-2),142.5(C-4),102.7(C-5),90.6(C-1′),75.4(C-2'),71.1(C-3′),86.3(C-4'),62.1(C-5′)。
得到化合物G192-C18，为白色粉末，UV吸收λ_max(CH₃CN)：253.2和273.3nm。在正离子模式ESI-MS中基于m/z[M+H]⁺为152.1和[M+K]⁺为189.9的分子离子峰，确定G192-C18的分子式为C₅H₅N₅O。通过NMR和MS鉴定G192-C18的结构为2-氨基-6-羟基嘌呤(鸟嘌呤)。
¹H-NMR(300MHz,CD₃OD/H₂O,ppm)δ:8.46(1H,s,H-8).¹³C-NMR(75MHz,CD₃OD/H₂O,ppm)δ:162.4,153.7,145.5,152.7,116.3。
得到化合物G192-C19，为白色粉末，UV吸收λ_max(CH₃CN)：224.8和276.9nm。在正模式下的ESI-MS中，基于m/z[M+H]⁺为182.33的分子离子峰，确定G192-C18的分子式为C₉H₁₂NO₃。通过NMR和MS鉴定G192-C18的结构为2-氨基-3-(4-羟苯基)-丙酸(酪氨酸)。
¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆,ppm)δ:7.15(2H,d,H-2,6),6.79(2H,d,H-3,5),3.75(1H,dd,H-2'),3.19,2.95(2H,dd,H-1')。¹³C-NMR(75MHz,DMSO-d₆,ppm)δ:181.4(C-3′),156.0(C-4),127.5(C-1),130.2(C-2,6),115.1(C-3,5),55.9(C-2′),42.9(C-1')。
得到化合物G192-C22，为白色粉末，UV吸收λ_max(CH₃CN)： 207nm。在正离子模式ESI-MS谱中，基于m/z[M+H]⁺为279.17和m/z[M+Na]⁺为301.14的分子离子峰，确定G192-C22的分子式为C₁₅H₂₂N₂O₃。通过NMR和MS鉴定G192-C22的结构为亮氨酰苯丙氨酸。
¹H-NMR(300和500MHz,CD₃OD/D₂O,ppm)δ:7.31-7.40(5H,m,H-2至H-5),3.71(1H,dd,H-2'),3.29,3.10(2H,dd,H-1'),3.96(1H,d,H-2''),1.75,1.66(2H,m,H-3''),1.74(1H,H-4''),0.98,0.97(6H,t,2x CH₃).¹³C-NMR(75MHz,CD₃OD/D₂O,ppm)δ:136.3(C-1),128.6(C-4),130.0(C-2,6),130.3(C-3,5),54.2(C-2′),37.5(C-1'),174.3(C-1'),175.8(C-1''),57.0(C-2''),40.9(C-3''),25.2(C-4''),21.9,23.0(2x CH₃)。
得到化合物G192-C23，为白色粉末，UV吸收λ_max(CH₃CN)：259.1和207.1nm。在正离子模式ESI-MS谱中，基于m/z[M+H]⁺为136.50的分子离子峰，确定G192-C23的分子式为C₅H₅N₅。通过NMR和MS鉴定G192-C23的结构为腺嘌呤。
¹H-NMR(300MHz,CD₃OD,ppm)δ:8.20,8.22(2H,s,H-2,8).¹³C-NMR(75MHz,CD₃OD,ppm)δ:155.9(C-6),153.0(C-2),151.8(C-4),142.1(C-8),117.8(C-5)。
得到化合物G192-C25，为黄色糊状物，UV吸收λ_max(CH₃CN)：274.5和206nm。在正离子模式HR-ESI-MS中，基于m/z[M+H]⁺305.1377和[M+Na]⁺327.1130的分子离子峰，确定G192-C25的分子式为C₁₂H₂₀N₂O₇。通过NMR和MS鉴定G192-C25的结构为2-(1,2,3,4-四羟基丁基)-6-(2,3,4-三羟基丁基)-吡嗪,2,6-脱氧果糖嗪。
¹H-NMR(300MHz,CD₃OD,ppm)δ:8.71(1H,s,H-5),8.53(1H,s,H-3),5.16(1H,s,H-1'),3.87(1H,m,H-2'),3.84(1H,m,H-3'),3.82,3.66(2H,m,H-4'),3.22,2.98(2H,m,H-1''),4.03(1H,m,H-2''),3.70(1H,m,H-3''),3.86,3.67(2H,m,H-4'')。¹³C-NMR(75MHz,CD₃OD,ppm)δ:157.0(C-2),156.2(C-6),145.1(C-5),147.0(C-3),74.0(C-1'),77.4(C-2'),74.3(C-3'),65.4(C-4'),40.5(C-1''),74.2(C-2''),76.3(C-3''),65.9(C-4'')。
得到化合物G192-C28，为白色粉末，(C2.36,MeOH/H₂O1:1)，UV吸收λ_max(CH₃CN)：253.2nm。在正离子模式HR-ESI-MS中，基于m/z[M+Na]⁺为320.0473和[M+K]⁺为336.2242的分子离子峰，确定 G192-C28的分子式为C₁₄H₁₉NO₆。通过1D和不同的2D NMR波谱（如COSY、HSQC、HMBC）和MS鉴定G192-C28的结构为N-(β-D-呋喃核糖-1-基)-苯丙氨酸，是新化合物。
¹H-NMR(300MHz,CD₃OD/D₂O,ppm)δ:7.29-7.39(5H,m,H-2至H-5),3.29,3.10(2H,dd,H-1'),3.84(1H,d,H-2''),5.85(1H,d,J=6Hz,H-1'),4.67(1H,H-2'),4.34(1H,m,H-3'),4.17(1H,H-4'),3.79,3.70(2H,dd,H-5')。¹³C-NMR(75MHz,CD₃OD,ppm)δ:136.3(C-1),130.3(C-3,5),130.0(C-2,6),128.6(C-4),57.1(C-2')37.5(C-1'),174.4(C-3'),89.2(C-1''),74.7(C-2''),71.7(C-3''),86.6(C-4''),62.6(C-5'')。
得到化合物G192-C29，为浅黄色糊状物，UV吸收λ_max(CH₃CN)：256.7和206nm。在正离子模式ESI-MS中，基于m/z[M+H]⁺为113.21的分子离子峰，确定G192-C29的分子式为C₄H₄N₂O₂。通过NMR和MS鉴定G192-C29的结构为尿嘧啶。
¹H-NMR(300MHz,CD₃OD,ppm)δ:7.41(1H,d,J=7.8Hz,H-4),5.61(1H,d,J=7.8Hz,H-5)。¹³C-NMR(75MHz,CD₃OD,ppm)δ:167.4(C-6),152.9(C-2),144.6(C-4),101.8(C-5)。
实施例9—3-O-(9,12-十八碳二烯酰基)-甘油基-β-D-吡喃半乳糖苷闭合成年人角质形成细胞的体外擦伤创伤
为了检查创伤-愈合效应，用人角质形成细胞孵育从RA的BU部位(图8A)分离的3-O-(9,12-十八碳二烯酰基)-甘油基-β-D-吡喃半乳糖苷(G192-C07)。如实施例1和5描述的进行擦伤测定。评估1、3、10和30μg/ml的G192-C07闭合体外创伤缺口的能力。分别使用表皮生长因子(EGF,10ng/mL)和0.1%DMSO作为阳性对照和溶媒对照。在刚刚擦伤之后和第4天采集创伤的照片。
如图8B所示，到第4天，1，3和10μM的G192-C07部分地闭合所述创伤缺口，而30μM的G192-C07和阳性对照表皮生长因子(EGF,10ng/mL)完全闭合了创伤。在整个测定中，用溶媒对照(DMSO)处理的擦伤创伤仍未闭合。
应当理解，本文描述的实施例和实施方案仅仅用于示例说明的目 的，本领域技术人员根据其可以提出各种改变或变化，并包括在本申请的精神和权限以及所附权利要求的范围之内。另外，本文公开的任何发明或其实施方案的任何要素或限制可以与本文公开的任何其它发明或其实施方案的任何其它要素或限制(分别或任意组合)组合，并且本发明范围内可以预期所有这样的组合，而不限于此。